蔡福玲，郭建軍，古欣瑤,2*

(1.貴州大學(xué) 昆蟲研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部貴陽作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

急流水螨科Torrenticolidae隸屬于蜱螨亞綱Acari，絨螨目Trombidiformes，寄殖螨股Parasitengonina，水螨亞股Hydrachnidiae，腺水螨總科Lebertioidea[1]。截至2020年12月，急流水螨科共計(jì)2亞科7屬11亞屬605種[2]。急流水螨科屬和亞屬主要分類特征一直存在較大爭(zhēng)議，不少水螨分類學(xué)者對(duì)急流水螨科進(jìn)行了分類研究并形成了不同的分類體系[3]。目前，急流水螨存在可用分類性狀較少，研究方法單一，分類進(jìn)程相對(duì)滯后等問題，導(dǎo)致急流水螨物種鑒定的可信度偏低，同物異名現(xiàn)象嚴(yán)重[4]。同時(shí)，由于水螨的常規(guī)保存液Koenike氏液中含有冰醋酸，致使分子數(shù)據(jù)提取極難，即分子生物技術(shù)在水螨分類的應(yīng)用中受樣本類型的限制[5]。因而，急需增加新的分類性狀及分類方法來進(jìn)行整合分類研究，進(jìn)而提高其分類鑒定的準(zhǔn)確性，完善其分類體系。而幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)就是一個(gè)很好的補(bǔ)充方法[6]。

幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)是將生物體形態(tài)信息轉(zhuǎn)化為數(shù)字信息[7]，以便對(duì)物體形態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的方法[8]，該方法能直觀準(zhǔn)確地展現(xiàn)不同生物體種間的微小形態(tài)差異[9]。目前幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)已被研究者廣泛應(yīng)用于物種分類和系統(tǒng)發(fā)育，如劉媛等[10]運(yùn)用幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)方法將兩個(gè)近緣種葉片形狀量化，揭示其親緣關(guān)系；陳楠樺等[11]運(yùn)用幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)方法進(jìn)行物種分類鑒定，研究4種濱螺的形態(tài)差異和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；鄧維安等[12]對(duì)蚱類昆蟲前胸背板進(jìn)行幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)分析，以前胸背板形態(tài)特征作為蚱類昆蟲的種間分類依據(jù)；也有學(xué)者將幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)應(yīng)用于水生動(dòng)物研究[13]，充分證實(shí)幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)的可行性，而在急流水螨類群中此方面的研究相對(duì)較少，僅Becerra和Valdecasas基于急流水螨腹板結(jié)構(gòu)位點(diǎn)初步探索了幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)在急流水螨分類研究中應(yīng)用的可行性[14]。

水螨各類群科級(jí)甚至屬級(jí)單元的腺毛分布體位十分穩(wěn)定，因此背腺毛對(duì)于研究水螨類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系具有重要意義[15]，然而在水螨分類研究中卻很少使用背腺毛。因此，本文選取急流水螨背腺毛腺孔位置形態(tài)作為研究對(duì)象，采用幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)的方法，對(duì)采集的急流水螨背板圖像進(jìn)行標(biāo)點(diǎn)轉(zhuǎn)化，將背腺毛腺孔位置形態(tài)信息轉(zhuǎn)換為數(shù)字信息，并利用主成分分析、典型變量分析、聚類分析等方法進(jìn)行相關(guān)分析，以明確急流水螨背腺毛腺孔位置的形態(tài)變異趨勢(shì)和屬間差異顯著性，探索幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)用于急流水螨分類研究的可行性及背腺毛作為分類性狀的可用性，以期為急流水螨乃至整個(gè)水螨類群的分類研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1數(shù)據(jù)來源

本研究所用數(shù)據(jù)材料來源于作者拍攝的標(biāo)本實(shí)物圖片、手繪特征圖以及從已發(fā)表的文獻(xiàn)中獲取的清晰背板特征圖，共計(jì)獲得2亞科7屬11亞屬59種129個(gè)急流水螨樣本，樣本信息詳見表1。

表1 急流水螨樣本信息Tab.1 The sample information of Torrenticolidae

續(xù)表1

續(xù)表1

1.1.2儀器設(shè)備

數(shù)碼顯微鏡成像系統(tǒng)(顯微鏡Nikon ECLIPSE Ni配置Nikon DS-Ri 2拍照系統(tǒng))(日本，尼康)。

1.1.3分析軟件

tpsUtil 1.62、tpsDig 2.31、tpsSmall 1.33、tpsSuper 2.05、MorphoJ 1.06d、ImageJ 1.48V、NTsys 2.10e、Adobe Photoshop CC2018。

1.2 研究方法

1.2.1圖像采集

對(duì)所研究標(biāo)本進(jìn)行解剖、鑒定后，將玻片置于數(shù)碼顯微鏡成像系統(tǒng)下，采集特征圖片，保存圖片為.jpg格式；同時(shí)通過查閱文獻(xiàn)，收集文獻(xiàn)中急流水螨的背腺毛腺孔位置形態(tài)(正面觀)的照片或手繪特征圖。將所有待研究圖片保存至同一文件夾內(nèi)即可完成圖像采集。

1.2.2圖像標(biāo)點(diǎn)

將文件夾中的.jpg格式圖片正確命名后，利用tpsUtil 1.62軟件，創(chuàng)建tps文件；將tps文件導(dǎo)入tpsDig 2.31軟件進(jìn)行圖像標(biāo)點(diǎn)。本研究對(duì)急流水螨4對(duì)背腺毛(D1、D2、D3、D4)腺孔進(jìn)行標(biāo)點(diǎn)(圖1)，所有圖片標(biāo)點(diǎn)順序保存一致即可。

圖1 背腺毛腺孔標(biāo)記圖Fig.1 Marking picture of dorsalglandular pore

1.2.3相關(guān)性檢驗(yàn)

利用tpsSmall 1.33軟件對(duì)樣本形態(tài)原始數(shù)據(jù)內(nèi)部相關(guān)性進(jìn)行檢驗(yàn)，通過該軟件，可獲取數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖，以及相關(guān)系數(shù)信息，初步判斷是否適合進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.4相關(guān)分析

使用MorphoJ 1.06d軟件，對(duì)急流水螨背腺毛腺孔位置的標(biāo)記點(diǎn)進(jìn)行疊印處理，獲取全部樣本4對(duì)背腺毛腺孔位置形態(tài)的疊印圖，并通過ImageJ 1.48V創(chuàng)建Outline文件；將標(biāo)點(diǎn)后的tps文件和Outline文件導(dǎo)入MorphoJ 1.06d軟件中進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis)，明確其腺孔位置形態(tài)特征的主成分及其變異趨勢(shì)；同時(shí)在PCA的基礎(chǔ)上，進(jìn)行典型變量分析(Canonical Variate Analysis)，以馬氏距離(Mahalanobis distance)來評(píng)估急流水螨屬間背腺毛腺孔位置形態(tài)差異的顯著程度。并運(yùn)用tps-Super 2.05軟件計(jì)算各樣本間普氏距離(Procrustes distance)，并基于普氏距離矩陣，通過軟件NTsys 2.10e，利用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。將分析結(jié)果輸出后，利用Adobe Photoshop CC2018進(jìn)行注解。

2 結(jié)果與分析

2.1 主成分分析

測(cè)試急流水螨背腺毛腺孔位置形態(tài)數(shù)據(jù)集轉(zhuǎn)換前后數(shù)據(jù)相關(guān)性系數(shù)為0.999997。經(jīng)過主成分分析，獲得12個(gè)主成分(各主成分變異量見表2)。前3個(gè)主成分PC1、PC2、PC3分別占總變異的49.765%、23.071%、15.005%，共占總變異的87.842%。用第1主成分(49.765%)作為橫坐標(biāo)，分別用第2主成分(23.071%)、第3主成分(15.005%)作為縱坐標(biāo)，獲得背腺毛腺孔位置變異的主成分散點(diǎn)圖(圖2；圖3)。

表2 急流水螨背腺毛腺孔位置差異主成分分析結(jié)果Tab.2 PCA of variation among the position change of dorsalglandular pore of Torrenticolidae

在PC1 vs PC2散點(diǎn)圖中，不同的圖形代表不同的屬，不同的點(diǎn)代表不同的樣本，具有相似背腺毛腺孔位置形態(tài)的樣本在圖中分布位置相對(duì)較近，即圖中聚合到一起的樣本點(diǎn)代表的背腺毛腺孔位置形態(tài)相似。圖2、圖3中，急流水螨分別沿PC1、PC2、PC3方向分布于坐標(biāo)(-0.2，0.2)范圍內(nèi)。其中，龜水螨亞科的龜水螨屬Testudacarus與貝氏急流水螨屬Debsacarus聚集在右上方，而急流水螨亞科的各屬聚集在散點(diǎn)圖中部靠左側(cè)。

圖2 急流水螨背腺毛腺孔位置形態(tài)變異的主成分分析散點(diǎn)圖(PC1 vs PC2)Fig.2 Scatter plots of the position change of dorsalglandular pore of Torrenticolidae(PC1 vs PC2)

圖3 急流水螨背腺毛腺孔位置變異的主成分分析散點(diǎn)圖(PC1 vs PC3)Fig.3 Scatter plots of the position change of dorsalglandular pore of Torrenticolidae (PC1 vs PC3)

將PC1、PC2、PC3主成分可視化后的具體情況如圖4所示。由圖4可知：PC1代表的是D2由靠近螨體外側(cè)向螨體中部移動(dòng)的變化；PC2代表的是D1由螨體內(nèi)側(cè)向螨體外側(cè)移動(dòng)的變化；PC3代表的是D4由螨體后部向螨體中部前移。同時(shí)，結(jié)合主成分分析的散點(diǎn)圖可知，龜水螨亞科的物種D2比急流水螨亞科的物種腺孔位置更靠近螨體中心，而D1反之，較急流水螨亞科物種更靠近外側(cè)。

圖4 急流水螨背腺毛腺孔位置變異模式：從左到右，對(duì)應(yīng)著相應(yīng)主成分軸上尺度-0.2和0.2的圖形Fig.4 Patterns of diversification in the position of dorsalglandular pore in Torrenticolidae:for each PC,the diagrams to the left and right show the shape for a score of -0.2 and 0.2 respectively

2.2 典型變量分析

對(duì)急流水螨7個(gè)屬的背腺毛腺孔位置進(jìn)行CVA分析，探討急流水螨屬間背腺毛腺孔位置形態(tài)差異的大小，其結(jié)果見圖5。

圖5 急流水螨7屬間背腺毛腺孔位置的典型變量分析散點(diǎn)圖(CV1 vs CV2)Fig.5 Scatter plots of the variations of dorsalglandular pore position among 7 genera of Torrenticolidae (CV1 vs CV2)

由圖5可知，龜水螨亞科的龜水螨屬Testudacarus與貝氏急流水螨屬Debsacarus聚集在坐標(biāo)的最右側(cè)，急流水螨亞科各屬聚集在左側(cè)。這與PCA結(jié)果相一致。因此，急流水螨的背腺毛腺孔著生的相對(duì)位置在亞科階元就具有明顯的差別。各屬間雖具有交叉現(xiàn)象，但仍具有明顯的聚集現(xiàn)象。

急流水螨科7屬間背腺毛腺孔位置的馬氏距離比較結(jié)果和馬氏距離P值(基于10 000次重復(fù))比較結(jié)果見表3、表4。

由表3可知，貝氏急流水螨屬Debsacarus(A)與冥急流水螨屬Stygotorrenticola(E)馬氏距離最大，表明兩者的背腺毛腺孔位置形態(tài)差異最大；新曲水螨屬Neoatractides(C)與擬急流水螨屬Pseudotorrenticola(D)馬氏距離最小，表明兩者的背腺毛腺孔位置形態(tài)差異最小。由表4可知，急流水螨科7屬間背腺毛腺孔位置馬氏距離P值兩兩比較均為P﹤0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上可知：急流水螨科7屬間背腺毛腺孔位置形態(tài)差異均顯著。

表3 急流水螨科7屬間背腺毛腺孔位置的馬氏距離比較(基于10 000次重復(fù))Tab.3 Comparison of the position change of dorsalglandular pore in 7 genera of Torrenticolidae based on the Mahalanobis distance (based on 10 000 permutation rounds)

表4 急流水螨7屬間背腺毛腺孔位置的馬氏距離顯著性比較(10 000次重復(fù))Tab.4 Position change of dorsalglandular pore in 7 genera of Torrenticolidae based on the Mahalanobis distance significant test (based on 10 000 permutation rounds)

2.3 聚類分析

根據(jù)各屬、各亞屬背腺毛腺孔位置的平均形態(tài)數(shù)據(jù)計(jì)算普氏距離，基于普氏距離矩陣，運(yùn)用UPGMA法構(gòu)建屬間背腺毛腺孔位置的表型樹(圖6)。

圖6 基于普氏距離的急流水螨科7屬間背腺毛腺孔位置的表型樹Fig.6 Phonetic tree of dorsalglandular pore position among 7 genera of Torrenticolidae based on Procrustes distance

由圖6可知，屬間背腺毛腺孔位置表型樹可分為兩大支：(1)急流水螨亞科各屬為1支，其中單曲跗螨屬M(fèi)onatractides與急流水螨屬Torrenticola距離最近，表明兩者背腺毛腺孔位置的結(jié)構(gòu)最為相似。(2)龜水螨亞科的龜水螨屬Testudacarus與貝氏急流水螨屬Debsacarus為1支，與形態(tài)學(xué)結(jié)果相一致。

綜合CVA散點(diǎn)圖、馬氏距離比較分析及聚類分析結(jié)果，初步明確了幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)的方法在急流水螨分類研究中應(yīng)用的可行性，同時(shí)可利用背腺毛腺孔位置特征對(duì)急流水螨高級(jí)階元進(jìn)行分類研究。

3 結(jié)論與討論

本研究通過幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)方法，對(duì)急流水螨2亞科7屬11亞屬59種129個(gè)急流水螨樣本進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果表明，急流水螨科7屬間背腺毛腺孔位置形態(tài)差異顯著。其中主成分分析結(jié)果表明急流水螨亞科和龜水螨亞科的背腺毛腺孔位置相對(duì)螨體中心的距離有區(qū)別，龜水螨亞科的物種D2比急流水螨亞科的物種腺孔位置更靠近螨體中心，而D1反之，較急流水螨亞科物種更靠近外側(cè)，即2亞科的背腺毛腺孔位置形態(tài)有差異，且D1和D2的位置特征起主要分類作用；典型變量分析可得急流水螨2亞科的腺孔位置形態(tài)差異顯著，與主成分分析結(jié)果吻合，且其屬間腺孔位置有明顯的聚集現(xiàn)象，比較分析其屬間腺孔位置的馬氏距離，結(jié)果表明急流水螨7屬間背腺毛腺孔位置形態(tài)差異均顯著；在聚類分析中，具有相似結(jié)構(gòu)特征的屬種聚集在一起，表明可通過聚類分析來判斷所分析的特征間的相似度及屬種間的親緣關(guān)系[41]。綜上可得：幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)可用于急流水螨的分類研究，且背腺毛腺孔位置形態(tài)特征可作為其屬級(jí)階元的分類依據(jù)。

關(guān)于急流水螨的幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)分析，僅有Becerra和Valdecasas基于急流水螨腹板結(jié)構(gòu)位點(diǎn)初步探索了幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)在急流水螨分類研究中應(yīng)用的可行性[14]。本研究也再次驗(yàn)證了這一結(jié)論，這與幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)在切葉蜂[42]、庫蠓[41]、癭螨[43]等類群的研究結(jié)果相一致。本研究雖取得了部分階段性成果，但也存在一定的不足之處：部分屬的樣本數(shù)量較少，代表性較弱，如：冥急流水螨屬Stygotorrenticola和貝氏急流水螨屬Debsacarus。但這是由于急流水螨科超過90%的已知種集中于急流水螨屬Torrenticola與單曲跗螨屬M(fèi)onatractides，存在較多的單種屬及單種亞屬的緣故；同時(shí)，部分屬物種由于建立時(shí)間過早，缺少清晰可用的特征圖，針對(duì)這部分屬物種，本研究已包含所有含雌雄兩性標(biāo)本的可利用樣本，共計(jì)2亞科7屬11亞屬59種129個(gè)急流水螨樣本，其中包括：急流水螨屬Torrenticola47個(gè)樣本、單曲跗螨屬M(fèi)onatractides31個(gè)樣本，寡種屬新曲水螨屬Neoatractides、擬急流水螨屬Pseudotorrenticola、龜水螨屬Testudacarus樣本數(shù)分別為23個(gè)、12個(gè)、12個(gè)，而單種屬冥急流水螨屬Stygotorrenticola和貝氏急流水螨屬Debsacarus各具有2個(gè)樣本。盡管本研究使用了所有可用的樣本，但其代表性仍然較弱，因而本文僅是利用幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)對(duì)急流水螨形態(tài)特征比較分析初步探索，在未來的研究中需要進(jìn)一步完善，以期為幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)在急流水螨分類工作中的應(yīng)用提供更為精準(zhǔn)的論據(jù)，促進(jìn)急流水螨乃至整個(gè)水螨分類的快速發(fā)展。