袁貴云，孫學(xué)廣

(1.貴州大學(xué) 貴州省森林資源與環(huán)境研究中心/貴州省高原山地林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza，簡(jiǎn)稱AM)真菌作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中分布最為廣泛的真菌類群之一，可以與超過(guò)80%的陸生植物建立互惠共生關(guān)系。AM真菌-植物共生體的形成可通過(guò)提高宿主植物對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，增強(qiáng)宿主植物對(duì)不良環(huán)境的耐受性來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

有研究發(fā)現(xiàn)，AM真菌可以直接或間接地調(diào)節(jié)宿主的代謝活動(dòng)。徐麗嬌等發(fā)現(xiàn)AM真菌-玉米共生體可以通過(guò)分泌物調(diào)控碳磷代謝相關(guān)基因的表達(dá),幫助玉米抵御低磷脅迫；李濤等發(fā)現(xiàn)AM真菌可以增加水孔蛋白基因表達(dá)，改善植物的水分代謝，增強(qiáng)植物的抗旱能力；于洋等研究發(fā)現(xiàn)不同AM真菌對(duì)宿主植物的次生代謝過(guò)程及其產(chǎn)物種類、含量的影響存在差異。然而，以往研究主要關(guān)注了AM真菌對(duì)宿主特定代謝物或代謝物類群的影響，有關(guān)AM真菌對(duì)宿主植物代謝組的整體調(diào)控仍缺乏認(rèn)知。

白三葉草()適應(yīng)性強(qiáng)，分布廣泛，是重要的牧草。已有研究表明接種AM真菌會(huì)通過(guò)增強(qiáng)宿主植物養(yǎng)分吸收能力、積累更多的代謝底物(如蔗糖)或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)促進(jìn)白三葉草生長(zhǎng)，但目前有關(guān)AM真菌對(duì)白三葉草代謝的影響還是未知的。基于此，本研究采用UPLC-MS/MS技術(shù)從代謝組角度研究AM真菌接種對(duì)白三葉草代謝物積累的影響，以期為AM真菌在白三葉草培育中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

叢枝菌根真菌菌劑：摩西管柄囊霉()(BGC NM01A)，以玉米為宿主擴(kuò)繁得到，孢子濃度為84個(gè)/g。白三葉草(海發(fā)Haifa)購(gòu)自百綠國(guó)際草業(yè)(北京)有限公司。

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將白三葉草種子置于濃硫酸(98%)中表面消毒10 min，隨后用無(wú)菌水沖洗3次。消毒過(guò)的種子置于濕濾紙上暗培養(yǎng)，出芽3 d后轉(zhuǎn)至裝有滅菌石英砂的花盆中培養(yǎng)(澆有Hoagland營(yíng)養(yǎng)液)，每盆1株，15 d后進(jìn)行接種處理。

設(shè)置接種(M)和不接種(NM)2個(gè)處理，接種處理植株每株接種5 g菌劑，不接種處理接種5 g滅菌(121 ℃，30 min)過(guò)的菌劑。每處理14株，其中5株用于生物量測(cè)定，其余植株用于代謝組分析(僅莖葉部分)及侵染率測(cè)定。

盆栽置于人工氣候箱中培養(yǎng)(光照/黑暗：14 h/10 h；光照強(qiáng)度12 000 lx；溫度25 ℃)，定期補(bǔ)水和霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液，90 d后收樣。

1.2 生物量及AM真菌侵染率測(cè)定

隨機(jī)選取5株白三葉草用于生物量測(cè)定。從根莖連接處將植株剪開，分別測(cè)定莖葉及根系鮮重，同時(shí)換算根莖比。隨后參照Koske等的方法將根系進(jìn)行透明、酸化及染色處理。侵染率測(cè)定方法參照Sun等的方法。

1.3 代謝組分析

分別剪取剩余植物的莖葉組織，每3株三葉草莖葉混為1個(gè)樣品(n=3)。

對(duì)樣品進(jìn)行真空冷凍干燥，隨后用球磨儀研磨至粉末狀，混勻后稱取100 mg粉末加入1.0 mL提取液(70%甲醇)，4 ℃過(guò)夜浸提。離心，取上清用微孔濾膜過(guò)濾后用于UPLC-MS/MS分析(交由邁維代謝分析)。

利用軟件 Analyst1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。基于邁維代謝自建數(shù)據(jù)庫(kù)MWDB及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)二級(jí)譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性。代謝物定量利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式分析完成。

根據(jù)(O)PLS-DA模型變量的變量權(quán)重值(variable importance for the projection,VIP)輔助篩選差異積累代謝物。代謝物在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中差異為2倍以上或0.5倍以下，同時(shí)VIP值≥1，則認(rèn)為差異顯著。利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行注釋及通路富集。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2019對(duì)侵染率及生物量數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用IBM SPSS statistics 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白三葉草菌根侵染情況及生物量

接種后3個(gè)月，摩西管柄囊霉與白三葉草根系形成了良好的共生關(guān)系，根系內(nèi)可見大量菌絲和叢枝結(jié)構(gòu)，未接種處理則無(wú)菌根形成(圖1)。接種摩西管柄囊霉促進(jìn)了白三葉草生長(zhǎng)，其根系和莖葉生物量均顯著高于未接種處理(<0.05)(表1)。但接種處理未顯著改變根莖比。

表1 白三葉草生物量Tab.1 Biomass of T. repens

注：a為接種處理；b為未接種處理；白色箭頭指示為叢枝結(jié)構(gòu)，標(biāo)尺=20μm；c為侵染率。圖1 摩西管柄囊霉對(duì)白三葉草根系的侵染情況Fig.1 Infestation of the root system of T. repens by F.mosseae

2.2 接種摩西管柄囊霉對(duì)白三葉草代謝的影響

采用UPLC-MS/MS技術(shù)共從白三葉草莖葉組織中鑒定到代謝物671種，分屬氨基酸及衍生物(81種)、苯丙素(46種)、醇類(15種)、多酚(7種)、酚胺(5種)、核苷酸及衍生物(53種)、花青素(23種)、黃酮(68種)、黃酮醇(31種)、黃酮類(23種)、黃烷酮(15種)、醌類(2種)、生物堿(29種)、糖類(19種)、萜類(22種)、維生素及衍生物(19種)、異黃酮(14種)、吲哚及衍生物(4種)、有機(jī)酸及衍生物(93種)、原花青素(1種)、甾體(5種)、脂質(zhì)(71種)、其他(25種)等類別，其中以花青素(24.94%)、有機(jī)酸及衍生物(19.98%)、脂質(zhì)(12.66%)、苯丙素(10.67%)的相對(duì)含量最高(圖2-a；此處相對(duì)含量值為所有樣品中對(duì)應(yīng)物質(zhì)相對(duì)含量的均值)。

圖2 不同接種處理下白三葉草莖葉組織代謝物組成(a)及差異代謝物數(shù)量(b)Fig.2 Metabolite composition (a) and differential metabolite quantity (b) in stem and leaf tissues of T. repens under different inoculation treatments

續(xù)表2

接種處理改變了白三葉草莖葉代謝物的積累。與未接種處理相比，接種AM真菌后共檢測(cè)到差異代謝物93種，其中52種上調(diào)，41種下調(diào)(圖2-b)。差異代謝物中以黃酮類及衍生物(包括黃酮類、黃酮、黃酮烷、黃酮醇和異黃酮)最多，共22種，且全部上調(diào)。下調(diào)代謝物則以脂質(zhì)(15種)和核苷酸及衍生物(10種)最多(表2)。KEGG注釋結(jié)果顯示，差異代謝物主要參與淀粉和蔗糖代謝、異黃酮生物合成、醛固酮合成及分泌、嘌呤代謝等生物學(xué)過(guò)程(圖3)。

表2 差異積累代謝物(M/NM)Tab.2 Differential accumulation of metabolites (M/NM)

圖3 差異代謝物KEGG富集結(jié)果Fig.3 KEGG enrichment results of differential metabolites

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，接種摩西管柄囊霉顯著促進(jìn)了白三葉草生長(zhǎng)，這與以往的研究結(jié)果相似。AM真菌對(duì)宿主植物的促生效應(yīng)可能與其能改善宿主植物的營(yíng)養(yǎng)狀況，增強(qiáng)宿主植物對(duì)P、N等養(yǎng)分的吸收效率有關(guān)。

已有研究表明，AM的形成可改變宿主代謝物的積累。賀學(xué)禮等研究發(fā)現(xiàn)在適宜的水肥條件下接種AM真菌會(huì)顯著提高丹參()植株的酮含量。韓冰洋等發(fā)現(xiàn)接種AM真菌對(duì)長(zhǎng)果頸黃芪()根系中的黃酮類和皂苷類成分含量有顯著影響，并指出接種AM真菌是一種能有效提高植物黃酮類成分含量的方法。Welling等、Kapoor等分別對(duì)AM真菌影響植物萜類化合物積累的機(jī)制進(jìn)行了綜述，進(jìn)一步論證了AM真菌-植物共生影響了植物中萜類化合物的生產(chǎn)，他們推測(cè)這些萜類化合物可能對(duì)植物生長(zhǎng)有重要作用。本研究同樣發(fā)現(xiàn)接種AM真菌后可增加代謝物的積累。本研究檢測(cè)到黃酮、異黃酮等52種上調(diào)表達(dá)的差異代謝物，其主要參與淀粉和蔗糖代謝、異黃酮生物合成等生理過(guò)程，可能在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、植物防御等方面起重要作用。

黃酮類及衍生物是一類植物根系重要的代謝產(chǎn)物，有研究發(fā)現(xiàn)其可作為菌根共生體建立過(guò)程中的信號(hào)物質(zhì)，對(duì)孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)、菌根真菌的侵染等有促進(jìn)作用。同時(shí)，該類物質(zhì)(特別是異黃酮類物質(zhì))是衡量牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)接種AM真菌后的白三葉草會(huì)積累更多的黃酮類及衍生物(含異黃酮)，表明AM真菌可提高白三葉草的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

有機(jī)酸是植物常見的次生代謝物種類，其可以經(jīng)酸化、螯合、離子交換或還原等途徑將根系難溶性養(yǎng)分轉(zhuǎn)化成易被植物吸收的有效成分，如難溶性磷，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育。本研究中有機(jī)酸及衍生物(19.98%)相對(duì)含量較高，僅次于花青素(24.94%)，且其上調(diào)比例高于下調(diào)比例，表明接種AM真菌可能提高了白三葉草對(duì)土壤中難以吸收的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的獲取能力。

維生素及衍生物在植物體的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。已有研究證實(shí)核黃素(Riboflavin，VB)等在促進(jìn)植物體生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物的生物合成等方面有重要作用，本研究中觀測(cè)到的AM真菌對(duì)白三葉草的促生效應(yīng)可能與核黃素等差異代謝物質(zhì)積累增加有關(guān)。另外，核黃素及其衍生物(如FMN和FAD)是植物光合作用、能量生成和氧化還原代謝過(guò)程中必不可少的組成部分，韓金龍等發(fā)現(xiàn)杜梨()葉片的抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量增加，主要與核黃素參與的活性氧代謝相關(guān)。本研究中檢測(cè)到的核黃素處于上調(diào)表達(dá)，表明接種AM真菌可能會(huì)增強(qiáng)白三葉草體內(nèi)的抗氧化酶活性并促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)AM真菌可促進(jìn)白三葉草生長(zhǎng)并可調(diào)節(jié)其代謝，接種后白三葉草積累了更多的黃酮類、維生素及衍生物等具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的代謝物，這對(duì)后續(xù)牧草生產(chǎn)中施用AM真菌來(lái)增產(chǎn)增效有重要指導(dǎo)意義。