龍水文 賈育松 李晉玉 孫悅禮 鄭晨穎 白春曉 張 帆 劉楚吟 邸學(xué)士 袁巧妹 冉 宇 陳 江 王擁軍

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院骨傷科，北京,100700)

腰椎間盤突出癥(Lumbar Disc Herniation，LDH)是臨床常見的腰椎退行性疾病，其發(fā)病與椎間盤纖維環(huán)破裂、髓核突出刺激壓迫神經(jīng)根密切相關(guān)，臨床多表現(xiàn)為腰痛、下肢放射痛及感覺異常[1]。腰椎間盤突出癥屬于中醫(yī)學(xué)“腰腿病”“痹癥”范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其發(fā)病與腰部勞損扭挫、風(fēng)寒濕邪侵襲等因素相關(guān)，其病機(jī)在于肝腎不足，或有勞損外傷，或感受外邪，以致經(jīng)脈痹阻、氣血運(yùn)行不暢，不通則痛，痛有定處。

身痛逐瘀湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯》，具有活血祛瘀，祛風(fēng)除濕，通痹止痛的功效，身痛逐瘀湯治療LDH具有良好療效，能有效改善患者疼痛麻木癥狀，提高生命質(zhì)量[2]；但對于身痛逐瘀湯治療LDH的作用機(jī)制研究尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)方法分析藥物和疾病靶點(diǎn)之間協(xié)同作用關(guān)系的藥理學(xué)分支學(xué)科，為研究中藥復(fù)方復(fù)雜藥效協(xié)同作用機(jī)制提供了新策略[3-4]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，挖掘身痛逐瘀湯治療LDH的潛在有效成分、作用靶點(diǎn)及相關(guān)分子作用機(jī)制，為后期的深入研究提供方向。

1 資料與方法

1.1 身痛逐瘀湯中藥化學(xué)活性成分篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)[5]，查找身痛逐瘀湯中川芎、當(dāng)歸、紅花、沒藥、牛膝、羌活、秦艽、桃仁、香附9味藥的化學(xué)成分，因地龍未收錄于TCMSP，通過化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp)對其進(jìn)行檢索補(bǔ)充；方中甘草為使藥，即調(diào)和藥，主要作用為緩和諸藥藥性，其用量小，故對其化學(xué)成分不作篩選。依據(jù)中藥的藥代動力學(xué)ADME即吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代謝(Metabolism)及排泄(Excretion)過程，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%，與類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18為篩選條件，選取出中藥活性成分。

1.2 身痛逐瘀湯中藥活性成分靶點(diǎn)預(yù)測 通過以上數(shù)據(jù)庫檢索獲取各味中藥活性成分的CAS編號，利用有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(pubchem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)對所檢索出的CAS編號進(jìn)行搜索得到活性成分的2D分子結(jié)構(gòu)文件，將2D分子結(jié)構(gòu)文件分別導(dǎo)入SwissTargetPrediction平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/)，實(shí)現(xiàn)活性成分靶點(diǎn)預(yù)測[6]，并篩選“Probability值>0”的結(jié)果作為最終預(yù)測靶點(diǎn)。

1.3 LDH疾病靶點(diǎn)獲取及身痛逐瘀湯治療LDH潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測 在人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)、DisGeNET3個疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫輸入疾病名稱“l(fā)umbar disc herniation”進(jìn)行檢索[7]，將篩選結(jié)果匯總，去除重復(fù)值保留唯一值，即獲得疾病LDH靶點(diǎn)集。將疾病LDH靶點(diǎn)集與上述身痛逐瘀湯的中藥作用靶點(diǎn)取交集，即得到身痛逐瘀湯治療LDH的潛在作用靶點(diǎn)。

通過SwissTargetPrediction平臺，對篩選出的178個活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，剔除其中無對應(yīng)靶標(biāo)的活性成分，對剩余121個活性成分預(yù)測并篩選Probability值>0的靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果。

1.4 中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將中藥、活性成分、交集靶點(diǎn)信息整理至Excel表格，并將其導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，對中藥、活性成分、交集靶點(diǎn)關(guān)系進(jìn)行可視化分析，探究身痛逐瘀湯治療LDH活性成分的重要性及相關(guān)分子作用機(jī)制。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將身痛逐瘀湯治療LDH的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，Organism設(shè)置為“Homo sapiens”，將置信度得分設(shè)置為“high confidence≥0.7”，隱藏孤立于網(wǎng)絡(luò)之外的節(jié)點(diǎn)，進(jìn)而獲取身痛逐瘀湯治療LDH潛在作用靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)，下載保存其TSV格式文件，導(dǎo)入Cytoscape軟件，通過Cytoscape軟件內(nèi)置的網(wǎng)絡(luò)分析插件，對其網(wǎng)絡(luò)樣式進(jìn)行設(shè)置，并繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，節(jié)點(diǎn)(Node)的大小和漸變顏色反映Degree值的大小。

1.6 基因本體富集分析和京都基因和基因組百科全書富集分析 通過上述PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析獲得身痛逐瘀湯治療LDH的關(guān)鍵靶點(diǎn)，將其導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，物種及背景設(shè)置為“Homo sapiens”，分別進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析及京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，篩選排名靠前的基因功能及通路繪制出直觀的柱狀圖與氣泡圖。

1.7 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.7.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人髓核細(xì)胞(Sciencell公司，美國，貨號：4800)。

1.7.2 藥物 所需藥材由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥房提供，包括：秦艽3 g、川芎6 g、桃仁9 g、紅花9 g、甘草6 g、羌活3 g、沒藥6 g、當(dāng)歸9 g、香附3 g、牛膝9 g、地龍6 g。根據(jù)體表面積法確定給藥劑量，選用大耳兔制備中藥含藥血清，課題前期研究利用噻唑藍(lán)溴化四唑(MTT)比色法篩選出身痛逐瘀湯含藥血清最佳的給藥濃度為15%，干預(yù)時間為24 h。

1.7.3 主要試劑與儀器 高效放射免疫沉淀法(Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA)組織/細(xì)胞裂解液(Thermo公司，美國，貨號：89900)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒(Beyotime公司，貨號：C1063)；胎牛血清(Sciencell公司，美國，貨號：0010)；胰酶/乙二胺四乙酸(Ethylene Diaminetetraacetic Acid，EDTA)(Sciencell公司，美國，貨號：0103)；兔核因子κB p65多克隆抗體(Abcam公司，英國，貨號：ab16502)；兔基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)-13多克隆抗體(Abcam公司，英國，貨號：ab39012)；兔胱天蛋白酶-3多克隆抗體(Abcam公司，英國，貨號：ab13847)；兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenas，GAPDH)單克隆抗體(Abcam公司，英國，貨號：ab181602)。流式細(xì)胞儀(Beckmam，美國，型號：Cytomics FC500)；發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(SYNGENE，英國，型號：GeneGnome XRQ)；蛋白電泳儀(Bio-rad，美國，型號：PowerPac)；全自動酶標(biāo)儀(BioTek，美國，型號：Synergy H1)；醫(yī)用恒溫靜水壓壓力罐(柳根哲教授設(shè)計，專利號：ZL201520108857.5)。

1.7.4 分組與造模 本研究分為2組，即單純壓力組和經(jīng)身痛逐瘀湯血清干預(yù)的中藥組。實(shí)驗(yàn)采用10 mL注射器為實(shí)驗(yàn)容器，將3代髓核細(xì)胞鋪片，與培養(yǎng)基共同裝入其中，密封注射器的頭部保持密閉性；將注射器放置于壓力罐中，分別作用2 h、4 h、6 h。將人髓核細(xì)胞復(fù)蘇后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，根據(jù)前期課題組研究結(jié)果選取第3代髓核細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將髓核細(xì)胞放入醫(yī)用恒溫靜水壓壓力罐，設(shè)置1 MPa壓力進(jìn)行造模。

1.7.5 細(xì)胞凋亡檢測 使用Annexin V-FITC/Propidium Iodide凋亡試劑盒進(jìn)行雙染檢測：1)洗滌、胰酶消化貼壁細(xì)胞，收集靜水壓作用后的髓核細(xì)胞，以1 000 r/min，離心半徑10 cm，離心5 min，吸去上清。2)加入磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate Buffer Saline，PBS)0.5 mL重懸細(xì)胞；計數(shù)選取10萬重懸細(xì)胞，離心后棄上清。3)195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液浸潤重新重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)濃度。4)加入5 μL Annexin V-FITC混勻，20～25 ℃室溫下避光孵育10 min。5)可重復(fù)操作重懸細(xì)胞，加入10 μL碘化丙啶染色(Propidium Iodide，PI)混勻，避光孵育后上機(jī)檢測。

1.7.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測 樣本離心后棄上清，潤洗2次后加入RIPA裂解液，置于冰上裂解，之后以16 000×g,離心10 min；吸取上清進(jìn)行含量測定；采用二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)法測定樣本濃度后，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜及顯影，將樣本加入樣孔中，按照濃縮膠80 V/分離膠120 V恒壓電泳，將凝膠半干轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉，封閉1 h后清洗3次；加入稀釋好的一抗4 ℃孵育過夜。次日洗膜3次，加入二抗孵育，2 h后加入洗滌緩沖液(Tris Buffered Saline Tween，TBST)清洗，應(yīng)用顯影儀對膜進(jìn)行顯影成像。

2 結(jié)果

2.1 身痛逐瘀湯中藥化學(xué)成分篩選結(jié)果 共得到178個符合條件的活性成分，剔除其中無對應(yīng)靶標(biāo)的活性成分，最終得到121個活性成分，其中川芎4個、當(dāng)歸2個、地龍17個、紅花19個、沒藥20個、牛膝14個、羌活10個、秦艽2個、桃仁18個、香附15個。

2.2 身痛逐瘀湯作用靶點(diǎn)預(yù)測及其治療LDH潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測 共獲得871個身痛逐瘀湯活性成分作用靶點(diǎn)，獲得438個LDH疾病相關(guān)靶點(diǎn)。身痛逐瘀湯治療LDH的交集靶點(diǎn)75個。見圖1。

圖1 身痛逐瘀湯與LDH疾病靶點(diǎn)匹配韋恩圖

2.3 中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)由175個節(jié)點(diǎn)、921條邊組成，以Degree值大小進(jìn)行排序，其中β-谷固醇(Beta-sitosterol)、槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、豆甾醇(Stigmasterol)、木犀草素(Luteolin)、黃芩素(Baicalein)排名靠前，說明其在身痛逐瘀湯治療LDH過程中發(fā)揮重要作用。見圖2。

圖2 中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 身痛逐瘀湯治療LDH關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 獲取滿足篩選條件的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)69個。PPI網(wǎng)絡(luò)中有69個節(jié)點(diǎn)，447條邊，節(jié)點(diǎn)平均Degree值為13.0，其中STAT3、IL6、VEGFA、MAPK1、TP53、MMP9、AKT1、JUN、TNF、HRAS、MMP13等排列靠前。見圖3。

圖3 身痛逐瘀湯治療LDH關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO富集分析及KEGG通路分析結(jié)果 GO分析中得到生物過程(Biological Process，BP)相關(guān)條目366條，其中包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(Positive Regulation of Transcription from RNA Polymerase Ⅱ Promoter)、細(xì)胞增殖的正調(diào)控(Positive Regulation of Cell Proliferation)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal Transduction)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控(Negative Regulation of Apoptotic Process)等；分子功能(Molecular Function，MF)相關(guān)條目66條，其中涉及蛋白質(zhì)結(jié)合(Protein Binding)、ATP結(jié)合(ATP Binding)、同種蛋白質(zhì)結(jié)合(Identical Protein Binding)、鋅離子結(jié)合(Zinc Ion Binding)、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性(Serine-type Endopeptidase Activity)等分子功能；細(xì)胞組分(Cell Component，CC)相關(guān)條目43條，包括質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)溶膠、胞外區(qū)等。見圖4。

圖4 GO富集分析BP、CC、MF結(jié)果

KEGG信號通路富集結(jié)果顯示，身痛逐瘀湯治療LDH涉及的信號通路150余條，篩選身痛逐瘀湯治療LDH關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的主要相關(guān)信號通路，包括：癌癥通路、促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK)信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-3-kinase-protein Kinase B，PI3K/AKT)信號通路、核因子κB信號通路、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)信號通路、叉頭框O(Forkhead Box O，F(xiàn)oxO)信號通路等。見圖5。

圖5 KEGG通路富集分析結(jié)果

2.6 細(xì)胞凋亡檢測 隨著靜水壓作用時間的增加，2組細(xì)胞的凋亡率增高；與單純壓力組比較，中藥組凋亡率明顯有所下降(P<0.05)。見圖6。

圖6 髓核細(xì)胞凋亡情況

2.7 核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)情況 在1 MPa壓力作用下，單純壓力組核因子κB p65蛋白水平在4 h時明顯增加，之后蛋白表達(dá)量明顯下降，而MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)水平隨時間增加而上升。在同一作用時間下，中藥組核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3的蛋白表達(dá)水平明顯低于單純壓力組(P<0.05)。經(jīng)身痛逐瘀湯含藥血清干預(yù)后核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白的表達(dá)受到抑制。見圖7。

圖7 核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)情況

3 討論

身痛逐瘀湯源自《醫(yī)林改錯》，是古代經(jīng)典名方之一，易騰達(dá)等[8]學(xué)者在原方基礎(chǔ)上剔除五靈脂(因該藥自1990年后未收入《中華人民共和國藥典》)，建議身痛逐瘀湯臨床組方如下：秦艽、川芎、桃仁、紅花、甘草、羌活、沒藥、當(dāng)歸、香附、牛膝、地龍；身痛逐瘀湯全方共奏活血祛瘀、祛風(fēng)除濕、通痹止痛之功。該方在骨科領(lǐng)域運(yùn)用廣泛，對治療LDH具有良好療效。LDH的發(fā)病與椎間盤退變密切相關(guān)，有研究表明力學(xué)載荷、細(xì)胞凋亡和炎癥介質(zhì)等是促使椎間盤退變的主要危險因素[9]?，F(xiàn)代相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，該方藥理作用廣泛，不僅具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，還有營養(yǎng)保護(hù)神經(jīng)，降低骨骼肌微損傷，延緩椎間盤退變等作用，身痛逐瘀湯可能通過多種作用途徑治療LDH[10-11]。

本網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中，根據(jù)中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，β-谷固醇(Beta-sitosterol)、槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、豆甾醇(Stigmasterol)、木犀草素(Luteolin)、黃芩素(Baicalein)度值較高，說明其在治療LDH過程中可能發(fā)揮重要作用。在對身痛逐瘀湯藥物活性成分的篩選中，可以發(fā)現(xiàn)上述活性成分廣泛分布于身痛逐瘀湯的多味藥物中，其中β-谷固醇存在于當(dāng)歸、紅花、沒藥、羌活、秦艽、香附、牛膝、桃仁中，研究顯示，β-谷固醇具有的抗炎作用明確，其可通過調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞功能來抑制促炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生進(jìn)而改善類風(fēng)濕炎癥[12]；通過抑制核因子κB的活化來減輕右旋糖酐硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[13]；通過抑制p38、胞外信號調(diào)節(jié)激酶和核因子κB通路，降低白細(xì)胞介素6(Interleukin，IL-6)、TNF-α等相關(guān)炎癥介質(zhì)來影響小膠質(zhì)細(xì)胞活性、抑制神經(jīng)炎癥從而延緩神經(jīng)退變[14]。相關(guān)研究表明炎癥反應(yīng)已被認(rèn)為是LDH椎間盤退變的主要因素，巨噬細(xì)胞是椎間盤突出吸收過程中的重要免疫參與者，β-谷固醇可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞功能及抑制相關(guān)炎癥信號通路對關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎及神經(jīng)炎癥等發(fā)揮良好的抗炎作用[15-16]，其在治療LDH椎間盤退變過程中也可能發(fā)揮重要作用，目前尚未報道β-谷固醇是否對椎間盤退變相關(guān)炎癥介質(zhì)發(fā)揮抗炎作用，這為日后的研究提供新方向。

槲皮素存在于紅花、沒藥、牛膝、香附中，其可抑制IL-1β誘導(dǎo)的核因子κB途徑級聯(lián)反應(yīng)的激活，通過核因子E2相關(guān)因子2/核因子κB軸改善椎間盤退變[17]。山柰酚、黃芩素存在于紅花、牛膝中，其中山柰酚不僅能調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，減緩細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)細(xì)胞活力，還能減少促炎癥介質(zhì)IL-6、增加抗炎細(xì)胞因子IL-10的水平發(fā)揮其抗炎作用從而延緩LDH椎間盤退變[18]。黃芩素可抑制核因子κB和MAPK信號通路的激活，其主要通過以下方面延緩椎間盤退變：一是通過抑制相關(guān)炎癥介質(zhì)的表達(dá)來參與炎癥反應(yīng)[19]，二是通過參與力學(xué)載荷，抑制壓力誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞的凋亡，延緩椎間盤退變的進(jìn)程[20]。山柰酚和黃芩素作為LDH椎間盤退變的潛在治療劑具有巨大研究價值。

PPI網(wǎng)絡(luò)中，分析69個關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的相互作用關(guān)系，其中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal Transduction and Activator of Transcription，STAT)3是STAT成員之一，在腰椎間盤髓核突出引起的持續(xù)疼痛大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)STAT3通過上調(diào)脊髓趨化因子C-X-C基序配體12的表達(dá)介導(dǎo)腰椎間盤髓核突出引起的機(jī)械痛敏，抑制STAT3的活化顯著緩解腰椎間盤突出誘導(dǎo)的持續(xù)疼痛[21]；IL-6是一種炎癥介質(zhì)，在椎間盤髓核中檢測細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的IL-6，腰椎間盤突出組IL-6表達(dá)顯著升高。IL-6基因過表達(dá)是椎間盤退變的重要危險因素[22]，IL-6水平增高可引起LDH持續(xù)性腰椎神經(jīng)根痛癥狀[23]，研究表明通過IL6/STAT3通路可調(diào)節(jié)腰椎間盤退變的發(fā)生[24]。調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)A的表達(dá)可改善椎間盤的營養(yǎng)供應(yīng)進(jìn)而延緩椎間盤退變[25]，腫瘤蛋白P53也稱P53，屬于人體抑癌基因的一種，VEGF與P53可在椎間盤組織中協(xié)同表達(dá)，共同參與血管形成和浸潤，并加速椎間盤組織變性[26]。MAPK1又叫胞外信號調(diào)節(jié)激酶2，通過參與MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路控制髓核細(xì)胞凋亡，為椎間盤退變過程中的重要基因[27]。MMP9、MMP13是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，研究發(fā)現(xiàn)，MMP9在miR-133a的下調(diào)靶向作用下可誘導(dǎo)Ⅱ型膠原蛋白丟失，進(jìn)而影響椎間盤退變[28]。Jun為活化蛋白-1轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)c-Jun通過上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖并減少細(xì)胞凋亡，通過降低TNF-α，IL-1β，IL-6的表達(dá)來抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而延緩椎間盤退變[29]。TNF基因家族中，TNF-α屬于其中一員，其通過核因子κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腰椎間盤突出的病理生理過程中發(fā)揮重要作用[30]。通過GO富集分析可推測，這些關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白主要在質(zhì)膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等位置發(fā)揮作用，并通過細(xì)胞增殖的正調(diào)控、凋亡的負(fù)調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程，發(fā)揮激酶活性、與蛋白質(zhì)結(jié)合等分子功能。

KEGG信號通路富集分析中，MAPK、PI3K-AKT、TNF以及核因子κB信號通路可能為身痛逐瘀湯治療LDH的關(guān)鍵信號通路。其中，MAPK信號通路主要存在胞外信號調(diào)節(jié)激酶、JUK及p38MAPK 3種經(jīng)典信號通路，與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞生長分化密切相關(guān)，綜合MAPK信號通路相關(guān)研究報道，其可能通過以下幾個方面來延緩LDH的椎間盤退變：1)抑制炎癥反應(yīng)：有研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與椎間盤退變的微環(huán)境相關(guān)[31]，其可通過p38 MAPK信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)IL-6的釋放，降低椎間盤退變微環(huán)境的惡化，進(jìn)而延緩椎間盤退變；Ge等[32]研究發(fā)現(xiàn)外源性IL-10治療可誘導(dǎo)抗炎反應(yīng)并抑制p38 MAPK活化，可減輕髓核細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞外基質(zhì)變性，從而延遲椎間盤變性。2)介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的合成、分解代謝：細(xì)胞外基質(zhì)的合成分解代謝失衡是軟骨細(xì)胞和椎間盤髓核細(xì)胞變性的關(guān)鍵影響因素，有研究發(fā)現(xiàn)白血病抑制因子能促進(jìn)聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原α1的表達(dá)，其可通過激活MAPK-ERK1/2信號通路促進(jìn)髓核細(xì)胞外基質(zhì)的合成，起到延緩椎間盤退變的作用[33-34]。3)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡、自噬作用：據(jù)報道機(jī)械負(fù)荷與糖尿病是椎間盤退變的危險因素，機(jī)械生長因子可降低胱天蛋白酶3活性，下調(diào)Bax基因/蛋白表達(dá)，而增高機(jī)械性超負(fù)荷條件下Bcl-2基因/蛋白質(zhì)表達(dá)，其通過調(diào)節(jié)p38 MAPK通路來減輕機(jī)械性超負(fù)荷誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞的凋亡[35]；Shan等[36]通過高糖對大鼠椎間盤纖維環(huán)(Annulus Fibrosus，AF)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高葡萄糖通過以葡萄糖濃度依賴性方式調(diào)節(jié)JNK信號通路和p38 MAPK信號通路來促進(jìn)椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡；也有研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3可以通過靶向胞外信號調(diào)節(jié)激酶/MAPK信號通路來抑制髓核細(xì)胞的遷移和侵襲[37]，該過程與細(xì)胞增殖、凋亡、自噬和細(xì)胞衰老密切相關(guān)。PI3K/AKT信號通路在身痛逐瘀湯治療LDH過程中也可能發(fā)揮重要作用，有研究表明通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路，可減少髓核細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促進(jìn)增殖并降低細(xì)胞凋亡和炎癥水平，從而緩解椎間盤退變，其作用機(jī)制與MAPK信號通路具有相通之處[38-40]。在對LDH椎間盤退變的研究中，核因子κB對椎間盤退變的作用機(jī)制包括調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的代謝平衡、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[41]。有研究報道機(jī)械應(yīng)力刺激通過激活核因子κB信號通路直接誘導(dǎo)基質(zhì)降解酶，從而加速髓核細(xì)胞外基質(zhì)的分解代謝水平，促進(jìn)髓核細(xì)胞變性[42-43]；Gao等[44]發(fā)現(xiàn)柚皮苷通過下調(diào)核因子κB通路和p53表達(dá)來減輕炎癥反應(yīng)及減弱基質(zhì)金屬蛋白酶分解代謝，從而降低髓核細(xì)胞凋亡。

本研究中，在加壓環(huán)境下，隨著時間的增加，單純壓力組髓核細(xì)胞凋亡率隨著作用時間也不斷增高；相對于單純壓力組，在同一作用時間下，經(jīng)身痛逐瘀湯中藥血清干預(yù)后的中藥組髓核細(xì)胞凋亡率更低，說明身痛逐瘀湯中藥血清可降低髓核細(xì)胞凋亡率。蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白顯示，在同一作用時間下，中藥組核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3的蛋白表達(dá)水平明顯低于單純壓力組，說明經(jīng)身痛逐瘀湯含藥血清干預(yù)后核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白的表達(dá)受到抑制，身痛逐瘀湯可能通過抑制核因子κB信號通路，抑制MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白的表達(dá)來減少髓核細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而延緩椎間盤退變。

綜上所述，LDH發(fā)病機(jī)制錯綜復(fù)雜，身痛逐瘀湯通過多種活性成分作用于多個相關(guān)基因靶點(diǎn)，并通過多種信號通路來治療LDH，這體現(xiàn)了身痛逐瘀湯治療LDH具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，其可能通過抑制炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)合成分解代謝及誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡、自噬作用等作用通路來發(fā)揮治療LDH的作用，這為身痛逐瘀湯治療LDH的基礎(chǔ)和臨床研究提供新的方向。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對中藥復(fù)方作用機(jī)制的研究存在本身的局限性[45]，不能全面地分析身痛逐瘀湯所有成分、作用靶點(diǎn)及通路，今后還需要更深入地挖掘及通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。