付雙楠 高達(dá) 郭佳佳 苗明三 朱平生 宮嫚

急性肝損傷(Acute liver injury, ALI)是一種常見的肝臟疾病，由不同的致病因素引起，包括病毒感染、酒精攝入、藥物和化學(xué)毒物等，導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎癥、肝細(xì)胞壞死和凋亡等多種病理改變[1]，嚴(yán)重或持續(xù)性損傷會導(dǎo)致肝衰竭、肝硬化甚至肝癌。全球每年約有200萬人死于肝病，肝硬化目前是全球第11位最常見的死因，肝癌是第 16 位最常見的死因，二者共占全球所有死亡人數(shù)的3.5%[2]。四氯化碳(Carbon tetrachloride, CCL4)所致肝損傷模型是常用的急性肝損傷模型，有研究表明，經(jīng)腹腔注射濃度為0.1% CCL4溶液即可引起ALI[3]，但對最佳染毒時(shí)間尚無明確標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過對小鼠單次腹腔注射0.1% 濃度的CCL4橄欖油溶液制備急性肝損傷模型并檢測生化水平，探索最佳染毒時(shí)間，以確定穩(wěn)定的小鼠急性肝損傷模型，同時(shí)聯(lián)合聯(lián)苯雙酯灌胃，為下一步臨床治療及保肝藥物等研究提供參考依據(jù)。

資料與方法

一、動(dòng)物

昆明系(KM)小鼠，SPF級，雌雄各半，18～22 g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯) 20140007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK(豫) 2015-0005。實(shí)驗(yàn)期間自由飲水、攝食。本實(shí)驗(yàn)獲得河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)。

二、 試劑

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT) 試劑盒(批號：D1507053，上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司)；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶( AST) 試劑盒(批號：D1507073，上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司)。聯(lián)苯雙酯(批號：020141140，萬邦德制藥集團(tuán)股份有限公司)。CCL4(批號：20151002，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；橄欖油(批號：H08J6P1314，上海源葉生物科技有限公司)。

三、儀器設(shè)備

日本奧林巴斯AU400全自動(dòng)生化分析儀，日本奧林巴斯公司；Cytation3細(xì)胞成像酶標(biāo)儀，美國伯騰公司；GL-16G臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；YP1201N 型電子天平[舜宇恒平( 上海) 科學(xué)儀器有限公司]；可調(diào)式移液槍，上海雷勃分析儀器有限公司；Leica DMI4000B智能型倒置熒光顯微鏡，德國徠卡( Leica) 儀器有限公司。

四、方法

(一)0.1%CCL4建模后不同時(shí)間點(diǎn)的ALT、AST變化及聯(lián)苯雙酯的保護(hù)作用 KM小鼠96只，SPF級，體質(zhì)量范圍在18～22 g，雌雄各半，隨機(jī)分為12組，即3、6、12和24 h，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的空白對照組、模型組以及聯(lián)苯雙酯組。所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，期間自由飲水、攝食，第8天開始聯(lián)苯雙酯組以5.625 mg/kg灌胃，空白對照組及模型組灌胃等劑量蒸餾水，每天1次，連續(xù)灌胃7 d；第15天腹腔注射0.1%濃度CCL4橄欖油溶液制備急性肝損傷模型，分別于造模后3、6、12和24 h后處理各組動(dòng)物，以10%水合氯醛按0.03 mL/10 g麻醉動(dòng)物，摘眼球取血，4 ℃，4 000 r/min離心15 min，取血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測各組生化指標(biāo)ALT及AST。

(二)0.1%CCL4建模后不同時(shí)間點(diǎn)的肝臟指數(shù)變化 將麻醉后的各組動(dòng)物收集完血清后，摘取肝臟，置于錫箔紙上稱量肝臟體質(zhì)量，并計(jì)算肝臟指數(shù)。計(jì)算公式：肝濕重/鼠重×100%。

(三)0.1%CCL4建模后不同時(shí)間點(diǎn)的肝組織病理變化 取肝左中葉一小塊組織，用10%甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片和脫蠟后常規(guī)HE染色，光鏡下進(jìn)行肝組織病理學(xué)檢查。

五、統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，多組間比較采用單因素方差法，方差不齊時(shí)用Dunnett’s方法分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、0.1%CCL4建模后不同時(shí)間點(diǎn)ALT、AST的變化

與空白組比較，3、6、12和24 h模型組ALT、AST數(shù)值升高(P<0.01)；與模型組相比，3、6、12、24 h聯(lián)苯雙酯組ALT、AST數(shù)值均有降低(P<0.01)。見表1。

表1 0.1%CCL4建模后不同時(shí)間點(diǎn)對ALT、AST的影響(s，n=8)

二、 0.1%CCL4建模后不同時(shí)間點(diǎn)的肝臟指數(shù)變化

與空白對照組比較，模型制備成功后3、6、12和24 h模型組肝臟指數(shù)升高(P<0.01)，隨著建模時(shí)間增加，肝臟指數(shù)逐漸升高，體質(zhì)量呈下降趨勢，其中小鼠體質(zhì)量在12和24 h變化顯著(P<0.05)。與模型組比較，隨著建模時(shí)間增加，聯(lián)苯雙酯組肝臟指數(shù)均下降，6、12和24 h肝臟指數(shù)下降明顯(P<0.01)。見表2。

表2 0.1%CCL4建模后不同時(shí)間點(diǎn)的肝臟指數(shù)變化(s，n=8)

三、0.1%CCL4建模后不同時(shí)間點(diǎn)的肝組織病理變化

光鏡下觀察可見，各時(shí)間點(diǎn)空白對照組小鼠肝細(xì)胞未見異常病理變化，肝細(xì)胞索呈放射狀排列。3 h模型組可見少量腫脹肝細(xì)胞；6 h模型組肝細(xì)胞腫脹明顯增多；12 h模型組可見大量肝細(xì)胞腫脹，并出現(xiàn)少量炎細(xì)胞浸潤；24 h模型組小鼠大多數(shù)肝細(xì)胞腫脹，可見肝細(xì)胞壞死，肝索排列紊亂，并出現(xiàn)明顯的炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。24 h聯(lián)苯雙酯組小鼠較24 h模型組小鼠肝細(xì)胞腫脹量少，偶見點(diǎn)狀死，匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤有所好轉(zhuǎn)。見圖1。

圖1 小鼠肝損傷病理檢查結(jié)果(HE×200)

討 論

肝損傷是多種肝臟疾病的病理基礎(chǔ)，其機(jī)制多與肝細(xì)胞凋亡[4]、炎性因子產(chǎn)生[5]、脂質(zhì)過氧化[6]和氧化應(yīng)激[7]等相關(guān)。復(fù)制穩(wěn)定的肝損傷模型能夠?yàn)榕R床診斷、治療肝損傷及保肝藥物研究提供幫助。CCL4所致肝損傷模型是常用的實(shí)驗(yàn)性肝損傷模型，是護(hù)肝藥物作用及機(jī)制研究的經(jīng)典病理模型，重復(fù)性較好[8]。CCL4進(jìn)入機(jī)體后能夠?qū)е轮|(zhì)過氧化、膜損傷，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[9]。為避免長時(shí)間、高濃度CCL4溶液刺激引起肝纖維化、肝硬化、肝衰竭等嚴(yán)重的肝損傷，本實(shí)驗(yàn)選取0.1%濃度的CCL4溶液制備急性肝損傷模型，探索不同時(shí)間點(diǎn)肝損傷程度的變化，旨在選擇最佳造模方式。

ALT和AST在肝損傷診斷中是兩種重要的生化指標(biāo)，被作為判定肝損傷的標(biāo)志物[10]， 當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)各種酶如 ALT、AST會大量釋放進(jìn)入血液當(dāng)中，因此當(dāng)兩者呈高水平狀態(tài)時(shí)表示機(jī)體存在一定程度的肝損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)中與空白組比較，模型組與聯(lián)苯雙酯組在3、6、12、24 h轉(zhuǎn)氨酶水平均有升高，提示肝損傷的發(fā)生，也同時(shí)證實(shí)模型制備成功。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組染毒后，ALT在3 h輕度升高，12、24 h升高明顯；AST在3、6、12、24 h均升高，但在12和24 h升高顯著；肝臟指數(shù)在3、6 h輕度升高，12及24 h升高明顯；肝臟病理變化在 12及24 h可見明顯的肝細(xì)胞腫脹和炎性細(xì)胞浸潤，24 h損傷程度更顯著，因此，筆者認(rèn)為0.1%CCL4溶液制備肝損傷模型時(shí)，由于3和6 h時(shí)間短，模型不穩(wěn)定，而24 h之后損傷程度較重易造成重癥肝損傷，因此在12～24 h 之間建模更適宜。有學(xué)者統(tǒng)計(jì)，目前CCL4制備小鼠急性肝損傷模型的實(shí)驗(yàn)中，造模時(shí)間最常見的為24 h(占30.28%)、16 h(占27.23%)、18 h(占9.16%)、20 h(占5.85%)、12 h(占5.09%)，多在12～24 h之間，因此階段處于肝損傷峰值期[12]，與本實(shí)驗(yàn)建議時(shí)間相符合，造模時(shí)間太長及太短均不利于模型的穩(wěn)定性。

聯(lián)苯雙酯在臨床中有降低轉(zhuǎn)氨酶、保護(hù)肝細(xì)胞的功效，在實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常被作為研究保肝藥物的陽性對照物，為中藥五味子的提取物，有研究表明，南、北五味子的醇提物、水提物、木脂素單體類成分、多糖類成分等具有顯著的保護(hù)肝細(xì)胞、降低轉(zhuǎn)氨酶的功效[13]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，聯(lián)苯雙酯能夠降低ALT及AST、肝臟指數(shù)以及減少肝臟腫脹、抑制肝臟炎癥，從而發(fā)揮保肝的作用。在保肝藥物的研究中，中草藥是不可或缺的一部分，目前已有多項(xiàng)研究表明中藥單味藥、中藥單味藥衍生物、單味藥提取物及中藥復(fù)方等對肝損傷有保護(hù)作用，如益智仁及其衍生物[14]，蘆根多糖、蘆根果膠和蘆根提取物[15]，白頭翁皂苷[16]，王不留行炭納米類成分[17]等。中醫(yī)藥是我國的瑰寶，在今后的實(shí)驗(yàn)中加強(qiáng)對中草藥、中藥復(fù)方等的研究，使其在臨床治療肝損傷中發(fā)揮重要的作用是很有必要的。