朱雪晶 王夢(mèng)婷 鄢和新 黃仁杰

各種肝病患者超過4億，大部分是由于病毒感染、酗酒和代謝性因素造成的慢性肝損傷，有700萬(wàn)肝病患者發(fā)展為肝硬化，最終每年有超過40萬(wàn)例死于終末期肝病[1, 2]。構(gòu)建成模性高、重復(fù)性好的動(dòng)物肝損傷模型對(duì)于慢性肝病的研究十分重要。本研究比較幾種常見慢性肝損傷動(dòng)物模型的穩(wěn)定構(gòu)建方法及其表現(xiàn)特點(diǎn)，為肝病研究提供依據(jù)。

材料與方法

一、小鼠NASH模型

(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6小鼠72只，雄性，4～6周齡，購(gòu)于上海靈暢生物科技有限公司(合格證號(hào)：20180003011435)，飼養(yǎng)于上海南方模式生物科技股份有限公司動(dòng)物房[使用許可證號(hào)：SYXK(滬)2018-0002]。

(二)實(shí)驗(yàn)飼料 購(gòu)于美國(guó)RESEARCH DIETS公司，批號(hào)20030567A2，飼料為45%脂肪熱量和0.1%蛋氨酸且不含膽堿的改良高脂飼料。

(三)方法 動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)至體質(zhì)量>20 g，適應(yīng)期使用普通飼料喂養(yǎng)。更換改良高脂飼料前一晚禁食8～12 h。第2天選取體質(zhì)量較大的64只小鼠使用改良高脂飼料喂養(yǎng)[3, 4]，剩余8只小鼠使用普通飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)至2周時(shí)，所有小鼠通過眼眶靜脈叢取血，分離上清，并隨機(jī)處死46只改良高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠，觀察其肝臟病變；剩余動(dòng)物繼續(xù)使用和之前相同的飼料喂養(yǎng)至4周處死并取材[5, 6]。

二、小鼠肝纖維化模型

(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6小鼠60只，雄性，6～7周齡，購(gòu)于上海靈暢生物科技有限公司(合格證號(hào)：20180003008821)，飼養(yǎng)于上海南方模式生物科技股份有限公司動(dòng)物房[使用許可證號(hào)：SYXK(滬)2018-0002]，適應(yīng)環(huán)境7 d。

(二)方法 隨機(jī)選取52只小鼠按2 mL/kg腹腔注射10% CCL4(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20191113)橄欖油溶液，每周3次，連續(xù)12周[7-10]；剩余8只小鼠在相同的時(shí)間注射同體積的橄欖油。誘導(dǎo)至12周時(shí)，所有小鼠通過眼眶靜脈叢取血，分離上清，并隨機(jī)處死34只注射CCL4的小鼠，剩余動(dòng)物停止誘導(dǎo)2周后處死并取材。

三、大鼠肝硬化模型

(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠45只，雄性，6周齡，購(gòu)于浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(合格證號(hào)：20201105Aazz0619000504)，飼養(yǎng)于上海南方模式生物科技股份有限公司動(dòng)物房[使用許可證號(hào)：SYXK(滬)2018-0002]，適應(yīng)環(huán)境7 d。

(二)方法 隨機(jī)選取37只大鼠腹腔注射TAA(Sigma，批號(hào)BCBZ6865)200 mg/kg，每周2次，連續(xù)16周[11, 12]；剩余8只大鼠在相同的時(shí)間注射同體積的0.9% NaCl。誘導(dǎo)至16周時(shí)，所有大鼠通過眼眶靜脈叢取血，分離上清，并隨機(jī)處死5只注射TAA的大鼠，檢測(cè)其肝臟病變；剩余動(dòng)物停止誘導(dǎo)4周后處死并取材。

四、主要設(shè)備

全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)西門子公司，型號(hào)2400)，電子天平(上海然浩公司，型號(hào)ZG-TP203)，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀公司，型號(hào)HT150R)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、小鼠非酒精性脂肪性肝炎模型

(一)體質(zhì)量 普通飼料組小鼠體質(zhì)量呈正常增長(zhǎng)，而改良高脂飼料組小鼠體質(zhì)量略有下降，第2、3、4周體質(zhì)量顯著小于普通飼料組小鼠，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 普通飼料組和改良高脂飼料組體質(zhì)量變化

(二)血清ALT、AST、LDH、TC、TG水平 改良高脂飼料組小鼠2周時(shí)血清中ALT、AST、LDH水平相比普通飼料組小鼠升高，TC、TG水平降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，見表2。改良高脂飼料組小鼠4周時(shí)血清中ALT、AST、LDH水平相比普通飼料組小鼠升高，TC、TG水平降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。改良高脂飼料組小鼠誘導(dǎo)4周與喂養(yǎng)2周相比，血清中ALT、AST水平無明顯差異， LDH顯著升高，TC、TG則顯著降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表2 普通飼料組和改良高脂飼料組誘導(dǎo)2周血清ALT、AST、LDH、TC、TG水平比較(±s)

表3 普通飼料組和改良高脂飼料組誘導(dǎo)4周血清ALT、AST、LDH、TC、TG水平比較(±s)

表4 改良高脂飼料組誘導(dǎo)2周和4周血清ALT、AST、LDH、TC、TG水平比較(±s)

(三)肝組織病理 普通飼料組小鼠肝臟外觀正常，色澤紅潤(rùn)，病理學(xué)染色顯示其結(jié)構(gòu)正常，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，胞核呈卵圓形。改良高脂飼料組小鼠肝臟外觀顏色偏黃，2周時(shí)病理染色可見肝組織空泡樣病變，空泡內(nèi)充滿脂滴；4周時(shí)可見肝細(xì)胞脂肪變性面積增大，見圖1。

注：A為普通飼料組小鼠肝臟外觀；B為普通飼料組小鼠肝組織HE染色；C為普通飼料組小鼠肝組織油紅O染色；D為改良高脂飼料組小鼠喂養(yǎng)2周肝臟外觀；E為改良高脂飼料組小鼠喂養(yǎng)2周肝組織HE染色；F為改良高脂飼料組小鼠喂養(yǎng)2周肝組織油紅O染色；G為改良高脂飼料組小鼠喂養(yǎng)4周肝臟外觀；H為改良高脂飼料組小鼠喂養(yǎng)4周肝組織HE染色；I為改良高脂飼料組小鼠喂養(yǎng)4周肝組織油紅O染色

二、小鼠肝纖維化模型

(一)體質(zhì)量 橄欖油組小鼠體質(zhì)量呈正常增長(zhǎng)，而CCL4組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)相對(duì)稍緩，見圖2。

圖2 橄欖油組和CCL4組誘導(dǎo)期間小鼠的體質(zhì)量變化

(二)血清ALT、AST水平 CCL4組小鼠12周后血清中ALT、AST分別為(8507.3±1083.1)和(4911.2±644.0)U/L，同時(shí)期橄欖油組小鼠分別為(41.8 ± 29.2)和(104.0 ± 33.6)U/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.85、20.86，均P<0.01)。停藥2周后ALT、AST迅速下降，但CCL4組小鼠血清中ALT、AST水平為(41.7 ± 7.7)和(70.8 ± 30.0)U/L，仍高于橄欖油組小鼠的(23.8 ± 4.4)和(38.8 ± 5.2)U/L(t=6.125、2.976，均P<0.01)。

(三)肝組織外觀與病理 橄欖油組小鼠肝臟表面光滑，病理顯示其結(jié)構(gòu)正常，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，胞核呈卵圓形。CCL4組小鼠肝臟表面粗糙，病理顯示靜脈周圍大灶狀炎細(xì)胞浸潤(rùn)，正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，纖維組織間隔形成大小不等的假小葉。注射CCL412周，肝纖維化模型成功率100%(70/70)，停止注射CCL4后，肝纖維化模型至少可維持2周，見圖3。

注：A為橄欖油組小鼠肝臟外觀；B為橄欖油組小鼠肝組織HE染色；C為橄欖油組小鼠肝組織SR染色；D為CCL4組小鼠肝臟外觀；E為CCL4組小鼠肝組織HE染色；F為CCL4組小鼠肝組織SR染色；G為CCL4組小鼠停藥2周肝臟外觀；H為 CCL4組小鼠停藥2周肝組織HE染色；I為 CCL4組小鼠停藥2周肝組織SR染色

三、大鼠肝硬化模型

(一)體質(zhì)量 0.9% NaCl組大鼠體質(zhì)量呈正常增長(zhǎng)，而TAA組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)相對(duì)較緩，見圖4。

圖4 0.9% NaCl組和TAA組誘導(dǎo)期間大鼠的體質(zhì)量變化

(二)血清ALT、AST、GGT、GPDA、Alb水平 TAA組大鼠16周后血清中ALT、AST、GGT、GPDA水平相比同時(shí)期0.9% NaCl組大鼠升高，Alb水平降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)， 見表5。停藥4周后ALT、AST、GPDA迅速下降，GGT、Alb水平略有升高，但TAA組大鼠血清中ALT、AST、GGT水平還是顯著高于0.9% NaCl組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表6。

表5 0.9% NaCl組和TAA組誘導(dǎo)16周，血清ALT、AST、GGT、GPDA、Alb水平比較(±s)

表6 0.9% NaCl組和TAA組停藥4周，血清ALT、AST、GGT、GPDA、Alb水平比較(±s)

(三)肝組織外觀與病理 0.9% NaCl組大鼠肝臟表面光滑，病理顯示其結(jié)構(gòu)正常，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，胞核呈卵圓形。TAA組大鼠肝臟表面粗糙，大小結(jié)節(jié)混雜，正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞纖維組織間隔形成大小不等的假小葉，纖維間隔增寬。注射TAA 16周，誘導(dǎo)肝硬化模型成功率100%(37/37)，停止注射TAA后，肝硬化模型至少可維持4周，見圖5。

注：A為0.9% NaCl組大鼠肝臟外觀；B為0.9% NaCl組大鼠肝組織HE染色；C為0.9% NaCl組大鼠肝組織SR染色；D為TAA組大鼠肝臟外觀；E為TAA組大鼠肝組織HE染色；F為TAA組大鼠肝組織SR染色；G為TAA組大鼠停藥4周肝臟外觀；H為 TAA組大鼠停藥4周肝組織HE染色；I為 TAA組大鼠停藥4周肝組織SR染色

討 論

慢性肝損傷動(dòng)物模型一般選擇嚙齒類的大鼠或小鼠，這類動(dòng)物遺傳背景清晰，個(gè)體間差異小，可控性和經(jīng)濟(jì)性都比較有優(yōu)勢(shì)。本研究中改良高脂、CCL4、TAA誘導(dǎo)的慢性肝損傷模型均為可逆模型，停止誘導(dǎo)一段時(shí)間后，由于大、小鼠肝臟本身強(qiáng)大的再生功能，轉(zhuǎn)氨酶迅速下降，肝臟逐漸恢復(fù)。故轉(zhuǎn)氨酶的升高水平并不能代表肝損傷的程度，肝損傷嚴(yán)重程度需結(jié)合病理學(xué)。

改良高脂飼料誘導(dǎo)的NASH模型選擇C57小鼠是由于小鼠對(duì)飼料的消耗相對(duì)較小，該模型的建立需要不間斷使用改良高脂飼料，連續(xù)喂養(yǎng)2周即可快速建立NASH模型，ALT、AST、LDH水平上升4～7倍，成模率100%，繼續(xù)喂養(yǎng)至4周，模型進(jìn)一步加重。該模型動(dòng)物體質(zhì)量、TG、TC水平雖然有別于臨床NASH患者，但是肝組織的脂肪變性以及轉(zhuǎn)氨酶的升高可以很好的模擬臨床NASH疾病。

CCL4是常用的肝損傷毒物之一，CCL4經(jīng)P450酶代謝激活，生成活自由基及一系列氧化活性物質(zhì)，與肝細(xì)胞質(zhì)膜或亞細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，連續(xù)注射小劑量的CCL4可致肝纖維化，該模型選擇C57小鼠，是由于該品系的小鼠對(duì)于CCL4的耐受性較好，可以長(zhǎng)期反復(fù)注射。本研究使用的誘導(dǎo)條件，肝纖維化誘導(dǎo)成功率可達(dá)100%，且個(gè)體均一，去病因后AST、ALT約升高2倍，模型至少可以維持2周。該模型可以很好的模擬臨床肝纖維化患者的病癥。

TAA常用于肝硬化模型的誘導(dǎo)，TAA被肝臟攝取后，經(jīng)肝細(xì)胞內(nèi)的P450酶代謝為TAA-硫氧化物，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和肝細(xì)胞損傷，并可致腸道菌群死亡產(chǎn)生內(nèi)源性內(nèi)毒素，進(jìn)一步加重肝損傷。由于小鼠肝臟不會(huì)形成肝硬化結(jié)節(jié)的外觀表現(xiàn)，故選用大鼠來建立肝硬化模型，TAA誘導(dǎo)的肝硬化模型與臨床肝硬化患者的肝臟外觀類似。本研究使用的誘導(dǎo)條件，肝硬化誘導(dǎo)成功率可達(dá)100%。去病因后ALT、AST、GGT、GPDA這些指標(biāo)上升不明顯，但經(jīng)解剖觀察，注射了TAA的大鼠肝臟表面都有結(jié)節(jié)形成，但是個(gè)體間存在一定的差異性，主要表現(xiàn)為大小結(jié)節(jié)的占比不同。

本研究比較了三種常用的慢性肝損傷模型建模方法，模型成功率高、表型穩(wěn)定，適用于慢性肝病機(jī)制以及藥效學(xué)研究。