郭金 石春霞 鄧威 張璐懿 陳倩 龔作炯

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)伴有肝細(xì)胞大量凋亡或壞死，病死率高達(dá)80%～90%[1]。肝臟作為能量代謝的中心，ALF患者常合并能量代謝紊亂，肝功能衰竭時(shí)固有免疫細(xì)胞線粒體氧化磷酸化受抑，糖酵解加速的現(xiàn)象[2]。蘋果酸脫氫酶1(malate dehydrogenase 1，MDH1)在胞質(zhì)中通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)催化蘋果酸-天冬氨酸穿梭(malate-aspartate shuttle，MAS)，MAS主要將位于線粒體內(nèi)膜的NADH，通過蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體基質(zhì)，參與線粒體氧化呼吸，生產(chǎn)ATP[3, 4]，因此MDH1對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)和線粒體能量代謝有著重要意義[5]。目前對(duì)于MDH1和代謝關(guān)聯(lián)的研究主要集中于腫瘤方面，其在ALF時(shí)的水平變化和作用有待深入探討。肝衰竭過程中肝組織依次經(jīng)受免疫損傷、缺血缺氧損傷、內(nèi)毒素血癥三重打擊，其中，腸源性內(nèi)毒素血癥可以激活巨噬細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子[6]。越來越多的研究報(bào)道了炎癥與能量代謝的緊密關(guān)聯(lián)，故本研究檢測(cè)了蘋果酸脫氫酶底物及產(chǎn)物在ALF患者中的變化，并使用LPS，革蘭陰性菌胞壁成分[7]，處理小鼠ANA-1巨噬細(xì)胞，比較對(duì)照組及LPS處理組TNF-α、MDH1、乳酸、葡萄糖、ATP水平，以揭示LPS對(duì)巨噬細(xì)胞能量代謝的影響，為改善肝衰竭預(yù)后提供可能的治療策略。

材料與方法

一、一般資料

收集2019年10月至2019年11月于武漢大學(xué)人民醫(yī)院就診的16例研究對(duì)象血清，其中正常體檢者8例，男性5例，女性3例，年齡(47.5±12.6)歲；急性肝衰竭者8例，男性5例，女性3例，年齡(42.5±14.0)歲。兩組的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

ALF患者診斷符合《肝衰竭診治指南(2018年版)》[8]，排除合并慢性肝炎等肝病病史者，排除合并有惡性腫瘤(如肝癌等)以及心、肺、腎等重要臟器器質(zhì)性病變者。本研究經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(WDRY2021-K016)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

三、材料與試劑

小鼠ANA-1巨噬細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心，LPS購(gòu)自美國(guó) Sigma- Aldrich 公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，胰酶購(gòu)自合肥Biosharp公司，小鼠MDH1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技，小鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技，ATP及乳酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，葡萄糖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技，MDH1一抗、GAPDH一抗購(gòu)自武漢三鷹公司，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自武漢碧云天公司。

四、方法

(一)血清生化指標(biāo)收集 收集研究對(duì)象臨床生化指標(biāo)，包括：活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶原活動(dòng)度(prothrombin activity，PTA)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、白蛋白(albumin，Alb)、總膽紅素(total bilirubin，TBil)、直接膽紅素(direct bilirubin，DBil)。

(二)LC-MS檢測(cè)血清草酰乙酸和蘋果酸水平 血清4℃復(fù)融，每份樣本取100 μL，加入100 μL預(yù)冷去離子水+800 μL預(yù)冷甲醇/乙腈+800 μL內(nèi)標(biāo)Succinate-d6和Alanine-d4混勻，冰浴中超聲 60 min，-20℃ 孵育1 h沉淀蛋白，14 000×g 4℃ 離心 20 min，取上清。采用Shimadzu Nexera X2 LC-30AD超高效液相色譜進(jìn)行分離，柱溫40℃，流速300 μL/min，進(jìn)樣5 μL，0～1 min，95%B；1～12 min, 95%～55%B；12～13 min，55%～40%B；13～15 min，40%B；15～15.1 min，40%～95%B ；15.1～18 min，95%B。使用QTRAP5500質(zhì)譜儀(AB SCIEX)，配置電噴霧離子源( ESI) ，負(fù)離子模式，氣簾氣壓力 35 kPa，電噴霧電壓-4500 V，離子源溫度 550 ℃，輔助氣1壓力 40 kPa，輔助氣2壓力 50 kPa，檢測(cè)正常組和ALF組血清草酰乙酸和蘋果酸水平。

(三)細(xì)胞培養(yǎng) ANA-1細(xì)胞為小鼠巨噬細(xì)胞，采用含10%胎牛血清+1%鏈-青霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃ 體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2恒溫箱中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(四)構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的ANA-1巨噬細(xì)胞模型 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的ANA-1細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分為對(duì)照和LPS兩組，待細(xì)胞密度達(dá)500(萬個(gè)/皿)時(shí)，對(duì)照組使用DMEM培養(yǎng)基，不加用藥物處理；LPS組使用含5 μg/mL LPS的DMEM培養(yǎng)基。孵育24 h后收集細(xì)胞及上清，檢測(cè)ANA-1細(xì)胞內(nèi)MDH1、乳酸、葡萄糖、ATP含量以及上清中TNF-α水平。

(五)檢測(cè)細(xì)胞上清TNF-α水平 收集細(xì)胞上清，采用雙抗一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)TNF-α，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值，繪制曲線計(jì)算樣本濃度。

(六)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDH1水平 收集細(xì)胞，用PBS稀釋細(xì)胞懸液，通過反復(fù)凍融破壞細(xì)胞并釋放細(xì)胞內(nèi)成分，4℃離心(2500 r/min，20 min)后收集上清，采用雙抗一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)MDH1水平，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值，繪制曲線計(jì)算樣本濃度。

(七)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDH1蛋白含量 將每組細(xì)胞胰酶消化后置于4 mL EP管內(nèi)，使用超聲碎膜儀進(jìn)行處理后，提取總蛋白，BCA 定量試劑盒測(cè)定蛋白含量。加樣30 μg/每孔，電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；加入一抗4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗室溫下避光孵育1 h，洗膜后使用Odyssey系統(tǒng)掃描分析。檢測(cè)兩組細(xì)胞內(nèi)MDH1蛋白含量。

(八)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)乳酸、葡萄糖、ATP水平 收集細(xì)胞，使用相應(yīng)試劑盒，嚴(yán)格按照說明書加入檢測(cè)樣本及試劑，酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)：葡萄糖505 nm、乳酸630 nm、ATP636 nm)測(cè)定A值，計(jì)算相應(yīng)樣本濃度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組血清生化指標(biāo)比較

正常體檢組和肝衰竭組血清APTT、PTA、ALT、AST、Alb、TBil、DBil差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清生化指標(biāo)比較(±s)

二、血清草酰乙酸和蘋果酸水平

與正常組相比，ALF組血清蘋果酸增多為(11.973±3.236)比(22.674±7.210)，草酰乙酸減少為(0.722±0.230)比(0.420±0.084)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.830、-3.486，P=0.004)。

三、細(xì)胞上清液TNF-α水平

與對(duì)照組(255.010±16.139)pg/mL相比，LPS處理組細(xì)胞上清液中TNF-α水平升高(1722.501±76.261)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=26.624，P<0.05)。

四、細(xì)胞內(nèi)MDH1水平與蛋白含量

與對(duì)照組(15.710±0.302)ng/mL相比，LPS處理組細(xì)胞內(nèi)MDH1水平降低(11.831±0.335)ng/mL，同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)MDH1蛋白含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-12.172，P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組細(xì)胞內(nèi)MDH1蛋白含量條帶圖

五、細(xì)胞內(nèi)乳酸、葡萄糖、ATP水平

與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞內(nèi)乳酸及葡萄糖水平升高，ATP水平減低(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組細(xì)胞內(nèi)乳酸、葡萄糖及ATP水平比較(±s)

討 論

肝臟在氨基酸、脂肪酸、碳水化合物等的代謝中起著核心作用，有研究分析了慢加急性肝衰竭患者血清代謝組學(xué)，證明肝衰竭時(shí)線粒體相關(guān)的能量代謝受抑制[2]。

介導(dǎo)蘋果酸和草酰乙酸這兩種物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化的酶主要是蘋果酸脫氫酶，它是參與有氧呼吸的重要代謝酶。蘋果酸脫氫酶1位于胞質(zhì)，參與MAS，伴有NAD+生成，以支持線粒體氧化磷酸化[9]。本研究結(jié)果提示ALF患者血清蘋果酸增多，草酰乙酸減少，可能是由于肝衰竭時(shí)各種原因?qū)е戮€粒體膜結(jié)構(gòu)破壞，三羧酸循環(huán)障礙，蘋果酸脫氫酶底物蘋果酸蓄積，產(chǎn)物草酰乙酸生成減少[10]。

巨噬細(xì)胞是生物體抵抗病原感染、激活炎癥反應(yīng)的重要元件，可以迅速適應(yīng)各種微環(huán)境刺激并迅速對(duì)其作出反應(yīng)，在不同的刺激條件下分化為M1/M2(促炎/抗炎)兩種表型，M2型主要抵御寄生蟲感染，可促進(jìn)組織修復(fù)及傷口愈合，其能量代謝以脂肪酸氧化以及氧化磷酸化為主[11]。而LPS可以激活巨噬細(xì)胞中多種信號(hào)通路(促分裂原活化的蛋白激酶、核因子κB等)，促進(jìn)TNF-α、白介素-1β等細(xì)胞因子釋放[12]，此為M1型巨噬細(xì)胞。He等[13]的研究表明，LPS激活Toll樣受體4誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞壞死，能量代謝紊亂。LPS處理的巨噬細(xì)胞哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)激活，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)表達(dá)增加；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)增加，生產(chǎn)NO抑制線粒體呼吸[14,15]。可見，LPS誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化受阻[16]。TNF-α屬于TNF超家族，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等過程[17]。在本研究中，LPS觸發(fā)的促炎反應(yīng)是模擬肝衰竭時(shí)內(nèi)毒素血癥激活巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子。LPS處理組上清液中TNF-α明顯升高，表明所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化并釋放了炎癥因子。

本研究檢測(cè)了ANA-1細(xì)胞內(nèi)MDH1水平和蛋白含量，結(jié)果均提示MDH1活性減低。有研究表明，線粒體功能障礙時(shí)，MAS受損，相關(guān)酶活性降低。胞內(nèi)MDH1水平的減低可能與細(xì)胞損傷后線粒體相關(guān)能量代謝受抑，以及胞膜破壞后酶釋放至胞外有關(guān)[18]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS處理組ANA-1細(xì)胞乳酸增加，可能來源于線粒體氧化呼吸異常后代償性糖酵解加速，同時(shí)，HIF-1α表達(dá)上調(diào)可以誘導(dǎo)乳酸脫氫酶表達(dá)，催化丙酮酸產(chǎn)生乳酸[14]。ATP作為生物體能量利用的基本形式，其水平反映了細(xì)胞代謝活力，耗竭時(shí)可致細(xì)胞凋亡或壞死[5]。由于糖酵解途徑產(chǎn)生ATP效率相對(duì)低下[19]，故當(dāng)巨噬細(xì)胞受到LPS刺激時(shí)，ATP生成減少，本實(shí)驗(yàn)中也觀察到了LPS組ATP減少的現(xiàn)象。此外，LPS組胞內(nèi)葡萄糖含量增加，因?yàn)榫€粒體功能障礙時(shí)，葡萄糖消耗減少，同時(shí)，代謝活躍的免疫細(xì)胞可加速攝取葡萄糖至胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)葡萄糖濃度升高[20, 21]。Nishikawa等[22]發(fā)現(xiàn)，肝硬化失代償期的小鼠肝細(xì)胞線粒體功能障礙，耗氧率減低，ATP生成明顯減少，葡萄糖消耗減少，乳酸生成增加，與本研究結(jié)果一致。

Xu等[23]研究表明，卡格列凈通過抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞糖酵解，可以起到抗炎的作用，此種效應(yīng)在針對(duì)衣康酸的研究中也有所體現(xiàn)[24]。因此，要深刻理解免疫細(xì)胞能量代謝與炎癥活性之間的關(guān)系，并以此為切入點(diǎn)，改變肝衰竭時(shí)能量代謝狀態(tài)，減少肝臟損傷，促進(jìn)肝功能恢復(fù)，改善疾病預(yù)后。