張愛莉，曹丙林，張 良，崔朝輝，胡永生，王家占，盧作焜

(1．許昌學(xué)院 食品與藥學(xué)院，河南 許昌 461000；2．許昌學(xué)院 河南省食品安全生物標(biāo)識快檢技術(shù)重點實驗室，河南 許昌 461000)

生物活性肽是對人體功能具有有益影響、或特定生理調(diào)節(jié)作用的肽類化合物[1].由于生物活性肽能夠與其它蛋白質(zhì)或靶點相互作用從而調(diào)節(jié)人體生理過程，因而其生物活性與氨基酸序列關(guān)系密切[2].生物活性肽更易于人體吸收利用，并且容易加工[3].活性肽具有很多對人體有益的功效，例如預(yù)防衰老、改善細(xì)胞代謝等，部分生物活性肽對預(yù)防腫瘤、降低血壓等方面[4].越來越多的研究致力于從食品產(chǎn)品及未充分利用的富含蛋白質(zhì)的食品工業(yè)副產(chǎn)品中尋找加工和生產(chǎn)中產(chǎn)生的生物活性肽[5].生物活性肽來源廣泛，其中應(yīng)用最多的是從雞蛋、牛奶及肉中提取的生物活性肽[6].部分來源于海洋生物蛋白質(zhì)的多肽甚至具有抗腫瘤活性[7].食物蛋白質(zhì)來源的生物活性肽一般通過酶水解[8]和微生物發(fā)酵[9，10]進(jìn)行生產(chǎn).

苦杏仁中含有特有的苦杏仁苷，具有良好的藥用價值[11].由杏仁蛋白水解制得的生物活性肽—杏仁多肽，其應(yīng)用開發(fā)并沒得到充分的重視[12].因此，以苦杏仁為研究對象，通過酸沉淀法提取總蛋白，利用響應(yīng)面法優(yōu)化抗氧化肽酶解工藝，得到最佳工藝參數(shù).研究對苦杏仁抗氧化肽活性的優(yōu)化提供了一定程度的理論數(shù)據(jù)，同時為中藥苦杏仁的進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦杏仁：河北省霍山縣兆麟堂生物科技有限公司；蛋白酶K、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)：鄭州派尼化學(xué)試劑廠.

TDZ5-WS多管架自動平衡離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；TGL-16C高速臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠.

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將苦杏仁首先經(jīng)萬能高速粉碎機粉碎，然后用石油醚(沸程30～60 ℃)對其進(jìn)行脫脂，按料液比1∶ 1.5脫脂3次.放入通風(fēng)櫥內(nèi)通風(fēng)揮發(fā)，經(jīng)24 h后拿出，放入烘干箱50 ℃烘干6 h，過篩得脫脂苦杏仁粉.

1.2.2 苦杏仁蛋白與多肽的制備

首先稱取50 g苦杏仁粉，以1∶ 16的料液比加入0.1 mol·L-1的氯化鈉溶液，磁力攪拌器攪拌30 min后加入0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值為9.0.隨后使用四層紗布過濾取上清液倒入50 mL離心管中，3 800 r·min-1離心15 min，上清液調(diào)節(jié)至pH=4.1，靜置10 min.最后3 800 r·min-1離心15 min，將沉淀進(jìn)行冷凍干燥得到苦杏仁粗蛋白粉，置于干燥皿中保存?zhèn)溆?苦杏仁蛋白粉溶解在含有50 mmol·L-1pH為8.0的Tris-HCl和10 mmol·L-1CaCl2溶液中，每0.8 mL蛋白溶液加入2 μl的蛋白酶K溶液(5 mg·mL-1).

1.2.4 單因素實驗

以DPPH清除率為指標(biāo)，只改變一個因素其他因素保持不變，探究水浴時酶解溫度、酶解時間、蛋白底物濃度三個因素對苦杏仁酶解液DPPH清除率的影響.

1.2.5 DPPH自由基清除率計算方法

稱取0.001 4 g DPPH 粉末，以無水乙醇為溶劑，在100 mL褐色容量瓶中定容，并避光保存.取1 mL無水乙醇+1 mL DPPH溶液于EP管中充分混勻，避光條件下反應(yīng)30 min為空白對照組A0，于波長517 nm處使用分光光度計測其吸光值.Ai為樣品值(0.2 mL樣品+0.8 mL無水乙醇、1 mL DPPH溶液)的吸光度；A裂為樣品本身(0.2 mL裂解液+1.8 mL無水乙醇)的吸光度.計算公式為

1.2.6 響應(yīng)面試驗

將由單因素實驗得出的3個最佳條件作為自變量，酶解液DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，以每個單因素實驗結(jié)果的最適值為中心，在其區(qū)域內(nèi)往上取一個水平值作為水平1，往下取一個水平值為-1，設(shè)計3因素3水平17個試驗點的Box-Behnken試驗.采用Design-expert 12進(jìn)行處理，所有試驗均重復(fù)三次.

2 結(jié)果與討論

2.1 因素實驗結(jié)果

2.1.1 酶解溫度對酶解效果的影響

由圖1可知，酶解液的DPPH清除率受水浴溫度的影響較為明顯，到50 ℃之后，DPPH清除率迅速下降.因此選取酶解溫度為50 ℃.

圖1 酶解溫度對DPPH清除率

2.1.2 酶解時間對酶解效果的影響

由圖2可知，在前2 h，DPPH自由基清除率受酶作用的時間增長趨勢明顯；酶解2 h后，雖然酶解時間一直在繼續(xù)，但清除率的增長卻并不明顯；到達(dá)2 h之后，酶解反應(yīng)趨于平衡，產(chǎn)物不再增加，清除率增長不明顯.

圖2 酶解時間對DPPH清除率的影響

圖3 底物蛋白濃度對酶解效果

2.1.3 底物蛋白濃度對DPPH清除率的影響

在酶解溫度為50 ℃、酶解時間為1.5 h條件下，當(dāng)?shù)孜锏鞍诐舛嚷黾訒r(5、10、15、20、25 mg·mL-1)，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率先升高后降低，在底物蛋白濃度為10 mg·mL-1時清除率到達(dá)最高點(圖3).原因可能是隨著底物蛋白濃度的增加，底物蛋白和活性多肽進(jìn)一步被降解，導(dǎo)致DPPH自由基清除活性降低；也可能是隨著酶解液濃度增大，蛋白分子之間互相影響，酶與底物蛋白之間的相互作用點減少，間接影響了底物蛋白分子與酶之間的反應(yīng).因此最佳酶解液濃度為10 mg·mL-1.

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立及結(jié)果

通過確定的響應(yīng)面試驗因素水平表，以DPPH自由基清除率為考察指標(biāo)，研究各因素對DPPH自由基清除率的影響，從而確定最佳酶解工藝條件.響應(yīng)面試驗結(jié)果如表2所示.

表2 響應(yīng)面分析的試驗結(jié)果

2.2.2 方差分析

采用Design-expert 12軟件，對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行計算分析，得到底物蛋白濃度(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)與DPPH自由基清除率(Y)之間的回歸方程為

Y=-4.5625A+5.8125B-2.175C-3.15AB-0.475AC-0.325BC-12.045A2-10.645B2-6.42C2+62.94.

為了更好地探究此方程的可靠性，進(jìn)一步探究響應(yīng)值與各因素之間的關(guān)聯(lián)程度，對該回歸方程進(jìn)行方差分析(表3).

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析

由表3可以看出，模型p值小于0.05，證明該模型方程存在顯著性水平差異，其決定系數(shù)R2=0.941 6，這表明自變量和因變量之間存在顯著的因果關(guān)系，其實際值與預(yù)測值之間的擬合度良好.分析結(jié)果表明，該模型可以預(yù)測和分析苦杏仁抗氧化肽的制備過程.

通過顯著性分析可以看出，A和B均對響應(yīng)值影響顯著，且B的p值相較于A更小，可以說明對響應(yīng)值的影響程度為：B>A>C，酶解溫度的影響力更大，其次是底物蛋白的濃度，水解時間的影響程度最小.

2.3 工藝確定及優(yōu)化驗證

為了進(jìn)一步確定最佳工藝，采用Design-expert12程序?qū)γ附鈼l件進(jìn)行分析，可得到苦杏仁抗氧化肽的最佳提取方案為：底物蛋白濃度為9.444 mg·mL-1、酶解時間為1.921 h、酶解溫度為51.607 ℃，此時DPPH自由基清除率為64.197%.結(jié)合實際操作，將其最佳提取參數(shù)修改為：酶解溫度52 ℃、酶解時間115 min、底物蛋白濃度9 mg·mL-1.在這些條件下進(jìn)行三組實驗，測得平均提取率為64.9%，與理論最佳提取率相比，相對誤差為0.71%.為了使實際操作更加簡便，采用修改后的方法，具有很好的實用價值.

3 結(jié)論

實驗以苦杏仁為原材料，以堿提酸沉法分離得到苦杏仁粗蛋白，以酶解法酶解得到苦杏仁多肽.在單因素實驗基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面試驗對苦杏仁多肽的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為：酶解溫度52 ℃、酶解時間115 min、底物蛋白濃度9 mg·mL-1.在此最佳工藝條件下，苦杏仁蛋白酶解液DPPH自由基清除率可以達(dá)到64.9%.方差分析結(jié)果顯示，對DPPH自由基清除率影響程度為：酶解溫度>底物蛋白濃度>酶解時間.研究對苦杏仁抗氧化肽活性的優(yōu)化提供理論參考，有助于中藥苦杏仁的進(jìn)一步開發(fā)利用.