何萍 徐瑞 姜璐 王維平

慢性腎功能不全患者常伴有多種并發(fā)癥，其中心血管疾病和感染合計(jì)占慢性腎功能不全患者死亡總數(shù)的70%，兩者與免疫反應(yīng)改變直接或間接相關(guān)[1]。血液透析是慢性腎功能不全患者進(jìn)展至終末期腎病時(shí)常用的腎替代治療方法，維持性血液透析（Maintenance hemodialysis，MHD）患者常存在免疫功能異常[2]，表現(xiàn)為T(mén)淋巴細(xì)胞功能障礙。另外，MHD患者亦存在紅細(xì)胞免疫功能異常，這些免疫功能紊亂與MHD患者多種并發(fā)癥有關(guān)。微炎癥狀態(tài)、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)（Secondary hyperparathyroidism，SHPT）是透析患者常見(jiàn)并發(fā)癥，且嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量，增加心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。而維生素D作為免疫調(diào)節(jié)激素，對(duì)慢性腎臟病患者免疫功能具有重要作用。帕立骨化醇是一種選擇性維生素D受體激動(dòng)劑，臨床研究已證實(shí)其在治療MHD伴SHPT方面有確切療效[3～6]，但目前關(guān)于其對(duì)免疫功能的影響研究不多。為此，本研究觀察帕立骨化醇用于MHD患者治療SHPT的同時(shí)對(duì)紅細(xì)胞免疫功能和T細(xì)胞亞群的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年12月～2021年8月在我院血液凈化中心行MHD治療的患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①接受血液透析治療超過(guò)1年；②年齡18～75歲；③病情穩(wěn)定，無(wú)惡性腫瘤、急性心腦血管疾病、急性感染等；④600pg/ml＜甲狀旁腺素（Parathyroid hormone，PTH）＜1 000pg/ml、血 鈣＜2.55mmol/L，服用骨化三醇或含鈣磷結(jié)合劑者經(jīng)過(guò)2周的藥物洗脫期；⑤不存在鐵缺乏狀態(tài)：鐵蛋白水平≥200μmol/L，血清鐵飽和度≥20%；⑥未使用免疫抑制劑等影響免疫功能的藥物；⑦穩(wěn)定使用腎性貧血藥物6個(gè)月以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入選前3個(gè)月應(yīng)用西那卡塞、雙磷酸鹽等藥物；②嚴(yán)重肝臟疾??；③靜脈使用鐵劑者。共納入60例MHD伴SHPT患者作為研究組，男37例，女23例，年齡29～71歲，平 均（56.26±9.33）歲。原 發(fā)病 為慢性腎炎30例，糖尿病腎病12例，痛風(fēng)性腎病2例，多囊腎病2例，高血壓腎損害3例，梗阻性腎病2例，其他9例。同時(shí)，根據(jù)性別、年齡、透析齡配對(duì)選擇血紅蛋白和PTH達(dá)標(biāo)的MHD患者45例作為對(duì)照組，根據(jù)相關(guān)指南[7，8]血紅蛋白靶目標(biāo)控 制在110～130g/L，PTH控制 在150～300pg/ml，原發(fā)病為慢性腎炎22例，糖尿病腎病10例，痛風(fēng)性腎病2例，多囊腎病2例，高血壓腎損害2例，梗阻性腎病1例，其他6例。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審查同意，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 透析治療方法 所有患者均采用碳酸氫鹽透析液規(guī)律血液透析，每次4h，透析頻率每周3次，血流量200～250ml/min，采用低分子肝素抗凝，透析器為聚砜膜，面積1.8m2。

1.2.2 帕立骨化醇治療方法 研究組PTH理想控制目標(biāo)為150～300pg/ml，使用江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)的帕立骨化醇，商品名瑞可林，規(guī)格5μg/支，透析結(jié)束時(shí)經(jīng)由血液透析通路給藥，根據(jù)藥品說(shuō)明書(shū)并結(jié)合藥品規(guī)格使用、調(diào)整劑量，盡量不浪費(fèi)藥品。起始劑量0.04～0.1μg/kg，一般5μg/次，單次注射，給藥頻率每周2～3次。劑量調(diào)整：①4周后PTH較基線不變或上升，或下降＜30%，將帕立骨化醇增加5μg，每次增加或隔次增加；②如30%＜PTH較基線下降＜60%則維持原有劑量；③如PTH較基線下降＞60%或PTH＜150pg/ml則每次減少或隔次減少5μg。

1.2.3 其他藥物治療方法 研究期間患者原使用藥物如降壓藥、促紅細(xì)胞生成素以及口服鐵劑、維生素B12、葉酸等按照原有途徑和劑量使用，治療過(guò)程中原則上不做調(diào)整。

1.2.4 臨床指標(biāo)測(cè)定 于透析日清晨采集空腹肘靜脈血10ml，離心后吸取上清液待檢，采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白水平，計(jì)算中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比值（Neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）；采用全自動(dòng)生化免疫分析儀檢測(cè)肝功能、電解質(zhì)、PTH、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）及免疫球蛋白IgA、IgG、IgM等；采用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)定炎癥指標(biāo)白介素6（Interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）；通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+。研究組于治療前及治療12周后分別測(cè)定上述指標(biāo)，并根據(jù)治療監(jiān)測(cè)頻率檢測(cè)血常規(guī)、肝功能、PTH和電解質(zhì)，對(duì)照組僅入組時(shí)檢測(cè)上述指標(biāo)。

1.2.5 紅細(xì)胞膜C3b受體花環(huán)率（Red blood cell C3b receptor rosette rate，RBC-C3bRR）和紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率（Red blood cell immune complex rosette rate，RBC-ICR）測(cè)定 采用紅細(xì)胞酵母花環(huán)法測(cè)定RBCC3bRR和RBC-ICR，抽取空腹?fàn)顟B(tài)下抗凝血1ml，用生理鹽水稀釋后離心、清洗，配成1.25×107/ml的紅細(xì)胞懸液，其余血液離心沉淀并分離出血漿備用。分別取0.05ml配成的紅細(xì)胞懸液2份，1份加自身血漿0.05ml，并加入0.05ml（1×108/ml）酵母多糖混勻；另外1份加入0.05ml酵母多糖，再加入生理鹽水0.05ml混勻。2份混勻標(biāo)本均37℃水溶30min，然后加入0.25%戊二醛0.05ml混勻，取0.05ml進(jìn)行水平涂片，吹干，加甲醇固定，瑞氏染色，然后于高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞，1個(gè)紅細(xì)胞結(jié)合2個(gè)或2個(gè)以上酵母多糖為1個(gè)花環(huán)，分別計(jì)算2份標(biāo)本花環(huán)率得到RBC-C3bRR和RBC-ICR。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組與對(duì)照組一般資料比較 兩組患者性別、年齡、透析齡相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），研究組血紅蛋白、RBC-C3bRR、IgA、IgM、IgG、CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均低于對(duì)照組，而RBC-ICR、CD8+和PTH均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者一般資料比較（±s）

表1 兩組患者一般資料比較（±s）

項(xiàng)目 研究組（n=60）對(duì)照組（n=45）χ2/t P性別（男/女） 37/23 28/17 0.021 0.885年齡（歲） 56.26±9.33 55.17±11.91 0.526 0.600透析齡（月） 51.67±12.36 49.65±10.87 0.872 0.385血紅蛋白（g/L） 104.8±11.9 115.7±9.7 5.018 0.000 RBC-C3bRR（%）10.21±1.24 16.38±1.89 19.040 0.000 RBC-ICR（%） 14.15±1.07 8.97±0.95 25.741 0.000 IgA（g/L） 1.85±0.37 2.17±0.45 3.996 0.000 IgM（g/L） 0.96±0.29 1.39±0.39 6.218 0.000 IgG（g/L） 6.47±1.25 9.12±1.65 9.008 0.000 CD3+（%） 69.97±9.05 78.21±13.77 3.489 0.000 CD4+（%） 38.02±4.05 49.28±6.32 10.450 0.000 CD8+（%） 29.56±8.83 26.06±7.91 2.101 0.038 CD4+/CD8+1.43±0.55 1.84±0.51 3.899 0.000 PTH（pg/ml） 723.07±108.33 236.92±56.89 29.723 0.000

2.2 研究組治療前后生化指標(biāo)比較 治療12周后，研究組患者堿性磷酸酶（AKP）、血磷及PTH均較治療前下降，而血鈣水平較治療前升高（P＜0.05）；白蛋白（ALB）水平在治療前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 研究組治療前后炎癥指標(biāo)和紅細(xì)胞免疫功能比較 治療12周后，研究組患者炎癥指標(biāo)CRP、NLR、IL-6和TNF-α均下降，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白及RBC-C3bRR均升高，而RBC-ICR則下降，與治療前相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 研究組治療前后免疫功能比較 治療12周后，研究組患者IgA、IgM和IgG均升高（P＜0.05），CD4+、CD3+及CD4+/CD8+升高，而CD8+下降，與治療前相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表2 研究組治療前后生化指標(biāo)比較（±s）

表2 研究組治療前后生化指標(biāo)比較（±s）

時(shí)間 AKP（U/L） ALB（g/L） 鈣（mmol/L） 磷（mmol/L） PTH（pg/ml）治療前 135.91±28.72 38.56±5.19 2.26±0.24 2.51±0.49 723.07±108.33治療后 119.87±23.92 40.23±6.71 2.45±0.31 1.91±0.52 567.23±237.12 t 3.324 1.525 3.754 6.505 4.631 P 0.001 0.130 0.000 0.000 0.000

表3 研究組治療前后炎癥指標(biāo)和紅細(xì)胞免疫功能比較（±s）

表3 研究組治療前后炎癥指標(biāo)和紅細(xì)胞免疫功能比較（±s）

時(shí)間 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（×109/L）血紅蛋白（g/L）RBC-C3bRR（%）RBC-ICR（%）CRP（mg/L） NLR IL-6（pg/ml）TNF-α（pg/ml）治療前 3.23±0.49 104.8±11.910.21±1.2414.15±1.0716.41±4.30 4.41±1.20 87.49±16.7026.51±7.29治療后 3.46±0.55 109.3±10.315.19±1.45 9.25±0.84 10.30±3.91 3.79±0.89 71.81±17.8922.40±8.89 t 2.419 2.215 20.219 27.902 8.139 3.098 4.968 2.759 P 0.017 0.029 0.000 0.000 0.000 0.002 0.000 0.007

表4 研究組治療前后免疫功能比較（±s）

表4 研究組治療前后免疫功能比較（±s）

時(shí)間 IgA（g/L） IgM（g/L） IgG（g/L） CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4+/CD8+治療前 1.85±0.37 0.96±0.29 6.47±1.25 69.97±9.05 38.02±4.05 29.56±8.83 1.43±0.55治療后 2.05±0.43 1.12±0.33 8.29±1.51 73.93±8.26 44.39±5.54 26.10±7.60 1.80±0.65 t 2.731 2.821 7.192 2.503 7.128 2.301 3.366 P 0.007 0.006 0.000 0.014 0.000 0.023 0.001

3 討論

由于我國(guó)目前腎源匱乏，限制了腎移植手術(shù)治療的開(kāi)展，腎替代治療尤其是血液透析仍然是臨床上最常用的治療終末期腎病的有效手段。MHD患者存在多系統(tǒng)功能紊亂，受多種致病因子的綜合影響，除普遍存在貧血外，尚存在免疫功能紊亂。尿毒癥毒素、營(yíng)養(yǎng)不良、慢性炎癥、維生素D-甲狀旁腺激素軸改變以及透析治療等因素均影響患者免疫功能。SHPT是終末期腎病常見(jiàn)癥狀，以高PTH血癥、鈣磷代謝紊亂和維生素D紊亂為特點(diǎn)。中國(guó)透析預(yù)后與實(shí)踐模式研究（DOPPS）數(shù)據(jù)顯示MHD患者中PTH＞300pg/ml者占44.5%。PTH及其相關(guān)受體存在于人體眾多組織中，幾乎所有器官都是其作用的靶器官。T淋巴細(xì)胞表面有特異性PTH受體表達(dá)，PTH可作用于MHD患者T淋巴細(xì)胞，引起進(jìn)入淋巴細(xì)胞的鈣離子增多以及蛋白激酶激活，使T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞受到損害，抑制淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，對(duì)細(xì)胞免疫以及體液免疫產(chǎn)生影響。表現(xiàn)為T(mén)淋巴細(xì)胞總數(shù)尤其CD4+數(shù)量顯著下降，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白能力下降[9]。T細(xì)胞重要功能是介導(dǎo)細(xì)胞免疫并調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，是最重要的免疫細(xì)胞，其功能異常是MHD患者免疫功能紊亂的重要機(jī)制[10]。研究表明，SHPT患者行甲狀旁腺手術(shù)后，T淋巴細(xì)胞增生和B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白能力得到改善[11]。據(jù)此，推測(cè)應(yīng)用帕立骨化醇治療SHPT的同時(shí)可能會(huì)改善MHD患者免疫功能。

紅細(xì)胞是運(yùn)輸氧氣的主要媒介，具有強(qiáng)大免疫功能，其免疫功能是MHD患者抗感染的因素之一。紅細(xì)胞表面存在補(bǔ)體受體，可結(jié)合補(bǔ)體C3及循環(huán)免疫復(fù)合物，紅細(xì)胞通過(guò)膜表面的C3b受體與C3b相黏附，有利于清除機(jī)體異物，穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境；在疾病狀態(tài)下，紅細(xì)胞可能會(huì)失去其抗氧化能力并釋放損傷相關(guān)的分子模式，從而導(dǎo)致先天免疫和適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)[12]。而尿毒癥患者由于毒素抑制補(bǔ)體受體活性，并且紅細(xì)胞免疫抑制因子物質(zhì)增多，加上紅細(xì)胞生成減少，影響紅細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致紅細(xì)胞免疫功能低下，呈現(xiàn)RBC-C3bRR較正常人下降，而RBC-ICR升高。研究顯示，單次血液透析治療后RBC-C3bRR升高，RBC-ICR下降，但仍未恢復(fù)正常[13]。T細(xì)胞執(zhí)行特異性細(xì)胞免疫及調(diào)節(jié)功能，CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞是兩種主要的T細(xì)胞亞群，CD3+、CD4+主要起輔助作用，通過(guò)免疫細(xì)胞因子的分泌調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，而CD8+主要抑制淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。CD4+/CD8+細(xì)胞比值一定程度上反映機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)的平衡狀況，維持CD4+與CD8+平衡是機(jī)體免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的中心環(huán)節(jié)。

本研究結(jié)果顯示，MHD患者中貧血控制達(dá)標(biāo)且PTH控制達(dá)標(biāo)患者免疫功能狀態(tài)指標(biāo)優(yōu)于SHPT患者，伴SHPT的MHD患者存在免疫功能紊亂。應(yīng)用帕立骨化醇治療12周后，MHD患者PTH、血磷下降，血鈣升高，AKP下降（P＜0.05），與此同時(shí)，RBC-C3bRR上升而RBC-ICR下降，提示帕立骨化醇在糾正MHD患者SHPT同時(shí)，改善了紅細(xì)胞免疫功能，這可能也促進(jìn)了貧血的改善。另外，治療后免疫功能指標(biāo)CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IgM、IgG和IgA均較治療前升高，提示患者T細(xì)胞功能改善，由此可推斷MHD患者伴SHPT是影響T細(xì)胞亞群及紅細(xì)胞免疫功能的重要因素。

MHD患者由于尿毒癥毒素在體內(nèi)蓄積、酸堿失衡會(huì)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)造成損害，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞功能異常及免疫球蛋白水平下降。PTH升高可導(dǎo)致終末期腎病患者紅細(xì)胞免疫功能紊亂及貧血，而紅細(xì)胞具有調(diào)控T淋巴細(xì)胞免疫功能、B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白等作用。研究表明，MHD患者RBC-C3bRR與CD4+/CD8+呈正相關(guān)[13]。慢性腎衰竭患者T淋巴細(xì)胞明顯失衡，CD3+、CD4+均低于健康人群而CD8+高于健康人群[14]。SHPT患者PTH增加，可抑制E玫瑰花環(huán)形成以及正常淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，從而抑制淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用，導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，降低免疫應(yīng)答。維生素D是機(jī)體重要的調(diào)節(jié)內(nèi)分泌免疫的激素，可增強(qiáng)淋巴細(xì)胞功能，誘導(dǎo)CD4+產(chǎn)生，發(fā)揮免疫應(yīng)答效應(yīng)。終末期腎病患者普遍存在維生素D不足，帕立骨化醇是一種維生素D類(lèi)似物，其除具有調(diào)節(jié)鈣磷代謝作用外，還可以抑制腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)，減少炎癥因子的分泌[15]。因此，改善SHPT可能會(huì)改善MHD患者紅細(xì)胞免疫功能和機(jī)體免疫功能狀態(tài)。另外，本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)帕立骨化醇治療后，SHPT患者炎癥指標(biāo)CRP、NLR、IL-6和TNF-α均下降（P＜0.05），提示帕立骨化醇有效治療SHPT的同時(shí)改善了炎癥狀態(tài)，有利于進(jìn)一步改善紅細(xì)胞免疫和體液免疫。

綜上所述，MHD伴SHPT患者存在紅細(xì)胞免疫功能和T細(xì)胞亞群異常，帕立骨化醇在有效治療SHPT的同時(shí)，對(duì)MHD患者紅細(xì)胞免疫功能、免疫球蛋白和T細(xì)胞亞群均有改善作用。