肖海平 朱志偉

新生兒膿毒癥是臨床早產(chǎn)兒出現(xiàn)死亡及并發(fā)癥的主要原因之一，足月新生兒膿毒癥發(fā)病率相對(duì)較低，但仍有較高的嚴(yán)重不良結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)。相關(guān)研究認(rèn)為，膿毒癥在第三階段（膿毒性休克期）患兒已經(jīng)出現(xiàn)明顯低血壓所致的灌注異常，此時(shí)患兒死亡率達(dá)30%～50%[1]，預(yù)后較差。由于膿毒癥可誘發(fā)全身免疫應(yīng)答，炎癥反應(yīng)的過(guò)激表達(dá)使血清中中性粒細(xì)胞數(shù)量急劇增加，中性粒細(xì)胞發(fā)揮免疫作用的機(jī)制包括直接胞內(nèi)吞噬、脫顆粒作用后啟動(dòng)非氧殺菌和釋放中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）[2]。有學(xué)者證明，NETs作為一種組蛋白和抗菌蛋白修飾的網(wǎng)狀DNA結(jié)構(gòu)，在病原微生物控制播散及清除中有重要作用[3]，但過(guò)量的NETs會(huì)誘發(fā)炎癥瀑布反應(yīng)導(dǎo)致吞噬細(xì)胞功能下降，加重炎性損傷，繼而使膿毒癥患者出現(xiàn)肝損傷[4]，本研究旨在探討膿毒癥并發(fā)肝損傷患兒NETs濃度特點(diǎn)，借此評(píng)估NETs在疾病發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料 依據(jù)病例對(duì)照研究方式，收集2019年10月～2021年6月于我院診斷為膿毒癥的新生兒25例為觀察1組，25例膿毒癥并肝損傷新生兒為觀察2組，同期入院檢查的53例健康新生兒為對(duì)照組。入院后丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）升高至正常范圍高值2倍以上，天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TBil）或堿性磷酸酶中至少一項(xiàng)升高幅度超過(guò)正常值2倍判定為肝損傷。單純膿毒癥患兒及合并肝損傷患兒均有不同程度體溫改變、心率增快、呼吸頻率改變等，均有喂養(yǎng)反應(yīng)異常及活力異常。三組新生兒性別、受檢時(shí)日齡、出生時(shí)體重、分娩方式比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有良好的均衡可比性;觀察1組和觀察2組在膿毒癥誘發(fā)因素、母親合并病毒性肝炎、感染病原菌方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

續(xù)表1

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①經(jīng)血培養(yǎng)結(jié)果確認(rèn)為膿毒癥；②日齡＜60天；③對(duì)照組均無(wú)任何病史；④患兒家屬知情同意；⑤經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①母親攜帶人免疫缺陷病毒或合并獲得性免疫缺陷綜合征；②因其他疾病導(dǎo)致的肝損傷；③藥物性肝損傷；④原發(fā)性膽道疾病；⑤先天性肝臟發(fā)育障礙。

1.4 方法 統(tǒng)一條件下采集所有新生兒空腹靜脈血，以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT及TBil。外周血NETs定量檢測(cè)以NETs組成結(jié)構(gòu)中主要成分-雙鏈DNA（dsDNA）濃度作為NETs濃度，取4ml外周靜脈血于EDTA抗凝管，應(yīng)用PicoGreen熒光染料進(jìn)行dsDNA的定量檢測(cè)。

NETs激發(fā)時(shí)間測(cè)定：先分離中性粒細(xì)胞，采集10ml外周靜脈血，離心管內(nèi)準(zhǔn)備5ml中性粒細(xì)胞分離液，取5ml血液疊加于分離液表面，離心40min；將管內(nèi)粒細(xì)胞層收集完全后置入M199培養(yǎng)基中，在細(xì)胞滲透壓恢復(fù)后進(jìn)行離心，去除上清液，M199培養(yǎng)基（5ml）重懸進(jìn)行細(xì)胞沉淀，后離心5min；棄上清液，添加紅細(xì)胞裂解液后放于冰上裂解10min，離心；再次棄上清液，用M199培養(yǎng)基重懸，混勻后離心；棄上清液，細(xì)胞沉淀仍用培養(yǎng)基重懸；以臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色，取純化中性粒細(xì)胞。通過(guò)外物刺激中性粒細(xì)胞，刺激物選擇乙酸肉豆蔻佛波醇或N-甲酰-L-甲硫酰胺-L-白氨酰-L-苯丙氨酸，用量以中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs為宜，記錄NETs開(kāi)始產(chǎn)生時(shí)間。

1.5 觀察指標(biāo) 比較各組肝功能指標(biāo)（ALT、TBil）及中性粒細(xì)胞相關(guān)參數(shù)（中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、NETs）；根據(jù)《臨床兒科學(xué)》中關(guān)于兒童膿毒癥診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)[5]，將膿毒癥新生兒分為膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥及膿毒性休克三組，并比較三組患兒的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及NETs；比較膿毒癥早產(chǎn)兒及足月兒的中性粒細(xì)胞相關(guān)參數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均錄入SPSS 22.0軟件進(jìn)行處理，不同組別肝功能指標(biāo)及中性粒細(xì)胞參數(shù)比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料行秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組肝功能指標(biāo)及中性粒細(xì)胞相關(guān)參數(shù)比較 觀察1組、2組患兒ALT、TBil及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、NETs濃度均明顯高于對(duì)照組，且觀察2組上述指標(biāo)水平明顯高于觀察1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 不同分期膿毒癥患兒中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及NETs比較 膿毒性休克組及嚴(yán)重膿毒癥組患兒中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、NETs濃度均顯著高于膿毒癥組，且膿毒性休克組上述指標(biāo)水平顯著高于嚴(yán)重膿毒癥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.3 不同胎齡膿毒癥患兒中性粒細(xì)胞相關(guān)參數(shù)比較 早產(chǎn)兒中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及NETs濃度均低于足月兒，NETs形成時(shí)間長(zhǎng)于足月兒，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表2 各組肝功能指標(biāo)及中性粒細(xì)胞參數(shù)比較（±s）

表2 各組肝功能指標(biāo)及中性粒細(xì)胞參數(shù)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與觀察1組比較，bP＜0.05

組別 ALT（U/L）TBil（μmol/L）中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（×109/L）NETs（%）觀察1組（n=25） 60.94±10.28a27.08±4.54a 19.67±4.67a39.87±4.15a觀察2組（n=25） 103.21±8.17ab65.27±3.71ab30.27±9.47ab44.64±4.78ab對(duì)照組（n=53） 52.34±8.63 18.41±3.28 7.31±1.08 0.98±0.07 F 281.377 1374.718 172.279 2293.012 P 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 不同分期膿毒癥患兒中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及NETs比較（±s）

表3 不同分期膿毒癥患兒中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及NETs比較（±s）

注：與膿毒癥組比較，aP＜0.05；與嚴(yán)重膿毒癥組比較，bP＜0.05

組別 中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（×109/L） NETs（%）膿毒癥組（n=30） 50.17±10.71 38.78±4.57嚴(yán)重膿毒癥組（n=16） 57.28±10.28a 42.01±5.27a膿毒性休克組（n=4） 70.12±6.05ab 49.78±3.18ab F 7.729 10.445 P 0.001 0.000

表4 不同胎齡膿毒癥患兒中性粒細(xì)胞相關(guān)參數(shù)比較（±s）

表4 不同胎齡膿毒癥患兒中性粒細(xì)胞相關(guān)參數(shù)比較（±s）

組別 中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（×109/L） NETs（%） NETs形成時(shí)間（h）早產(chǎn)兒（n=31） 21.09±7.51 30.61±4.85 4.43±1.02足月兒（n=19） 30.28±9.87 40.30±6.84 2.36±0.49 t 3.723 5.857 8.257 P 0.000 0.000 0.000

3 討論

3.1 新生兒膿毒癥可出現(xiàn)ALT及TBil水平異常升高 本研究中膿毒癥患兒ALT及TBil水平均高于健康新生兒（P＜0.05），初步提示無(wú)論是否明確合并肝損傷，膿毒癥患兒均可出現(xiàn)肝功能下降，合并肝損傷后肝臟功能減退更加明顯。從炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的肝微循環(huán)障礙及氧自由基過(guò)氧化導(dǎo)致的肝損傷角度分析原因：新生兒膿毒癥是指細(xì)菌或真菌在新生兒娩出前、娩出過(guò)程中或娩出后經(jīng)各種途徑進(jìn)入新生兒血液循環(huán)并在其中生長(zhǎng)繁殖后造成的中毒反應(yīng)，患兒機(jī)體中大量細(xì)菌代謝產(chǎn)物及內(nèi)毒素釋放入血，機(jī)體對(duì)此作出的早期反應(yīng)可能上升至炎癥介質(zhì)瀑布狀態(tài)，各類(lèi)炎性介質(zhì)短時(shí)間內(nèi)分泌增加且氧自由基水平增高，而肝臟參與人體解毒及免疫防御，內(nèi)毒素、代謝產(chǎn)物、炎性因子、氧自由基等大量積聚于肝臟引起肝細(xì)胞損傷，因此膿毒癥后肝臟是最易受累的器官之一。在嚴(yán)重肝損傷期，中性粒細(xì)胞被招募到病灶區(qū)的情況減少，反而會(huì)誘發(fā)非感染部位的組織損傷，繼而導(dǎo)致多個(gè)臟器功能受損；在肝損傷后進(jìn)一步干擾膽汁代謝進(jìn)程，中性粒細(xì)胞分泌的NETs抑制膿毒癥期的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，機(jī)體往往存在免疫功能障礙，致使TBil水平增高，因此，肝損傷后可出現(xiàn)ALT增高，膽汁代謝障礙后則可出現(xiàn)TBil濃度增高，前者能反映肝細(xì)胞損傷程度，后者能較好地反映肝功能減退程度，評(píng)估肝功能指標(biāo)可以初步判斷患兒預(yù)后。另有研究針對(duì)成年膿毒癥患者進(jìn)行死亡風(fēng)險(xiǎn)因素分析，認(rèn)為膿毒癥并發(fā)肝損傷是膿毒癥患者死亡的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素[6]，亦證實(shí)本研究結(jié)果的可靠性。

3.2 膿毒癥患兒中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及NETs變化的臨床意義 本研究顯示觀察1組、2組患兒中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、NETs濃度均明顯高于對(duì)照組，不同膿毒癥分期患兒的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、NETs水平差異顯著，以膿毒性休克患兒的癥狀最為嚴(yán)重（P＜0.05），提示感染發(fā)生后患兒免疫系統(tǒng)激發(fā)了大量的中性粒細(xì)胞。結(jié)合中性粒細(xì)胞NETs的生理作用分析其表達(dá)水平對(duì)膿毒癥肝損傷的可能影響機(jī)制：①中性粒細(xì)胞是人體與生俱來(lái)的第一道免疫防線(xiàn)，具有強(qiáng)大的吞噬能力及趨化作用，在機(jī)體以各類(lèi)炎性細(xì)胞激活對(duì)膿毒癥發(fā)出免疫防御反應(yīng)中扮演重要角色，但在膿毒癥時(shí)期，中性粒細(xì)胞的募集反而會(huì)造成肝損傷及膽汁淤積，本研究中患兒的ALT水平及TBil濃度異常升高。同時(shí)淋巴細(xì)胞是患兒機(jī)體適應(yīng)性免疫的主要部分，其分泌水平與皮質(zhì)醇、神經(jīng)內(nèi)分泌應(yīng)激有關(guān)，因此中性粒細(xì)胞的變化往往反映不受抑制的炎癥反應(yīng)，加重膿毒癥，同時(shí)也代表潛在的免疫途徑。②中性粒細(xì)胞免疫作用中除直接吞噬外，在炎性介質(zhì)、應(yīng)激等作用下中性粒細(xì)胞可發(fā)生NETosis凋亡方式，核膜、胞質(zhì)顆粒膜均發(fā)生溶解，導(dǎo)致染色質(zhì)、胞漿顆粒產(chǎn)生接觸并在胞膜破裂后排放至細(xì)胞外，這種向細(xì)胞外釋放的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)為NETs。組蛋白、中性粒細(xì)胞源性循環(huán)DNA、蛋白酶顆粒（如乳鐵蛋白、髓過(guò)氧化物酶、溶菌酶等）組成該結(jié)構(gòu)框架，NETs能捕捉并殺滅病原菌，構(gòu)成中性粒細(xì)胞另一重要的抗感染方式。膿毒癥患兒感染部位召集了大量中性粒細(xì)胞，NETs以物理黏附方式聚集于病原微生物周?chē)?，限制病原體擴(kuò)散后暴露于抗菌藥物作用范圍內(nèi)，增強(qiáng)藥物治療效果[7]；其次NETs成分組成結(jié)構(gòu)中包含的抗菌蛋白能直接殺滅病原體，如組蛋白是NETs結(jié)構(gòu)中含量最高的蛋白，其殺菌能力是其他同等劑量殺菌劑的100倍[8]，髓過(guò)氧化物酶對(duì)次氯酸的形成有催化作用，高水平次氯酸可清除病原菌，乳鐵蛋白能隔離病原微生物繁殖所需的離子基團(tuán)，進(jìn)而限制其生長(zhǎng)，因此較高水平的NETs有利于膿毒癥感染控制[9]。通過(guò)檢測(cè)外周血NETs表達(dá)水平亦可作為膿毒癥嚴(yán)重程度的評(píng)估指標(biāo)之一。③研究表明[10]，NETs存在一定細(xì)胞毒性作用，盡管NETs結(jié)構(gòu)中的組蛋白、髓過(guò)氧化物酶、絲氨酸蛋白酶等對(duì)病原體有殺滅效果，但對(duì)正常細(xì)胞亦有影響，如組蛋白對(duì)細(xì)胞有毒性，絲氨酸蛋白酶能分解正常細(xì)胞外基質(zhì)蛋白后損傷組織，髓過(guò)氧化物酶催化形成的次氯酸則能損害細(xì)胞膜完整性；而且NETs在肝臟的肝竇位置能固定存活24h左右[11]，致使局部損傷集中，肝臟細(xì)胞毒性損害愈加明顯。本研究中觀察2組患兒NETs水平高于其他兩組，因此NETs對(duì)于膿毒癥患兒而言具有雙重作用。有研究發(fā)現(xiàn)，NETs能加速凝血進(jìn)程，血小板聚集后血栓形成風(fēng)險(xiǎn)增加，降低微血管灌注后引起血管內(nèi)皮損傷，聯(lián)合NETs毒性作用共同引起患兒上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等損害與死亡，加重患兒病情[12]。提示在新生兒膿毒癥治療中應(yīng)注意NETs濃度改變，及時(shí)檢測(cè)各器官功能狀態(tài)，在恰當(dāng)時(shí)機(jī)予以干預(yù)，既保留NETs清除病原菌的能力，又能控制其對(duì)正常組織的侵害深度。

3.3 中性粒細(xì)胞相關(guān)參數(shù)對(duì)早產(chǎn)的影響 本研究結(jié)果顯示早產(chǎn)膿毒癥患兒NETs形成時(shí)間明顯長(zhǎng)于足月患兒且NETs濃度低于足月患兒，表明發(fā)生感染的新生兒胎齡越小，NETs產(chǎn)生越延遲，且水平越低，分析原因可能與早產(chǎn)兒中性粒細(xì)胞、NETs調(diào)節(jié)機(jī)制尚不成熟有關(guān)。早產(chǎn)兒NETs形成延遲意味著中性粒細(xì)胞整體殺菌能力低下，而中性粒細(xì)胞作為新生兒時(shí)期最主要的免疫細(xì)胞不能有效發(fā)揮作用后，對(duì)患兒感染控制及預(yù)后極其不利。高雪鋒等[13]認(rèn)為新生兒中性粒細(xì)胞數(shù)量雖多但NETs形成能力較低，致使胞內(nèi)殺菌能力正常但胞外殺菌能力較弱，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞整體殺菌能力低于正常成年人。另有研究顯示足月新生兒的中性粒細(xì)胞在接受脂多糖刺激后2h產(chǎn)生少量NETs，早產(chǎn)兒則完全不能形成[14]，均表明了不同胎齡新生兒產(chǎn)生NETs能力的差異。因此針對(duì)膿毒癥早產(chǎn)新生兒應(yīng)及時(shí)干預(yù)、促進(jìn)活化進(jìn)程[15]。

綜上所述，膿毒癥肝損傷新生兒中性粒細(xì)胞水平可出現(xiàn)明顯升高，NETs濃度亦明顯增高，早產(chǎn)兒NETs形成時(shí)間較晚。NETs濃度的變化一方面表明該物質(zhì)參與感染控制，一方面提示對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞損害加重，可疊加肝臟損傷危險(xiǎn)。