郄智萍 周潔 莊曉丹 杜日昌 劉建 李泛湘 張柳萍 劉貞 陳巖 胡紅波

林奇綜合征（Lynch syndrome，LS）是一種常染色體顯性遺傳性疾病，易發(fā)生惡性腫瘤，包括結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、胃癌等。其中約50%的LS女性患者會(huì)最先發(fā)生子宮內(nèi)膜癌，因此子宮內(nèi)膜癌又被視為前哨癌[1]。研究顯示，林奇綜合征相關(guān)子宮內(nèi)膜癌（Lynch syndrome associated endometrial cancer，LS-EC）患者在10年內(nèi)發(fā)生第2次惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)約為25%，15年內(nèi)約為50%[2]。開展對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者的篩查，有利于早期發(fā)現(xiàn)、早期干預(yù)林奇綜合征患者。目前我國(guó)尚未建立成熟的篩查手段和完善的基因檢測(cè)指南，對(duì)LS-EC患者基因診斷的研究也較少。通過對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)人群進(jìn)行篩查，既可預(yù)防患者再次發(fā)生其他LS相關(guān)腫瘤，也有利于家族中其他成員規(guī)避LS相關(guān)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，盡早采取相應(yīng)的預(yù)防性措施。本研究旨在探索錯(cuò)配修復(fù)（Mismatch repair，MMR）蛋白表達(dá)結(jié)合患者LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史在子宮內(nèi)膜癌患者中初篩林奇綜合征的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究納入2019年1月～2020年12月在我院經(jīng)病理學(xué)診斷確診為EC的147例患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有病理學(xué)確診證據(jù)，患者病理組織標(biāo)本均采用免疫組化（IHC）檢測(cè)MMR蛋白表達(dá)；②有詳細(xì)的FIGO分期、手術(shù)治療方案及輔助治療方案；③有完善的臨床資料，包括患者個(gè)人和家族有無(wú)LS相關(guān)腫瘤等信息。排除標(biāo)準(zhǔn)：①外院完成全子宮+雙附件切除手術(shù)治療患者；②臨床資料、病理資料不全患者；③術(shù)前行新輔助放、化療患者；④復(fù)發(fā)型EC患者；⑤未行子宮內(nèi)膜癌分期手術(shù)治療患者。本課題已獲醫(yī)院倫理委員會(huì)通過，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 對(duì)147例確診為EC患者的病理切片進(jìn)行MLH1/PMS2/MSH2/MSH6蛋白免疫組化檢測(cè)。將石蠟切片依次烘片、脫蠟、水化，在檸檬酸鹽緩沖液中微波處理10min，冷卻后沖洗，3%H2O2中室溫避光孵育10min；加入一抗室溫孵育2h；漂洗后加入二抗室溫孵育30min；滴加DAB，顯微鏡下觀察5min，蘇木精復(fù)染后流水沖洗30min，封片觀察。每張病理切片均由至少兩名高級(jí)職稱病理醫(yī)師閱片及判讀結(jié)果。當(dāng)有MLH1、PMS2、MSH2、MSH6任一蛋白表達(dá)缺失即為MMR蛋白表達(dá)缺失（Deficiency-MMR，dMMR），若4個(gè)蛋白均表達(dá)陽(yáng)性則為MMR蛋白表達(dá)陽(yáng)性（Proficient-MMR，pMMR）。

1.2.2 LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史 147例EC患者均有詳細(xì)的個(gè)人史和一級(jí)、二級(jí)親屬的LS相關(guān)腫瘤病史調(diào)查，包括結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌等?；颊吒鶕?jù)MMR蛋白的免疫組化結(jié)果分為dMMR組與pMMR組。dMMR組均建議行胚系基因檢測(cè)，pMMR組有LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史者亦建議行胚系基因檢測(cè)，如MMR蛋白表達(dá)陽(yáng)性且無(wú)LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史，考慮為散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌，不建議行基因檢測(cè)。

1.2.3 胚系基因檢測(cè) 本研究委托深圳華大臨床檢驗(yàn)中心，利用二代測(cè)序技術(shù)（NGS）結(jié)合目標(biāo)區(qū)域捕獲，對(duì)檢測(cè)者相關(guān)基因（EPCAM、MLH1、MSH6、PMS2、MSH2、STK11、TP53、PTEN、MUTYH、BRCA1、MLH3）外顯子及其鄰近20個(gè)堿基對(duì)內(nèi)含子區(qū)變異進(jìn)行分析。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）的分類標(biāo)準(zhǔn)，將突變情況分為：致病性、疑似致病性、臨床意義不明、可能良性、良性。本研究將已知或疑似致病突變統(tǒng)稱為有害突變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用易侕統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以NGS結(jié)果為確診標(biāo)準(zhǔn)，比較IHC、LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史在LS-EC初篩中的預(yù)測(cè)價(jià)值。采用受試者工作特性曲線（Receiver operator characteristic curve，ROC）綜合對(duì)比兩種篩查方法的準(zhǔn)確性。ROC曲線下面積（Area under curve，AUC）用來(lái)綜合評(píng)價(jià)診斷的準(zhǔn)確性。AUC＞0.5時(shí)，越接近1表明診斷的準(zhǔn)確性越高，0.8＜AUC≤0.9表示有較高的診斷價(jià)值，AUC＞0.9表示有很高的診斷價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 147例EC患者發(fā)病年齡為30～75歲，平均53.46歲；診斷為L(zhǎng)S患者平均年齡為49.6歲。病理類型包括子宮內(nèi)膜樣腺癌132例，漿液性癌4例，透明細(xì)胞癌2例，癌肉瘤1例，混合細(xì)胞腺癌7例，鱗狀細(xì)胞癌1例；按照2009年FIGO分期：Ⅰ期129例，Ⅱ期7例，Ⅲ期10例，Ⅳ期1例。

2.2 免疫組化檢查MMR蛋白表達(dá)結(jié)果 147例患者中46例（31.3%）患者為dMMR，101例（68.7%）患者為pMMR。46例dMMR患者的蛋白缺失表達(dá)情況：MLH1/PMS2聯(lián)合缺失32例（21.8%），MSH2/MSH6聯(lián)合缺失3例（2.0%），MSH6/MLH1/PMS2聯(lián)合缺失2例（1.4%），單獨(dú)MSH6蛋白缺失3例（2.0%），單獨(dú)MLH1蛋白缺失3例（2.0%），單獨(dú)PMS2蛋白缺失2例（1.4%），單獨(dú)MSH2蛋白缺失1例（0.7%）。

2.3 LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史 147例患者中有14例存在LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史，其中10例為dMMR，4例為pMMR。10例dMMR患者均行NGS檢測(cè)，其中7例確診為L(zhǎng)S。4例pMMR患者中3例行NGS檢測(cè)，均無(wú)基因突變。

確診為L(zhǎng)S-EC且個(gè)人史或家族史陽(yáng)性的7例患者中，存在LS相關(guān)腫瘤家族史6例，LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史1例。6例家族史陽(yáng)性患者中一級(jí)親屬患病5例，一級(jí)親屬合并二級(jí)親屬患病1例。家族史陽(yáng)性患病人數(shù)：同一家族4人患病和3人患病各1例，2人患病4例。LS相關(guān)腫瘤分別為消化道惡性腫瘤5例，乳腺惡性腫瘤2例。見表1。

表1 LS-EC個(gè)人史、家族史陽(yáng)性患者資料

2.4 林奇胚系基因檢測(cè)結(jié)果 147例患者中43例行NGS檢測(cè)，10例患者有致病突變或疑似致病突變，確診為L(zhǎng)S，LS-EC發(fā)生率為6.8%。突變基因分別為PMS2突變4例（9.3%），MSH2突變3例（7.0%），MSH6突變2例（4.7%），MLH1突變1例（2.3%）。已知致病突變6例，疑似致病突變4例。見表2。

按MMR蛋白表達(dá)情況送檢NGS結(jié)果：dMMR組46例，行NGS檢測(cè)40例，10例診斷為L(zhǎng)S-EC；pMMR組101例，行NGS檢測(cè)3例，均無(wú)基因突變，為散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌。

表2 LS-EC患者錯(cuò)配修復(fù)基因突變結(jié)果

2.5 不同篩查方法預(yù)測(cè)價(jià)值比較 147例患者中有LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史患者14例，其中7例確診為L(zhǎng)S，敏感度為70.0%，特異性為94.9%，預(yù)測(cè)LS的AUC為0.82（見圖1）；經(jīng)IHC檢測(cè)確定dMMR 46例，其中送檢NGS 43例，最終10例確診為L(zhǎng)S，敏感度為100%，特異性為73.7%，預(yù)測(cè)LS的AUC為0.87（見圖2）。LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史聯(lián)合MSH2/MSH6缺失預(yù)測(cè)LS的敏感度為70.0%，特異性為94.9%，AUC為0.83（見圖3）。LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史聯(lián)合PMS2/MLH1缺失預(yù)測(cè)LS的敏感度為100%，特異性為76.6%，AUC為0.95（見圖4）。

免疫組化檢測(cè)為dMMR預(yù)測(cè)LS的敏感度最高，達(dá)100%；LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史預(yù)測(cè)LS的特異性達(dá)94.9%，LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史聯(lián)合MSH2/MSH6缺失預(yù)測(cè)LS的特異性也達(dá)94.9%；LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史聯(lián)合PMS2/MLH1缺失預(yù)測(cè)LS的AUC最高，達(dá)0.95。

圖1 LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史預(yù)測(cè)LS

圖2 dMMR預(yù)測(cè)LS

圖3 LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史聯(lián)合MSH2/MSH6缺失預(yù)測(cè)LS

圖4 LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史聯(lián)合PMS2/MLH1缺失預(yù)測(cè)LS

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道EC患者M(jìn)MR基因突變率約為5.9%[3]。本研究147例EC患者中有43例行NGS檢測(cè)，最終10例患者診斷為L(zhǎng)S，LS-EC發(fā)生率為6.8%，略高于文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，考慮到本研究有6例dMMR患者未同意檢測(cè)胚系突變，我們預(yù)測(cè)實(shí)際LS-EC發(fā)生率可能更高。國(guó)內(nèi)LS相關(guān)子宮內(nèi)膜癌篩查并未普及，我國(guó)人群中LS-EC患者的實(shí)際比例可能更高。研究顯示，LS-EC患者的發(fā)病年齡普遍低于散發(fā)性EC患者[4]，發(fā)病年齡為46～54歲，小于50歲者占60%[5]。本研究中EC患者平均患病年齡為53.46歲，而10例診斷為L(zhǎng)S患者平均患病年齡為49.6歲，低于散發(fā)性EC，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

有研究報(bào)道，EC患者M(jìn)MR蛋白表達(dá)缺失率為29.89%[6]；晉薇等[7]報(bào)道420例EC患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率為34.5%；本研究IHC篩查結(jié)果顯示dMMR發(fā)生率為31.3%（46/147），與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。本研究MMR蛋白表達(dá)缺失率最高的為MLH1/PMS2聯(lián)合缺失，發(fā)生率為21.8%（32/147）。MMR蛋白配對(duì)形成異二聚體，MLH1與PMS2配對(duì)，MSH2與MSH6配對(duì)，這些蛋白在不配對(duì)狀態(tài)下是不穩(wěn)定的，MLH1和MSH2可以與其他蛋白形成穩(wěn)定的異二聚體，而PMS2和MSH6只能分別與MLH1和MSH2形成異二聚體[8]。當(dāng)出現(xiàn)基因突變時(shí)，可能引起該基因?qū)?yīng)的蛋白表達(dá)缺失，也可能出現(xiàn)配對(duì)基因的蛋白表達(dá)缺失。如MLH1突變可導(dǎo)致MLH1和PMS2的聯(lián)合蛋白表達(dá)缺失，MSH2突變可導(dǎo)致MSH2和MSH6的聯(lián)合蛋白表達(dá)缺失。但MSH6突變一般只引起對(duì)應(yīng)的MSH6蛋白表達(dá)缺失，PMS2突變一般只引起對(duì)應(yīng)的PMS2蛋白表達(dá)缺失。

EC患者M(jìn)MR基因突變率最高的是MSH2基因，突變率為50%～66%，其次是MLH1（24%～40%）、MSH6（10%～13%），PMS2突變率最低（＜5%）[9]。本研究與文獻(xiàn)報(bào)道不一致，10例LS基因突變率最高的是PMS2基因，4例PMS2突變有3例為疑似致病突變。相關(guān)研究報(bào)道，PMS2突變的EC患者中有27%被診斷為乳腺癌[10]。本研究中1例PMS2突變患者有姐姐及妹妹患乳腺癌家族史，故要關(guān)注PMS2基因突變患者繼發(fā)第二種LS相關(guān)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，尤其要重視乳腺癌篩查。

本研究中基因突變率居第二位的是MSH2，3例MSH2基因突變中有2例存在消化道惡性腫瘤家族史。其中1例患者發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌時(shí)年齡30歲，且術(shù)前同時(shí)診斷結(jié)腸癌，其母親在45歲和50歲時(shí)分別患子宮內(nèi)膜癌和結(jié)腸癌。另1例患者35歲時(shí)發(fā)生子宮內(nèi)膜癌，姐姐45歲時(shí)發(fā)生子宮內(nèi)膜不典型增生，隨后患直腸癌，家族中尚有2名二級(jí)親屬患結(jié)直腸癌。這兩例MSH2基因突變患者的臨床特點(diǎn)為：先證者發(fā)生LS相關(guān)腫瘤的年齡較小，分別為35歲和30歲；家族中有至少2人以上患?。籐S相關(guān)腫瘤以子宮內(nèi)膜癌和結(jié)直腸癌為主，先證者的首發(fā)腫瘤均為子宮內(nèi)膜癌。這提示我們需高度重視年輕子宮內(nèi)膜癌患者的遺傳篩查，50%的情況下子宮內(nèi)膜癌在結(jié)直腸癌診斷之前出現(xiàn)[1]，子宮內(nèi)膜癌可作為患者自身和潛在家庭成員的前哨癌癥，且為家族成員提供充足時(shí)間來(lái)篩查和預(yù)防LS相關(guān)的第二種腫瘤。對(duì)MSH2基因突變的患者應(yīng)加強(qiáng)一級(jí)親屬的突變位點(diǎn)測(cè)序，繪制家系圖，做好LS家系的長(zhǎng)期風(fēng)險(xiǎn)管控和隨訪。

目前進(jìn)行LS篩查的方法尚無(wú)統(tǒng)一定論。IHC檢測(cè)快捷、價(jià)廉、相對(duì)可靠，是目前廣泛接受的LS篩查方法。本研究中應(yīng)用免疫組化檢測(cè)出46例MMR蛋白表達(dá)缺失，最終確診為L(zhǎng)S-EC的10例患者均有MMR蛋白表達(dá)缺失，免疫組化檢測(cè)的敏感度達(dá)100%，但特異性僅為73.7%。有LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史患者14例，其中7例確診為L(zhǎng)S，特異性為94.9%。10例LS患者中有3例無(wú)家族史，因得益于免疫組化檢測(cè)出dMMR進(jìn)而行NGS檢測(cè)篩查出LS，就篩查的敏感度而言，推薦MMR蛋白IHC檢測(cè)作為L(zhǎng)S的初篩手段。30例未診斷為L(zhǎng)S的dMMR患者中有27例無(wú)家族史，NGS檢測(cè)均無(wú)基因突變，提示臨床篩查出dMMR患者時(shí)，臨床醫(yī)師應(yīng)詳盡地采集腫瘤家族史和個(gè)人史，并以LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史作為分流手段，以提高篩查特異性。由于MMR蛋白表達(dá)缺失以MLH1/PMS2聯(lián)合缺失發(fā)生率最高，LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史聯(lián)合PMS2/MLH1缺失預(yù)測(cè)LS的AUC為0.95，進(jìn)一步證實(shí)聯(lián)合篩查的預(yù)測(cè)效能最高。

綜上所述，考慮篩查手段的可及性和成本效益，以IHC作為初篩手段，在dMMR人群中以個(gè)人史或家族史進(jìn)行分流，可提高篩查特異性。MMR蛋白免疫組化檢測(cè)聯(lián)合LS相關(guān)腫瘤個(gè)人史或家族史是臨床LS篩查的最優(yōu)策略。