戶乃麗

（首都醫(yī)科大學中心實驗室，北京 100069）

造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）是生成各種血細胞的最起始細胞，又稱多能造血干細胞，有著長期自我更新能力和分化成各類成熟血細胞的潛能［1］。常用的流式檢測手段主要有兩類，依據(jù)細胞功能和表面標記物，前者主要是依據(jù)干細胞表面的ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白，能夠?qū)⑦M入胞內(nèi)的核酸染料Hochest33342排出而識別出HSCs［2］，后者目前應(yīng)用更為廣泛，采用多個表面標記共同標記造血干細胞，應(yīng)用較廣泛的如LSK（Lineage-，Sca-1+，c-Kit+）方案［3，4］，在該群體中，還存在一些祖細胞，因此SLAM（Signaling lymphocyte activation molecule）家族蛋白CD48、CD150被加入識別長期造血干細胞（long-term HCSs，LT-HSCs，CD48-CD150+LSK）、短期造血干細胞（short-term HCSs，ST-HSCs，CD48+CD150+LSK）和多能造血祖細胞（multipotential hematopoietic progenitor cell，MPPs，CD48+CD150-LSK），其表達不受小鼠品系和發(fā)育階段等的影響［5］。流式技術(shù)可以根據(jù)表面標識物將HSCs各亞群識別并實現(xiàn)精確的分選，但是在實際操作中遇到的困難是：首先HSCs含量過低，分選后所得到的細胞純度欠佳，其次分選時間過長，細胞活性難以保證，因此，本實驗結(jié)合Lineage磁珠對樣品進行預(yù)純化，并加入識別細胞死活的染料7-AAD，建立了一種高效的檢測和高純度分選小鼠骨髓造血干細胞方案。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠20只，SPF級，體質(zhì)量28～30 g，5～6周齡，購于首都醫(yī)科大學實驗動物部，飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度40%～70%，正常飲水進食。

1.2 試劑與儀器

Lineage Cell Depletion Kit試 劑盒，MiniMACS分離器及分離柱購自Miltenyi Biotec；臺盼藍，7-AAD試 劑 購 自Sigma Aldrich；lineage cocktail-FITC、 c-Kit-APC、 Scal-1-Percp-cy5.5、CD48-BV421、CD150-PE購自Biolegend；熒光補償微球購自eBioscience；紅細胞裂解液、流式細胞儀質(zhì)控CST微球、Accudrop beads購自BD；實驗所用儀器為BDAriaⅢ型流式細胞分選儀，配有488 nm、561 nm、633 nm、405 nm 4只激光器。

1.3 實驗方法

1.3.1 骨髓單細胞懸液的制備

頸椎脫臼處死小鼠，無菌條件下去除脛骨及股骨，去除周圍肌肉，剪開骨骺端，用5 ml的注射器吸取PBS+2%胎牛血清反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細胞懸液并用注射器反復(fù)吹打，200目過濾網(wǎng)過濾，制成單細胞懸液，而后加入5mL紅細胞裂解液，混勻，室溫孵育10分鐘，離心機1500 r/min離心5分鐘，棄上清后加入PBS離心漂洗1～2次重懸浮，得到骨髓單細胞懸液。平均每只小鼠可獲得骨髓細胞5×107個細胞。

1.3.2 分選儀器的準備

儀器準備主要是液流參數(shù)和斷點的調(diào)節(jié)，鞘液桶和水桶用75%酒精浸泡消毒4h以上，用純水沖洗干凈，鞘液桶中加入無菌PBS，運行開機程序，安裝85 μm噴嘴，分選電壓4500V，F(xiàn)req設(shè)定為47.4，調(diào)節(jié)液滴振幅Ampl，使GaP值和Drop1維持穩(wěn)定，而后選中主液流框的sweet spot鍵開啟液流自動監(jiān)控。上樣Accudrop beads微球調(diào)節(jié)液滴延遲為30.31，微球在initial或fine tune模式下都達到側(cè)液流偏轉(zhuǎn)以99%以上，此時儀器具備分選條件。

1.3.3 流式細胞染色和分選

將收集到的骨髓細胞，F(xiàn)c-R阻斷劑封閉后根據(jù)說明書配比加入anti-mouse lineage cocktail-FITC、c-Kit-APC、Scal-1-Percp-cy5.5、CD48-BV421、CD150-PE，4℃避光孵育30 min，PBS洗2次，將細胞懸液加PBS定容至2 ml，加入20 μl 7-AAD混勻待上機，上樣后通過陰性對照和扣除對照管確定目的細胞群，收集各群細胞比例數(shù)據(jù)并圈定Lineage-，Sca-1+，c-Kit+細胞群體進行分選，接收管中預(yù)置0.5 mL培養(yǎng)基或工作液接收所得細胞。

1.3.4 磁珠純化后流式分選

取5×107個骨髓細胞，加入50μL生物素抗體Biotinylated lineage cocktail，4℃孵 育30 min，PBS清洗1次，加入100μL抗生物素抗體磁珠，4℃孵育15 min，PBS清洗1次，將磁柱置于磁力架上，將單細胞懸液經(jīng)過磁柱分選，收集流下的細胞再次過磁柱，PBS沖洗磁柱一次，收集磁珠分選后的液體，離心去上清定容，依次加入按配比加入流式檢測抗體，染色和流式分選LSK細胞方法同前。

1.3.5 分選后純度檢測

吸取400 μL分選后的細胞上流式細胞儀，在原分選方案中檢測分選后細胞的純度及各亞群的表達。

1.3.5 分選后細胞存活率檢測

吸取新提取的細胞懸液90 μL，加入0.4%臺盼蘭溶液10 μL，充分混勻后。加入改良的牛鮑計數(shù)板，顯微鏡下觀察細胞見未被染色細胞為活細胞。細胞存活率=拒染細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學處理方法

采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，進行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠骨髓干細胞的染色結(jié)果

每個樣品收集1～2×106的細胞數(shù)據(jù)得到正常小鼠造血干細胞比例，7-AAD-活細胞為81.5±4.2%，Lineage-細胞（P2），LSK（P3）及LT-HSCs、ST-HSCs、MPPs各群細胞（Q1、Q2、Q3）比例如表1所示，圖1顯示為單次檢測結(jié)果，P3門為分選的目的細胞群。

圖1 正常小鼠骨髓干細胞檢測結(jié)果

表1 正常小鼠骨髓干細胞分群表達情況（x±s，n=4，% Parent：在上一級邏輯門中的比例）

2.2 流式直接分選和磁珠加流式分選結(jié)果

骨髓細胞經(jīng)Lineage-磁珠預(yù)純化后，Lineage-細胞 群 由 原 來 的（13.1±2.35）%增 加 為（53.6±4.35）%，如圖2所示（P＜0.05），由于Lineage-細胞的富集，使得LSK由之前的（0.2±0.03）%Total增加至（5.6±0.2）%Total，此富集后的樣品再經(jīng)流式染色分選，LSK可近一步純化為（93.6±1.1）%，比單一流式分選純度（82.5±1.7）%有所提升，如圖3（P＜0.05）。5只小鼠骨髓細胞混合共得到LSK+細胞約為3×105。CD150，CD48在LSK中各亞群比例不受磁珠和流式分選的影響，相比分選前無顯著變化。

圖2 磁珠分選前后Lineage-細胞比例的變化情況

圖3 LSK細胞分選結(jié)果

2.3 分選后LSK細胞存活率

經(jīng)臺盼蘭染色計數(shù)，流式分選細胞存活率（91.3±2.03）%，磁珠+流式分選得到細胞存活率為（90.7±1.54）%，P＞0.05。

3 討論

3.1 樣品的染色

小鼠造血干細胞最常用的表面標記分子是LSK，同時，可通過SLAM家族蛋白CD150，CD48進一步將細胞分為3個亞群，即LT-HSCs、ST-HSCs，MPPs。LT-HSCs具有很強的自我更新能力，可以維持機體終生的造血，但由它分化而來的ST-HSCs以及MPPs只能在短期內(nèi)執(zhí)行造血功能［6］，MPPs具有多向分化潛能，可進一步分化為淋巴祖細胞和骨髓祖細胞。無論是LSK，或者CD150，CD48，在全部骨髓細胞中都屬于低表達量，因此在熒光抗體的選擇上應(yīng)注意選擇熒光強度較強或中強的抗體，例如：PE、BV421、APC等，而Lineage+細胞屬于被排除掉的部分，因此要選取熒光強度較弱的FITC等熒光素。若抗體熒光強弱搭配不當，有可能導(dǎo)致含量低的LSK細胞被掩蓋［7］，陽性率不準確。由于實驗樣品在抽吸沖洗骨髓組織以及離心過程中不可避免地產(chǎn)生死細胞，因此檢測方案中加入識別細胞死活的染料是必要的，對于檢測，死活染料的加入可去除死細胞引起的非特異著色，對于分選，有助于提高分選后細胞的活性。目前流式多用的細胞死活染料分為兩大類，核酸染料和氨基反應(yīng)性染料［8］，氨基反應(yīng)性染料可以用于標記固定和非固定過的細胞，染色后需要洗滌，有可能對細胞數(shù)量造成少量損失。核酸染料以7-AAD為主，主要適用于非固定細胞的表面標記物的染色，7-AAD的優(yōu)點在于染色快捷，樣品上機前加入，無需洗滌，缺點是它的激發(fā)和發(fā)射光譜范圍較寬，與PE，APC等常用染料存在漏光，樣品檢測時需設(shè)立單陽樣品調(diào)節(jié)補償。對于本方案由于Sca-1、c-Kit、CD48、CD150表達量低，在調(diào)節(jié)補償時，單陽樣品的陽性峰非常不明顯，無法準確調(diào)節(jié)補償值，因此，對于這一類低陽性率樣品，推薦使用熒光補償微球進行各通路補償值的調(diào)節(jié)。

3.2 樣品的分選

分選后細胞數(shù)目，細胞的活性和純度是評估分選效果的重要指標。AriaⅢ型流式細胞儀每小時識別處理約為1～2×107個細胞，對于含量僅有0.1～0.2%的LSK細胞群，直接分選的弊端在于耗費時間過長，獲取目的細胞困難，分選后純度不佳。在本實驗中，由于樣品中含有約90%的Lineage+細胞群的干擾，因此，利用生物素抗體Biotinylated lineage cocktail，再經(jīng)生物素與磁珠結(jié)合，將樣品過兩遍分離柱，去除一半以上的Lineage+細胞，可顯著提升目的細胞LSK在樣品中的比例，明顯縮短分選時間。由于在實際操作中，磁珠分選會造成細胞總數(shù)的損失，因此，在此方案中，不必要求將Lineage-細胞純化至90%以上，只需去除一半即可，這樣可避免細胞過多丟失且能節(jié)省抗體，再結(jié)合后續(xù)的流式分選，能夠得到純度90%以上的LSK細胞。

對于實驗中使用的FACSAriaⅢ型流式細胞儀，在流式細胞儀分選設(shè)置上，首先要注意調(diào)節(jié)穩(wěn)定的液流參數(shù)，液流的穩(wěn)定是保證分選準確進行的基礎(chǔ)，分選過程中開啟液流“sweet spot”模式，一旦液流不穩(wěn)定時分選能夠自動停止，防止液滴飛濺污染影響收集管中細胞的陽性率。此外，液滴延遲的調(diào)節(jié)是十分重要，可自動結(jié)合手動重復(fù)調(diào)節(jié)確定正確的Drop delay數(shù)值，一旦液流參數(shù)發(fā)生變化，需要重新校準Drop delay，這些是保證分選進行的基本條件。在分選過程中，選取的是85 μm的噴嘴，上樣速度控制在6000～8000 evts/秒，此時回收率可達85～90%之間，較少有細胞丟失，通過上述手段，可以將含量僅為0.1～0.2%Total的LSK純化為91.3±2.03%，同時活性也在90%以上，能夠滿足后續(xù)實驗研究。