楊晉，張娟，高杰，馬素偉，王焱，靳昊

（保定市第二中心醫(yī)院口腔科，河北 保定 072750）

舌鱗狀細胞癌（tongue squamous cell carcinoma,TSCC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差[1]。化療、放療和手術(shù)治療均會產(chǎn)生一定的副作用，因此尋找新的治療TSCC的靶向分子指標已成為當下研究的熱點。微小RNA（microRNA,miRNA）可通過靶向調(diào)控其目的基因的表達，影響多種細胞功能。其中，miR-138-5p可通過直接靶向RHBDD1基因抑制乳腺癌細胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition,EMT）[2]，通過靶向ZEB2基因抑制肺腺癌細胞EMT、生長和轉(zhuǎn)移[3]，且miR-138在口腔鱗狀細胞癌中下調(diào)[4]。而組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶（enhancer of zeste homolog 2,EZH2）是細胞增殖、細胞周期、癌細胞轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生等多種生物進程的表觀遺傳調(diào)控因子[5]，敲低EZH2表達可抑制TSCC細胞侵襲遷移能力[6]。但是，目前miR-138-5p和EZH2在TSCC中的相互作用機制尚未見報道，因此，本研究通過上調(diào)miR-138-5p表達，觀察其對TSCC細胞Tca-8113增殖、凋亡、EMT進程及EZH2蛋白表達的影響，并探討其潛在的作用機制。

1 材料

1.1 細胞株

永生化的舌上皮株Hacta細胞和舌鱗癌細胞株Tca-8113均購自中國科學院典型培養(yǎng)物保存委員會細胞庫。

1.2 主要試劑及儀器

野生型和突變型EZH2 3'UTR熒光素酶報告基因載體（EZH2 WT、EZH2 MUT）；miR-138-5p NC（miR-138-5p陰性對照）、miR-138-5p模擬物（miR-138-5p mimics）、si-EZH2（EZH2小干擾RNA）、si-NC（EZH2小干擾RNA陰性對照）、pcDNA NC（過表達EZH2陰性對照質(zhì)粒）、pcDNA EZH2（過表達EZH2重組質(zhì)粒）以及miR-138-5p、EZH2、U6和β-actin引物均由上海生工生物工程有限公司合成；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；β-聯(lián)蛋白（β-catenin）、上皮鈣黏素（E-cadherin）、神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）鼠抗和辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗均購自美國Abcam公司；尼康SMZ745光學顯微鏡購自上海普赫生物科技有限公司；FACSCanto流式細胞儀購自美國Beckman公司；全能型凝膠成像分析系統(tǒng)ChemiDoc-MP購自山東三瑞科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)與分組

Hacta和Tca-8113細胞使用含10%（φ）胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃，5%（φ）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

本研究共分為以下幾組：Hacta組（永生化的舌上皮細胞株）、Tca-8113組（未轉(zhuǎn)染Tca-8113細胞）、miR-138-5p NC組（Tca-8113細胞轉(zhuǎn)染miR-138-5p NC）、miR-138-5p mimics組（Tca-8113細 胞 轉(zhuǎn) 染miR-138-5p mimics）、si-NC組（Tca-8113細 胞轉(zhuǎn)si-NC）、si-EZH2組（Tca-8113細胞轉(zhuǎn)染si-EZH2）、miR-138-5p mimics+pcDNA NC組（Tca-8113細胞共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)miR-138-5p mimics和pcDNA NC）、miR-138-5p mimics+pcDNA EZH2組（Tca-8113細胞共轉(zhuǎn)染miR-138-5p mimics和pcDNA EZH2）；取生長密度 達50%～60%的Tca-8113細 胞，使 用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒進行轉(zhuǎn)染后，培養(yǎng)24 h。

2.2 qRT-PCR檢測細胞中miR-138-5p和EZH2 mRNA表達水平

采用RNA抽提試劑盒提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒說明書配置PCR反應(yīng)體系：2×SYBR mix 10 μL，H2O 8 μL，上下游引物各0.5 μL，10×cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件設(shè)定為：95℃預(yù)變性5 min、95℃變性15 s、60℃退火50 s、40個循環(huán)、72℃延伸10 min。分別以β-actin、U6作為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt算法，計算EZH2 mRNA、miR-138-5p表達水平。miR-138-5p、EZH2、U6及β-actin引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

2.3 生物信息學預(yù)測和雙熒光素酶驗證miR-138-5p和EZH2的靶向關(guān)系

采 用TargetScan在 線 網(wǎng) 站（http：//www.targetscan.org/mmu_72/）對miR-138-5p作用的靶基因進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)EZH2為其可能的靶分子。取對數(shù)生長期的Tca-8113細胞接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將細胞分為miR-138-5p mimics+EZH2 WT組、miR-138-5p NC+EZH2 WT組、miR-138-5p mimics+EZH2 MUT組和miR-138-5p NC+EZH2 MUT組，每組設(shè)6個復(fù)孔，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒進行細胞共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，驗證miR-138-5p與EZH2的靶向關(guān)系。

2.4 CCK-8法檢測細胞增殖活性

收集培養(yǎng)24 h后各組細胞，每組設(shè)置6個復(fù)孔，以8×103/mL接種至96孔板，各加10 μL CCK-8溶液避光孵育2 h，采用酶標儀檢測各孔450 nm處吸光度（A）值。A值越大表明其增殖活性越高。

2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

收集培養(yǎng)24 h后各組細胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗滌2次后，加入400 μL結(jié)合緩沖液懸浮細胞，再加入5 μL Annexin V染液，輕輕混勻后置于2～8℃避光條件下孵育15 min；然后加入10 μL PI輕輕混勻，于2～8℃避光下繼續(xù)孵育5 min后，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.6 Transwell小室法檢測各組細胞遷移和侵襲能力

遷移能力檢測：取各組細胞，用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基，制成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×108個/mL，按照Transwell小室試劑盒說明書進行操作，光學顯微鏡下觀察并計數(shù)穿過微孔膜的細胞。侵襲能力檢測：取Matrigel膠鋪于Transwell小室的上室，其余步驟同細胞遷移能力檢測實驗。

2.7 Western blot檢測各組細胞EMT相關(guān)蛋白βcatenin、E-cadherin、N-cadherin和vimentin表達水平

收集培養(yǎng)24 h后各組細胞，提取總蛋白，對蛋白進行定量。然后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂奶粉封閉1 h、1∶2 000濃度稀釋后的β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、GAPDH鼠抗4℃過夜孵育、含辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，用ECL顯色試劑盒顯色，全能型凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，以GAPDH為內(nèi)參，分析各組蛋白表達水平。

2.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用snk-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 Hacta和Tca-8113細胞中miR-138-5p、EZH2表達水平比較

與Hacta組相比，Tca-8113組細胞miR-138-5p表達水平顯著降低，EZH2 mRNA和蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Hacta和Tca-8113細胞中miR-138-5p、EZH2 mRNA和蛋白表達水平Figure 1 Expression of miR-138-5p,EZH2 mRNA and protein in Hacta and Tca-8113 cells

3.2 上調(diào)miR-138-5p對Tca-8113細胞EZH2 mRNA和蛋白表達的影響

與Tca-8113組和miR-138-5p NC組相比，miR-138-5p mimics組Tca-8113細胞miR-138-5p表達水平顯著升高（P＜0.05），EZH2 mRNA和蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 上調(diào)miR-138-5p對Tca-8113細胞miR-138-5p和EZH2表達水平的影響Figure 2 Effect of upregulation of miR-138-5p on miR-138-5p and EZH2 expression in Tca-8113 cells

3.3 上調(diào)miR-138-5p對Tca-8113細胞增殖、凋亡的影響

與Tca-8113組和miR-138-5p NC組相比，miR-138-5p mimics組Tca-8113細胞增殖活性顯著降低（P＜0.05），凋亡率顯著升高（P＜0.05）。見圖3。

圖3 上調(diào)miR-138-5p對Tca-8113細胞增殖、凋亡的影響Figure 3 Effect of upregulation of miR-138-5p on proliferation and apoptosis of Tca-8113 cells

3.4 上調(diào)miR-138-5p對Tca-8113細胞侵襲遷移能力的影響

與Tca-8113組和miR-138-5p NC組相比，miR-138-5p mimics組Tca-8113細胞遷移和侵襲能力顯著降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 上調(diào)miR-138-5p對Tca-8113細胞侵襲遷移能力的影響Figure 4 Effect of upregulation of miR-138-5p on invasion and migration of Tca-8113 cells

3.5 上調(diào)miR-138-5p對Tca-8113細胞EMT進程的影響

與Tca-8113組和miR-138-5p NC組相比，miR-138-5p mimics組Tca-8113細胞β-catenin和E-cadherin表達水平顯著升高（P＜0.05），N-cadherin和vimentin表達水平顯著降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 上調(diào)miR-138-5p對Tca-8113細胞EMT相關(guān)蛋白表達水平的影響Figure 5 Effect of upregulation of miR-138-5p on EMT related protein expression in Tca-8113 cells

3.6 miR-138-5p和EZH2的靶向關(guān)系

生物信息學預(yù)測結(jié)果顯示，miR-138-5p序列上存在與EZH2 3'UTR結(jié)合的連續(xù)位點。與miR-138-5p NC+EZH2 WT組 相 比，miR-138-5p mimics+EZH2 WT組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而miR-138-5p mimics+EZH2 MUT組和miR-138-5p NC+EZH2 MUT組熒光素酶活性無明顯變化。見圖6-7。

圖6 生物信息學預(yù)測miR-138-5p和EZH2 3'UTR結(jié)合位點Figure 6 Bioinformatics prediction of miR-138-5p and EZH2 3'UTR binding sites

3.7 干擾EZH2對Tca-8113細胞增殖和EMT的影響

與Tca-8113組和si-NC組相比，si-EZH2組Tca-8113細胞β-catenin和E-cadherin表達水平顯著升高（P＜0.05），EZH2 mRNA表達水平增殖活性、N-cadherin和vimentin表達水平顯著降低（P＜0.05）。見圖8。

圖8 干擾EZH2對Tca-8113細胞增殖活性和EMT相關(guān)蛋白表達的影響Figure 8 Effect of EZH2 interference on the proliferation activity and EMT-related protein expression of Tca-8113 cells

3.8 過表達EZH2逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-138-5p對Tca-8113細胞凋亡、遷移和侵襲的影響

與miR-138-5p mimics組和miR-138-5p mimics+pcDNA NC組相比，miR-138-5p mimics+pcDNA EZH2組細胞增殖活性、遷移和侵襲能力顯著升高，細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。見圖9。

圖7 雙熒光素酶報告實驗檢測miR-138-5p和EZH2的靶向關(guān)系Figure 7 Targeting relationship between miR-138-5p and EZH2 detected by double luciferase reporter experiment

圖9 過表達EZH2逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-138-5p對Tca-8113細胞凋亡、遷移和侵襲的影響Figure 9 Overexpression of EZH2 reverses the effect of upregulation of miR-138-5p on apoptosis,migration and invasion of Tca-8113 cells

3.9 過表達EZH2逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-138-5p對Tca-8113細胞EMT進程的影響

與miR-138-5p mimics組和miR-138-5p mimics+pcDNA NC組 相 比，miR-138-5p mimics+pcDNA EZH2組Tca-8113細 胞β-catenin和E-cadherin表達水平顯著降低（P＜0.05），N-cadherin和vimentin表達水平顯著升高（P＜0.05）。見圖10。

圖10 過表達EZH2逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-138-5p對Tca-8113細胞EMT相關(guān)蛋白表達的影響Figure 10 Overexpression of EZH2 reverses the effect of upregulation of miR-138-5p on the expression of EMT-related proteins in Tca-8113 cells

4 討論

TSCC是一種常見的口腔癌，約占口腔癌的25%～40%，晚期TSCC患者多產(chǎn)生癌細胞局部浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且術(shù)后常出現(xiàn)復(fù)發(fā)[7]，所以探索新的生物標志物對TSCC早期的診斷治療具有重要的臨床意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，與永生化的舌上皮細胞株Hacta相比，Tca-8113癌細胞miR-138-5p表達水平顯著降低，EZH2 mRNA和蛋白表達水平升高，提示miR-138-5p在TSCC中 低 表 達，EZH2在TSCC中 高 表達。本研究進一步通過生物信息學預(yù)測及雙熒光素酶實驗驗證發(fā)現(xiàn)，miR-138-5p和EZH2存在靶向關(guān)系。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-138-5p對肺癌[8]等癌細胞的增殖、遷移具有抑制作用，其中miR-138-5p可通過靶向調(diào)控TCF3基因抑制胃癌細胞SGC-7901的侵襲和遷移[9]，miR-138靶向AKT1參與舌鱗狀細胞癌的遷移和侵襲[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-138-5p可提高Tca-8113細胞凋亡率及上皮標志蛋白β-catenin、E-cadherin表達水平，降低其增殖活性、侵襲遷移能力及間質(zhì)標記蛋白N-cadherin、vimentin表達水平，提示上調(diào)miR-138-5p可提高Tca-8113細胞凋亡率，降低其增殖活性和EMT的發(fā)生，且上調(diào)miR-138-5p表達也可顯著提高Tca-8113細胞EZH2 mRNA和蛋白表達水平。而EZH2通常在人類癌癥組織中上調(diào)，Jia等[11]研究發(fā)現(xiàn)沉默EZH2可抑制TSCC的增殖和轉(zhuǎn)移，Shih等[12]研究發(fā)現(xiàn)EZH2可作為TSCC發(fā)生的預(yù)測因子，促進TSCC轉(zhuǎn)移。本研究亦發(fā)現(xiàn)，干擾EZH2可抑制Tca-8113增殖活性和EMT進程，而過表達EZH2可逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-138-5p對Tca-8113細胞凋亡、遷移、侵襲和EMT進程的影響。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-138-5p可通過調(diào)控EZH2的表達，逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性，而下調(diào)miR-138-5p可通過激活EZH2，誘導(dǎo)前列腺癌細胞提高多西他賽耐藥性[14]，均與本研究結(jié)果相似。提示miR-138-5p可通過靶向抑制EZH2蛋白表達，抑制Tca-8113細胞增殖、遷移侵襲及EMT進程，促進細胞凋亡。

綜上所述，上調(diào)miR-138-5p可通過靶向抑制EZH2的表達，促進TSCC細胞Tca-8113凋亡，降低其增殖、侵襲遷移能力和EMT進程，有望為TSCC的臨床研究提供潛在可行的靶點。但是miR-138-5p靶基因較多，miR-138-5p也可能通過調(diào)控其他因子或信號通路，影響TSCC細胞生物學行為，這有待后續(xù)深入研究。