崔蕾，司玲，武光杰，張棟，邊百川，胡靜，韓雪

（河北省直屬機(jī)關(guān)第二門診部口腔科，河北 石家莊 050051）

牙周病是一種慢性炎癥性疾病，其特征為不可逆的附著喪失和骨吸收，如果不及時(shí)治療，可最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)甚至脫落，骨再生和修復(fù)是牙周治療的最終目標(biāo)[1]。人牙周膜干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）是一種新發(fā)現(xiàn)的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）亞群，具有多向分化潛能和自我更新能力，在修復(fù)牙周組織方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，是牙周再生所需的重要種子細(xì)胞之一[2]。然而，炎癥會(huì)降低hPDLSC的骨再生能力，導(dǎo)致不可逆的損傷[3]，因此積極探究炎性環(huán)境下參與hPDLSCs成骨分化的機(jī)制并開發(fā)新的治療策略，對實(shí)現(xiàn)牙周組織再生具有重要意義。經(jīng)典的Wnt/β-catenin軸已被確定為人MSCs分化為成骨細(xì)胞的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，激活該信號軸可增強(qiáng)hPDLSCs的增殖和成骨，但其在炎性環(huán)境下的潛在機(jī)制應(yīng)用仍有待探索[4]。補(bǔ)骨脂素已廣泛應(yīng)用于臨床治療骨折、骨缺損和骨質(zhì)疏松癥[5]。研究發(fā)現(xiàn)，其可促進(jìn)骨髓MSCs分化為成骨細(xì)胞[6]，但關(guān)于其對hPDLSCs在炎性環(huán)境下的成骨分化影響報(bào)道較少，故本研究擬通過體外分離培養(yǎng)hPDLSCs，利用腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)炎性環(huán)境，探討炎性環(huán)境下補(bǔ)骨脂素對hPDLSCs成骨分化及Wnt/β-catenin軸的影響，以期為牙周病治療策略制定提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

hPDLSCs來源于前磨牙。前磨牙取自本院20例因正畸需要拔牙的健康個(gè)體，其中男、女各10例，年齡12～16歲，平均年齡（14.05±1.43）歲。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，捐贈(zèng)者知情并書面同意（批準(zhǔn)號：202101）；補(bǔ)骨脂素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，SP8670）購自北京索萊寶生物科技有限公司；α-MEM培養(yǎng)液（C12641800BT）、胎牛血清（10099）購自美國Gibco公司；人TNF-α（HETNP-01022）購自賽業(yè)生物科技有限公司；Stro1-PE（ab190282）、兔抗Wnt3a多克隆抗體（ab28472）、兔抗β-catenin單克隆抗體（ab223075）購自美國Abcam公司；CD146-PE（9811）、CD34-PE（9597）、CD45-PE（MBS670497）購自武漢艾美捷生物科技有限公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）（P0321S）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；茜素紅染色試劑盒（ZY121105）購自上海澤葉科技有限公司；兔抗糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase3β,GSK-3β）（YT782）單克隆抗體購自北京百奧萊德科技有限公司；兔抗p-GSK-3β多克隆抗體（PL0303230）購自PL Laboratories公司；IX73熒光倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司；Infinite M1000 Pro多功能酶標(biāo)儀購自瑞士帝肯公司；GelDoc XR Biorad凝膠成像系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司。

1.2 hPDLSCs體外分離及培養(yǎng)

PBS（含100 u/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）清洗前磨牙，無菌刮取牙周韌帶組織，切碎后移入含I型膠原酶（3 mg/mL）和分散酶Ⅱ（4 mg/mL）消化40 min。為進(jìn)一步分離和純化干細(xì)胞，使用極限稀釋法克隆原代細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液[7]，后將細(xì)胞在含有10%（φ）胎牛血清、100 u/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的α-MEM完全培養(yǎng)液中，于37℃、5%（φ）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天更換1次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)及鑒定。第3～第5代hPDLSCs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行hPDLSCs表型鑒定

酶消化法收集第2代hPDLSCs，PBS洗滌2遍后重懸，分別與Stro1-PE、CD146-PE及CD34-PE、CD45-PE混合，4℃避光孵育1 h，未用熒光抗體處理的細(xì)胞用作對照。PBS洗滌3次后，通過流式細(xì)胞儀采集并分析標(biāo)記的細(xì)胞。

1.4 茜素紅染色檢測hPDLSCs成骨分化能力

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液組成：α-MEM+10 mmol/Lβ-甘油磷酸鹽+0.1 μmol/L地塞米松+50 μg/mL抗壞血酸。取第2代hPDLSCs以每孔1×105個(gè)細(xì)胞密度接種至6孔板，待細(xì)胞達(dá)到90%融合后，更換α-MEM完全培養(yǎng)液為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液并培養(yǎng)21 d，每3天換液1次。后PBS輕輕洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛溶液固定15 min，0.02%茜素紅染色試劑室溫下染色20 min檢測鈣沉積；以α-MEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)組為對照。

1.5 油紅O染色檢測hPDLSCs成脂分化能力

成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液組成：α-MEM+0.5 μmol/L IBMX+200 μmol/L吲哚美辛+1 μmol/L地塞米松+10 μg/mL胰島素+10%胎牛血清。取第2代hPDLSCs以每孔1×105個(gè)細(xì)胞密度接種至6孔板內(nèi)，成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)21 d，每3天換液1次。后PBS洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛溶液固定15 min，油紅O染色30 min檢測脂滴形成；以α-MEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)組為對照。

1.6 hPDLSCs分組、培養(yǎng)

取第3代hPDLSCs以每孔1×105個(gè)細(xì)胞密度接種至6孔板內(nèi)，待細(xì)胞達(dá)到90%融合后，將其分為對照組、TNF-α誘導(dǎo)組及補(bǔ)骨脂素低、中、高劑量組，每組各5個(gè)復(fù)孔。其中對照組細(xì)胞培養(yǎng)液僅為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，TNF-α誘導(dǎo)組細(xì)胞培養(yǎng)液為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液+10 ng/mL TNF-α，補(bǔ)骨脂素低劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液+10 ng/mL TNF-α+2μmol/L補(bǔ)骨脂素，同理，補(bǔ)骨脂素中、高劑量組分別于培養(yǎng)液中添加6、18μmol/L補(bǔ)骨脂素。各組細(xì)胞培養(yǎng)7 d及21 d后進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.7 hPDLSCs ALP染色及活性檢測

各組細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，進(jìn)行ALP染色及活性檢測。PBS洗滌細(xì)胞2～3次，4%多聚甲醛溶液固定30 min，PBS洗滌后加入ALP染色液染色25 min，PBS清洗以清除非特異性染色，鏡下觀察并采集圖片；刮取細(xì)胞于150 μL 0.05% Triton X-100中室溫處理10 min，對細(xì)胞進(jìn)行超聲處理后，12 000 r/min離心10 min后取上清，根據(jù)ALP試劑盒說明書步驟操作，終止反應(yīng)后標(biāo)準(zhǔn)孔及ALP孔顯示不同深淺的黃色，利用酶標(biāo)儀于405 nm處測定吸光度值（A），根據(jù)試劑盒ALP活性單位定義定量ALP活性。

1.8 茜素紅染色檢測hPDLSCs鈣沉積

各組細(xì)胞培養(yǎng)21 d后，進(jìn)行茜素紅染色及鈣沉積相對量檢測。茜素紅染色步驟同“1.4”項(xiàng)下；為量化鈣沉積情況，染色觀察后，PBS輕輕洗滌細(xì)胞1～2遍，于6孔板內(nèi)加入10%氯化十六烷基吡啶以溶解礦化結(jié)節(jié)，測定562 nm波長處的比色吸光度。

1.9 RT-qPCR檢測成骨分化相關(guān)因子mRNA表達(dá)

各組細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，進(jìn)行RT-qPCR檢測。Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，檢測其完整性及純度合格后，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，制備RT-qPCR反應(yīng)體系并上機(jī)檢測，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性10 min，95 °C變性10 s，60 °C退火20 s，70 °C延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列：Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt related transcription factor 2，Runx2）：F：5′-CAC TGGCGCTGCAACAAGA-3′，R：5′-CATTCCGGAG CTCAGCAGAATA-3′；鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（Osterix，Osx）：F：5′-AGAGATCTGAGCTGGGTAGAGG-3′，R：5′-AAGAGAGCCTGG CAAGAGG-3′；骨橋蛋白（osteopontin，OPN）：F：5′-AGGCTGATTCTGGAA GTT CTG-3′；R：5′-CTTACTTGGAAGGGGTCTG TGG-3′；骨鈣素（osteocalcin，OCN）：F：5′-CTCCTT ACCCGGATCCCCTG-3′，R：5′-GTAGAAGCGCT GGTAGGCGT-3′；GAPDH，F(xiàn)：5′-ATTTGGTCGTAT TGGGCG-3′，R：5′-TGGAAGATGGGTGATGGG ATT-3′。

1.10 Western blot檢測Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)

各組細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，RIPA裂解液裂解細(xì)胞并收集總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。等量加樣蛋白于10%SDS-PAGE孔并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉膜抗體2 h，后直接與對應(yīng)一抗4 °C孵育過夜（均1∶1 000稀釋），TBST洗滌3次，每次10 min，后于二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，膜與ECL顯影試劑反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光條帶，Image J軟件量化條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示蛋白的相對表達(dá)量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多組間單因素方差分析和兩組間LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)量結(jié)果均以表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hPDLSCs表型鑒定

流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)顯示hPDLSCs高表達(dá)MSCs標(biāo)志物CD146和Stro-1，幾乎不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34和白細(xì)胞標(biāo)志物CD45。見圖1。

圖1 hPDLSCs表面抗體鑒定Figure 1 Identification of surface markers of hPDLSCs

2.2 hPDLSCs成骨分化潛能

茜素紅染色結(jié)果顯示，體外分離培養(yǎng)的hPDLSCs具有成骨分化潛能，成骨誘導(dǎo)21 d后可見礦化鈣沉積物形成，見圖2。

圖2 hPDLSCs茜素紅染色圖（200×）Figure 2 Alizarin red staining diagram of hPDLSCs(200×)

2.3 hPDLSCs成脂分化潛能

油紅O染色結(jié)果顯示，體外分離培養(yǎng)的hPDLSCs具有成脂分化潛能，成脂誘導(dǎo)21 d后可見脂滴形成，見圖3。

圖3 hPDLSCs油紅O染色圖（200×）Figure 3 Oil red O staining diagram of hPDLSCs(200×)

2.4 補(bǔ)骨脂素對炎性環(huán)境下hPDLSCs ALP活性的影響

與對照組比較，其他4組hPDLSCs ALP活性降低（P＜0.05）；與TNF-α誘導(dǎo)組比較，補(bǔ)骨脂素低、中、高劑量組ALP活性逐漸升高（P＜0.05）。見圖4，表1。

表1 炎性環(huán)境下hPDLSCs ALP活性比較Table 1 Comparison of ALP activity of hPDLSCs in inflammatory environment(±s,n=5）ρ/(u·g prot-1)

表1 炎性環(huán)境下hPDLSCs ALP活性比較Table 1 Comparison of ALP activity of hPDLSCs in inflammatory environment(±s,n=5）ρ/(u·g prot-1)

與對照組比較：*P＜0.05；與TNF-α誘導(dǎo)組比較：#P＜0.05；與補(bǔ)骨脂素低劑量組比較：@P＜0.05；與補(bǔ)骨脂素中劑量組比較：&P＜0.05。

組別對照組TNF-α誘導(dǎo)組補(bǔ)骨脂素低劑量組中劑量組高劑量組ALP活性274.85±19.09 76.80±6.81*107.93±9.23*#153.06±12.70*#@214.66±15.26*#@&

圖4 hPDLSCs ALP染色圖（100×）Figure 4 ALP staining diagram of hPDLSCs(100×)

2.5 補(bǔ)骨脂素對炎性環(huán)境下hPDLSCs礦化鈣沉積的影響

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，其他4組hPDLSCs礦化鈣沉積吸光度值降低（P＜0.05）；與TNF-α誘導(dǎo)組比較，補(bǔ)骨脂素低、中、高劑量組hPDLSCs礦化鈣沉積吸光度值逐漸升高（P＜0.05）。見圖5，表2。

表2 炎性環(huán)境下hPDLSCs礦化鈣沉積比較Table 2 Comparison of mineralized calcium deposition of hPDLSCs in inflammatory environment(±s,n=5)

表2 炎性環(huán)境下hPDLSCs礦化鈣沉積比較Table 2 Comparison of mineralized calcium deposition of hPDLSCs in inflammatory environment(±s,n=5)

與對照組比較：*P＜0.05；與TNF-α誘導(dǎo)組比較：#P＜0.05；與補(bǔ)骨脂素低劑量組比較：@P＜0.05；與補(bǔ)骨脂素中劑量組比較：&P＜0.05。

組別對照組TNF-α誘導(dǎo)組補(bǔ)骨脂素低劑量組中劑量組高劑量組A 3.28±0.11 1.12±0.07*1.57±0.07*#2.18±0.05*#@3.04±0.08*#@&

圖5 各組hPDLSCs茜素紅染色圖（100×）Figure 5 Alizarin red staining of hPDLSCs in each group(100×)

2.6 補(bǔ)骨脂素對炎性環(huán)境下成骨分化相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

與對照組比較，其他4組hPDLSCs中Runx2、Osx、OPN及OCN mRNA相對表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與TNF-α誘導(dǎo)組比較，補(bǔ)骨脂素3個(gè)治療組hPDLSCs中Runx2、Osx、OPN及OCN mRNA相對表達(dá)水平均升高（P＜0.05）。見表3。

表3 炎性環(huán)境下hPDLSCs成骨分化因子mRNA表達(dá)水平比較Table 3 Comparison of osteogenic differentiation factor mRNA expression levels of hPDLSCs in inflammatory environment(±s,n=5)

表3 炎性環(huán)境下hPDLSCs成骨分化因子mRNA表達(dá)水平比較Table 3 Comparison of osteogenic differentiation factor mRNA expression levels of hPDLSCs in inflammatory environment(±s,n=5)

與對照組比較：*P＜0.05；與TNF-α誘導(dǎo)組比較：#P＜0.05；與補(bǔ)骨脂素低劑量組比較：@P＜0.05；與補(bǔ)骨脂素中劑量組比較：&P＜0.05。

組別對照組TNF-α誘導(dǎo)組補(bǔ)骨脂素低劑量組中劑量組高劑量組Runx2 1.02±0.01 0.24±0.03*0.36±0.03*#0.53±0.05*#@0.82±0.04*#@&Osx 1.00±0.01 0.31±0.02*0.38±0.02*#0.60±0.03*#@0.79±0.03*#@&OPN 1.01±0.02 0.23±0.04*0.29±0.02*#0.45±0.05*#@0.69±0.06*#@&OCN 1.01±0.02 0.27±0.03*0.38±0.02*#0.57±0.03*#@0.81±0.05*#@&

2.7 補(bǔ)骨脂素對炎性環(huán)境下Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

各組hPDLSCs中GSK-3β蛋白相對表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對照組比較，其他4組hPDLSCs中Wnt3a、β-catenin及p-GSK-3β蛋白相對表達(dá)水平降低，CTSK蛋白相對表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與TNF-α誘導(dǎo)組比較，補(bǔ)骨脂素3個(gè)治療組hPDLSCs中Wnt3a、β-catenin及p-GSK-3β蛋白相對表達(dá)水平均升高，CTSK蛋白相對表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖6，表4。

圖6 Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況Figure 6 Expression of Wnt/β-catenin pathway related proteins

表4 炎性環(huán)境下hPDLSCs信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of signal pathway related protein expression levels of hPDLSCs in inflammatory environment(±s,n=5)

表4 炎性環(huán)境下hPDLSCs信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of signal pathway related protein expression levels of hPDLSCs in inflammatory environment(±s,n=5)

與對照組比較：*P＜0.05；與TNF-α誘導(dǎo)組比較：#P＜0.05；與補(bǔ)骨脂素低劑量組比較：@P＜0.05；與補(bǔ)骨脂素中劑量組比較：&P＜0.05。

組別對照組TNF-α誘導(dǎo)組補(bǔ)骨脂素低劑量組中劑量組高劑量組0.67±0.07 0.24±0.04*0.29±0.02*#0.38±0.03*#@0.55±0.04*#@&0.83±0.05 0.19±0.03*0.28±0.02*#0.42±0.03*#@0.62±0.03*#@&0.56±0.03 0.57±0.03 0.56±0.02 0.58±0.03 0.57±0.02 0.52±0.03 0.17±0.02*0.22±0.02*#0.34±0.03*#@0.46±0.04*#@&0.19±0.03 0.57±0.03*0.51±0.02*#0.34±0.02*#@0.25±0.02*#@&Wnt3a β-catenin GSK-3β p-GSK-3β CTSK

3 討論

研究表明，長期存在的慢性炎癥環(huán)境可改變細(xì)胞表觀遺傳特征并降低牙周組織的再生能力，是牙周組織喪失的主要因素[8]。TNF-α是由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要促炎因子，其過度釋放可導(dǎo)致牙槽骨、牙槽窩及牙齒支撐組織缺損等，且對hPDLSCs的成骨分化具有破壞性作用[9]。因此，于體外靶向TNF-α誘導(dǎo)的炎性環(huán)境并提高該環(huán)境下hPDLSCs的成骨分化能力可能是牙周炎臨床治療的重要策略之一。據(jù)報(bào)道，TNF-α濃度高于1 ng/mL（10、100 ng/mL）時(shí)，可呈劑量依賴性抑制成骨分化[10]，使用10 ng/mL TNF-α處理健康的PDLSCs可模擬牙周炎患者中PDLSCs成骨和再生能力受損[11]；ALP是一種位于細(xì)胞膜中的鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞成熟和鈣化，ALP活性和細(xì)胞鈣化水平分別為早期、晚期的成骨分化指標(biāo)[12]。本研究利用牙周韌帶組織體外分離并培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)分子表型及功能鑒定后，確定所培養(yǎng)的細(xì)胞為具有多向分化潛能的hPDLSCs；另于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中添加10 ng/mL TNF-α后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞ALP活性及礦化鈣沉積程度顯著降低，提示TNF-α添加可成功誘導(dǎo)炎性環(huán)境且對體外分離培養(yǎng)的hPDLSCs具有成骨分化抑制作用，可用于本研究的后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)。

補(bǔ)骨脂素具有抗炎、抗菌、抗骨質(zhì)疏松等多種藥理活性[13]，研究表明，其可抑制TNF-α誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞炎癥[14]，增加骨質(zhì)疏松模型中的骨強(qiáng)度和骨小梁微結(jié)構(gòu)，提高ALP的活性及礦結(jié)節(jié)數(shù)量，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[15]。另有研究結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂素可下調(diào)炎癥狀態(tài)下的hPDLCs炎性細(xì)胞因子水平[16]，呈劑量依賴性地抑制牙周炎細(xì)菌數(shù)量，減輕牙周炎小鼠的牙槽骨丟失和炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)hPDLCs ALP活性[17]。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂素可增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)炎性環(huán)境下的hPDLSCs的ALP活性并提高礦化鈣沉積水平，且作用效果呈劑量性依賴，提示補(bǔ)骨脂素可能通過抑制TNF-α作用，降低培養(yǎng)環(huán)境內(nèi)的炎性水平，從而改善hPDLSCs表型狀態(tài)，減輕細(xì)胞分化能力損傷，進(jìn)而促進(jìn)成骨分化。骨形成的分子機(jī)制涉及增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成熟和礦化，它們由各種關(guān)鍵分子協(xié)調(diào)，Runx2為成骨過程所必需的最重要的轉(zhuǎn)錄因子，負(fù)責(zé)成骨細(xì)胞分化標(biāo)記基因的激活；OPN和OCN是成骨細(xì)胞的兩個(gè)典型生物標(biāo)志物，在骨形成和修復(fù)過程中參與成骨分化和細(xì)胞外基質(zhì)的礦化；Osx是一種新型含鋅指的成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，對成骨細(xì)胞分化、增殖和骨形成至關(guān)重要，可調(diào)節(jié)許多成骨因子的表達(dá)，包括Runx2、骨連接蛋白、骨橋蛋白、OCN和ALP[4]，研究發(fā)現(xiàn)，骨形成時(shí)，Runx2、OPN、OCN和Osx表達(dá)上調(diào)[18]。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂素組炎性環(huán)境下hPDLSCs中Runx2、OPN、OCN和Osx mRNA相對表達(dá)水平顯著提高，表明補(bǔ)骨脂素可通過上調(diào)成骨相關(guān)基因表達(dá)促進(jìn)成骨分化。

多項(xiàng)研究表明，Wnt/β-catenin信號通路激活可促進(jìn)多種干細(xì)胞和成骨細(xì)胞的成骨分化[19-20]。Wnts與細(xì)胞表面受體復(fù)合物結(jié)合后，GSK-3β磷酸化可抑制其自身激活以及隨后的β-catenin磷酸化，從而減少細(xì)胞質(zhì)中β-catenin降解，啟動(dòng)β-catenin細(xì)胞內(nèi)積累，上調(diào)的β-catenin轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核刺激下游相關(guān)基因表達(dá)[21]。Wnt3a是一種已知的經(jīng)典Wnt蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)其表達(dá)及β-catenin、p-GSK-3β水平可抑制血管平滑肌細(xì)胞鈣化及成骨細(xì)胞分化[22]；另有研究結(jié)果顯示，地塞米松可增強(qiáng)炎性條件下人成牙骨質(zhì)細(xì)胞中的Wnt3a、β-catenin和p-GSK-3β表達(dá)，通過Wnt信號通路刺激成牙骨質(zhì)細(xì)胞生長及分化[23]。CTSK是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，由破骨細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)，被高度認(rèn)為是破骨細(xì)胞的良好標(biāo)記基因，沉默CTSK可抑制牙周病灶區(qū)炎癥進(jìn)而治療牙周病[24]；另有報(bào)道稱，通過激活Wnt/βcatenin信號傳導(dǎo)下調(diào)CTSK表達(dá)可抑制去卵巢大鼠的頜骨骨質(zhì)疏松癥[25]。本研究結(jié)果顯示，炎性條件下Wnt3a、β-catenin、p-GSK-3β表達(dá)水平降低，提示W(wǎng)nt/β-catenin軸被抑制；補(bǔ)骨脂素作用后，Wnt3a、β-catenin及p-GSK-3β蛋白相對表達(dá)水平均上調(diào)，CTSK蛋白表達(dá)下調(diào)，提示補(bǔ)骨脂素可能通過激活Wnt/β-catenin軸抑制CTSK蛋白表達(dá)，進(jìn)而減輕培養(yǎng)環(huán)境中的TNF-α促炎作用并利于hPDLSCs中成骨相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)hPDLSCs成骨分化發(fā)生。

綜上所述，補(bǔ)骨脂素可促進(jìn)炎性環(huán)境下hPDLSCs成骨分化，其作用機(jī)制可能與激活Wnt/βcatenin軸下調(diào)CTSK表達(dá)有關(guān)，為牙周炎發(fā)病機(jī)制及臨床治療提供了一定的基礎(chǔ)依據(jù)。