趙 湘 馮 潔 王瀟瀟 葛化冰

牙周炎是由牙菌斑微生物引發(fā)的、發(fā)生在牙周支持組織(牙齦、牙槽骨、牙周膜、牙骨質(zhì)等)的慢性、感染性疾病，可導(dǎo)致軟組織炎癥、牙槽骨丟失[1,2]。牙周感染不僅影響口腔健康，還與多種疾病相關(guān)，如心腦血管疾病、中風(fēng)、新生兒早產(chǎn)和低體重等[3]，對(duì)患者的生存質(zhì)量亦會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。牙周炎的診斷目前主要依靠影像學(xué)技術(shù)和牙周檢查指數(shù)包括牙周探診深度、臨床附著喪失等，具有一定的滯后性[4]，且不適用于大規(guī)模的臨床篩查。齦溝液來源于齦溝或者牙周袋，能密切反映牙周組織狀態(tài)的改變，是評(píng)估牙周健康或疾病的重要量化指標(biāo)，但是成年人每天齦溝液的分泌量有限，僅0.5～2.4ml，且在收集的過程中，易受唾液、細(xì)菌菌斑等的污染，單個(gè)位點(diǎn)采集的齦溝液所包含的信息量有限，不能有效反映全口腔的牙周狀況[5]。唾液含有免疫球蛋白、酶、大量電解質(zhì)及黏蛋白等成分，能有效反映口腔衛(wèi)生或疾病狀況，臨床快速篩查具有高靈敏度和高效益的特點(diǎn)[6]。牙菌斑生物膜并不是細(xì)菌的簡(jiǎn)單堆積，而是多種微生物組成的生物群落，多種細(xì)菌通過相互交錯(cuò)的信號(hào)傳導(dǎo)通路協(xié)調(diào)作用，具有高度的結(jié)構(gòu)性[7]。有研究[8]表明，牙周病患者的菌斑中存在大量的致病微生物。由于牙周病病因不明確，牙周檢查依賴于檢查者的診斷經(jīng)驗(yàn)，主觀性較強(qiáng)，結(jié)合個(gè)人病史、影像學(xué)檢查，往往錯(cuò)過疾病的早期診斷，遺漏潛在病灶。因此，尋找有效、客觀且能反映疾病進(jìn)展的相關(guān)指標(biāo)至關(guān)重要。本研究通過檢測(cè)并比較不同嚴(yán)重程度的牙周炎患者唾液生物標(biāo)志物以及菌斑生物膜致病菌水平，探究牙周炎患者不同疾病嚴(yán)重程度與生物標(biāo)志物水平間的關(guān)系。

1.資料和方法

1.1 一般資料 選擇2018 年6 月-2021 年3 月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院收治的牙周炎患者126 例作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＞60歲；②符合《牙周病診療指南》[9]制定的牙周炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；③口內(nèi)6 個(gè)區(qū)段至少有一個(gè)區(qū)段功能牙≥2 顆；④1 年內(nèi)未進(jìn)行牙周治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有糖尿病、自身免疫性疾病、全身性疾病、代謝性骨疾病史；②合并胃癌、食管癌及其他惡性腫瘤、急慢性感染疾病；③近3 個(gè)月內(nèi)曾服用抗生素/ 非甾體類藥物；④患有胃靜脈曲張、門靜脈高壓性胃??；⑤臨床資料不全。研究組患者平均年齡(67.54±4.16)歲，男性69 例，女性57 例。同期于體檢中心進(jìn)行口腔檢查，符合《牙周病診療指南》 中牙齦健康者126 例健康者作為對(duì)照組，對(duì)照組平均年齡(67.83±4.57)歲，男性65 例，女性61 例，研究組患者和對(duì)照組患者的年齡、性別均無顯著差異。本研究已經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過。

1.2 研究方法

1.2.1 口腔檢查 每位研究者均選取6 顆指數(shù)牙，即代表性牙位16、11、26、36、31、46，若有缺失則以該牙相鄰的牙位代替。每顆牙檢查6 個(gè)位點(diǎn)：近頰、正中頰、遠(yuǎn)頰、近舌、正中舌、遠(yuǎn)舌。采用Hufriedy 刻度探針，測(cè)定并記錄所有研究對(duì)象的附著喪失(attachment loss，AL)、探診深度(probing depth，PD)、探診出血(Rleeding on probing，ROP)。研究組患者進(jìn)行口腔影像學(xué)檢查，聯(lián)合口腔檢查判別疾病的嚴(yán)重程度。牙周病的嚴(yán)重程度分級(jí)，輕度：AL＜3mm，PD≤4mm，影像學(xué)檢查結(jié)果顯示牙槽骨吸收＜根長(zhǎng)的1/ 3；中、重度牙周?。篈L≥3mm，PD＞4mm，影像學(xué)檢查結(jié)果顯示牙槽骨吸收≥根長(zhǎng)的1/ 3。研究組患者根據(jù)牙周病嚴(yán)重程度分為兩個(gè)亞組，即輕度組和中重度組。

1.2.2 唾液收集及相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 禁食禁水1 個(gè)小時(shí)以上，采用無菌容器收集每個(gè)研究對(duì)象的唾液(2～5ml)，離心(4℃，8000rpm，5min)后收集上清液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(1)牙周組織炎癥標(biāo)記物的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)唾液中白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-8(Interleukin-8，IL-8)、白介素-10(Interleukin-10，IL-10)、腫瘤壞死因子-α(Yumor necrosis factor-α，YNF-α)水平。

(2)牙周組織破壞標(biāo)記物的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)唾液中基質(zhì)金屬蛋白酶-8(matrix metalloproteinases-8，MMP-8)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)水平。

1.2.3 菌斑生物膜中定殖細(xì)菌的檢測(cè) 采用無菌齦下刮治器從研究對(duì)象牙齒(所有指數(shù)牙)的近中頰面處收集齦下菌斑，置于無菌且含有500μL PRS的EP 管中，離心(4℃，13000rpm，5min)，-80℃保存用于DNA 的提取。采用探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timequantitativepolymerasechain reaction，RY-qPCR)檢測(cè)牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)、福賽坦氏菌(Yannerrellaforsythia,Y.forsythia)和齒垢密螺旋體(Yreponemadenticola,Y.denticola)水平。引物序列見表1。

表1 RY-qPCR的引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用率(n,%)表示，組間差異采用卡方檢驗(yàn)；符合標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的計(jì)量資料采用()表示，多組組間差異采用方差分析，若P＜0.05，每?jī)山M組間差異采用SNK 檢驗(yàn)；不符合標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的計(jì)量資料，采用四分位數(shù)表示，組間差異采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 牙周健康指標(biāo)的比較 研究組患者的PD值、AL 值以及ROP 陽性率均顯著高于對(duì)照組，且在研究組中，中重度患者的指標(biāo)水平較輕度組均有顯著提高，見表2。

表2 牙周健康指標(biāo)的比較

2.2 唾液生物標(biāo)志物水平的比較 研究組患者較對(duì)照組IL-1β、IL-8、MMP-8、MMP-9 水平均顯著提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；研究組中，中重度組患者的唾液IL-1β、IL-8、MMP-8、MMP-9水平顯著高于輕度組患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 唾液生物標(biāo)志物水平的比較

2.3 菌斑生物膜中三種細(xì)菌菌量值比較 研究組患者檢測(cè)的3 種細(xì)菌菌量顯著高于對(duì)照組，且研究組中中重度牙周病患者，菌斑生物膜檢測(cè)的細(xì)菌量顯著高于輕度組患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表4 菌斑生物膜中三種細(xì)菌菌量值比較

2.4 牙周基礎(chǔ)治療后唾液生物標(biāo)志物水平的比較 經(jīng)牙周基礎(chǔ)治療后，研究組IL-1β、IL-8、MMP-8、MMP-9 水平均顯著降低，但是較對(duì)照組水平依舊較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表5。

表5 牙周基礎(chǔ)治療后唾液生物標(biāo)志物水平的比較

3.討論

牙周病是導(dǎo)致成人失牙的首要原因，采取有效的治療措施對(duì)于患者牙齒的留存、使用周期至關(guān)重要。目前，臨床針對(duì)牙周病的檢測(cè)，主要集中于齦溝液生物標(biāo)志物的檢測(cè)，臨床應(yīng)用尚存在一定的局限性。在本研究中，收集所有研究對(duì)象的唾液作為樣本，具有非侵入性、客觀、便攜、易操作的優(yōu)點(diǎn)[10]，測(cè)定了牙周組織炎癥標(biāo)記物IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 以及YNF-α，還測(cè)定了牙周組織破壞標(biāo)記物MMP-8、MMP-9。本研究同時(shí)檢測(cè)了齦下菌斑中的微生物牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)、福賽坦氏菌(Yannerrellaforsythia,Y.forsythia)和齒垢密螺旋體(Yreponemadenticola,Y.denticola)，即“紅色復(fù)合體(red complex)”，紅色復(fù)合體是世界牙周病研討會(huì)公認(rèn)的牙周病主要的致病菌群[11]。

本研究結(jié)果表明，牙周炎患者唾液IL-1β、IL-8 水平均顯著提高。唾液中含有多種蛋白質(zhì)，在維持口腔穩(wěn)定的過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)口腔穩(wěn)態(tài)被打破，宿主在免疫應(yīng)答的過程中產(chǎn)生了大量的細(xì)胞因子，包括IL-1β、IL-6、IL-18、IFN-γ等。在牙周組織炎癥反應(yīng)開始期間，細(xì)胞因子從上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及結(jié)締組織成纖維細(xì)胞和中釋放出來[12]。本研究中，中重度牙周炎患者唾液IL-1β、IL-8 水平較輕度牙周炎患者水平升高，其水平與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。有研究[13]表明，IL-1β 與牙周炎癥參數(shù)間存在關(guān)聯(lián)，不僅能反映疾病的嚴(yán)重程度，還能評(píng)估患者的治療效果。

隨著牙周炎的進(jìn)展，牙周組織被破壞，相關(guān)的酶如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等被釋放到唾液中。有研究[14]表明，隨著牙周病變程度的加深，齦溝液中的MMP-8 水平逐漸增加。當(dāng)牙周炎癥開始時(shí)，細(xì)胞因子釋放，MMPs 等相關(guān)的酶釋放，導(dǎo)致結(jié)締組織膠原蛋白的降解。當(dāng)結(jié)締組織炎癥、降解之后，進(jìn)一步向齦溝液、牙周袋轉(zhuǎn)移，隨后釋放到唾液中。有研究[15]表明，MMP-8、MMP-9 在診斷牙周炎時(shí)具有很高的診斷價(jià)值。本研究中，輕度牙周炎患者的MMP-8、MMP-9 水平較中重度患者低，可反應(yīng)疾病的嚴(yán)重程度。

本研究中，評(píng)估了所有研究對(duì)象齦下菌斑中的致病微生物，結(jié)果表明，牙周炎患者菌斑中致病微生物水平顯著提高。有研究[16]表明，牙周病患者的臨床表現(xiàn)與炎癥水平、菌斑生物膜均有關(guān)聯(lián)，牙周基礎(chǔ)治療后，齦下菌斑中的紅色復(fù)合體顯著降低。牙周致病菌并不是單獨(dú)存在，而是在齦下菌斑內(nèi)共聚，以復(fù)合體的形式被發(fā)現(xiàn)，協(xié)同致病[17]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)牙周基礎(chǔ)治療后，患者唾液中的IL-1β、IL-8、MMP-8、MMP-9 水平較治療前有所降低，但是較健康對(duì)照組仍顯著升高，推測(cè)可能與參與疾病本身有關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)，中重度牙周炎患者齦下致病菌數(shù)量較輕度患者顯著升高，提示致病微生物濃度與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。

綜上所述，牙周病患者唾液炎癥因子標(biāo)志物及牙周組織破壞標(biāo)志物水平均顯著提高，且與疾病嚴(yán)重程度間存在關(guān)聯(lián)；牙周病患者齦下菌斑中致病菌水平顯著提高，且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究為橫斷面研究，納入的樣本量較小，旨在探究牙周疾病及疾病嚴(yán)重程度患者，唾液生物標(biāo)志物及菌斑致病菌水平間的差異，為進(jìn)一步臨床研究提供科學(xué)依據(jù)。