努爾比艷·克尤木，曹浩然，何雨璇，辛銘秀，馬海平

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830054)

心血管疾病是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致人類死亡的首要原因[1]，伴隨著我國人口老齡化進(jìn)程的加速，心血管疾病的發(fā)病率也在逐年上升。心血管疾病患者圍術(shù)期由于各種原因?qū)е氯毖?再灌注(ischemia/ reperfusion, I/R)損傷是誘發(fā)心臟不良事件的主要原因。如何有效防范I/R損傷的研究很多，但真正有效且能夠?qū)崿F(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的方法還很有限，其中吸入麻醉劑七氟醚后處理(Sevoflurane Postconditioning, SPostC)能夠發(fā)揮缺血/缺氧預(yù)處理相類似的心肌保護(hù)效應(yīng)，能夠有效對抗健康心肌I/R損傷被普遍認(rèn)可[2]，臨床研究也證實(shí)了SPostC能夠顯著降低圍術(shù)期并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率[3]。

巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)廣泛表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞中，已有研究表明在缺血后處理對抗心肌I/R損傷過程中，MIF發(fā)揮了重要的保護(hù)作用[4]。腺苷酸活化蛋白激酶 (AMPK)是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝的中心點(diǎn)和能量狀態(tài)的主要傳感器[5]，并作為MIF調(diào)控的下游靶蛋白。本研究旨在探索MIF-AMPK信號通路在SPostC對抗心肌I/R損傷過程中的作用機(jī)制，為臨床實(shí)現(xiàn)治療I/R奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1試劑和抗體培養(yǎng)基：購自GIBCO，貨號：11966-025；青霉素/鏈霉素，胎牛血清，胰蛋白酶均購自GIBCO，MIFELISA檢測試劑盒購自武漢華美，貨號：CSB-E07293r；CCK-8細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒(全式金生物，中國，F(xiàn)C101-03)；活性氧(ROS)測定試劑盒(南京建成，貨號：E004)；AcCoA含量檢測試劑盒(索萊寶，貨號：BC0980)；ATP 試劑盒(南京建成，貨號：A095-1)、ADP比色法檢測試劑盒(sigma，美國，MAK081-1KT)；AMPKα和Phospho-AKT(CST，貨號：5831s / 50081s)；MIF阻滯劑ISO-1(Selleck，美國，貨號：S7732)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力康儀器有限公司，型號：Smart Cell HF-90)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與建模大鼠胚胎心肌細(xì)胞系H9C2購自凱基生物；H/R損傷模型的建立：將H9C2心肌細(xì)胞置于不含血清的無糖細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，缺氧處理是指在含有95%N2和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，復(fù)氧處理為將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于95%空氣和5%CO2、37°培養(yǎng)箱中孵育3 h。

1.3SPostC的方法參考本課題組前期的研究方法[6-7]，使用Vapor 2000七氟醚蒸發(fā)器(Drager，德國呂貝克)來施加含97.6%O2和2.4%七氟醚的混合氣體。將細(xì)胞暴露于充滿97.6%O2和2.4%七氟醚的混合氣體的培養(yǎng)箱中至少15 min，直到培養(yǎng)箱中達(dá)到所需的七氟醚濃度(2.4%)。培養(yǎng)箱出口處使用麻醉分析儀(Drager Vamous，德國)監(jiān)測七氟醚和O2的濃度。氣體流速為2 L/min。將細(xì)胞處理15 min后，立即將其取出并在5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育,在37°C下放置165 min。

1.4實(shí)驗(yàn)分組孵育24 h的H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組(圖1)：(1)空白對照組(Control組)：H9C2心肌細(xì)胞置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)48 h不給任何干預(yù)措施；(2)缺氧/復(fù)氧組(H/R組)：H9C2心肌細(xì)胞置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)42 h后，放置于三氣體培養(yǎng)箱中實(shí)施H/R，分別為3 h；(3)SPostC組(H/R+SPostC組)：H9C2心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)42 h后，將細(xì)胞置于三氣培養(yǎng)箱缺氧3 h;復(fù)氧開始前給予2.4%七氟醚15 min，隨后在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)165 min;(4)MIF抑制劑組(H/R+SPostC+ ISO-1組)：H9C2心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)40 h后，使用含有5 μmol/L ISO-1的培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)直至實(shí)驗(yàn)完成，共8 h。在此過程中于干預(yù)2 h后，將細(xì)胞置入三氣培養(yǎng)箱缺氧3 h。在復(fù)氧開始前實(shí)施SPostC 15 min，隨后在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)165 min。

1.5實(shí)驗(yàn)指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 CCK-8法檢測 細(xì)胞存活率取生長狀態(tài)良好匯合率達(dá)90%的H9C2細(xì)胞，采用胰酶進(jìn)行消化處理，再用完全培養(yǎng)基制備成5 000 Cells/mL細(xì)胞懸液，在96孔板中配置100 μL的5 000 Cells/mL細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h(37℃，5%CO2)。按1.4實(shí)驗(yàn)分組的處理后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL配置好的10% CCK-8溶液，然后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育，1 h后酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度的OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5.2 ELISA檢測 細(xì)胞上清液中MIF蛋白的水平取生長狀態(tài)良好的H9C2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化處理后，制備成5 000 Cells/mL細(xì)胞懸液，接種至24孔板中；按1.4實(shí)驗(yàn)分組處理后，收集各組細(xì)胞上清液，進(jìn)行MIF水平檢測。檢測方法嚴(yán)格按照ELISA實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

1.5.3 生化指標(biāo)含量檢測 同上方法制備細(xì)胞懸液，接種至6孔板中；按1.4實(shí)驗(yàn)分組處理后，收集各組細(xì)胞進(jìn)行生化指標(biāo)檢測。采用比色法檢測二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、乙酰輔酶A (AcCoA)，采用熒光比色法檢測活性氧(ROS)，方法嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.5.4 qRT-PCR檢測 AMPKα基因表達(dá)水平按照上述分組進(jìn)行處理后，按照常規(guī)qRT-PCR檢測操作步驟實(shí)施。RNA提取，合成第一鏈cDNA；引物的設(shè)計(jì)，定量PCR步驟：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性5 s，60℃退火/延伸30 s，重復(fù)40個循環(huán)。

1.5.5 WB檢測AMPKα、p-AMPKα蛋白表達(dá)水平按照上述分組進(jìn)行處理后，按照常規(guī)Western Blot檢測的操作步驟，檢測AMPKα、p-AMPKα蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.14組細(xì)胞增殖檢測結(jié)果比較采用H9C2心肌細(xì)胞建立H/R損傷模型，采用CCK-8檢測細(xì)胞增殖評價心肌細(xì)胞的活性。與Control組相比，其余3組的細(xì)胞增殖百分比均顯著下降(P<0.05)；與H/R組相比，H/R+SPostC組的細(xì)胞增殖百分比明顯增加；與H/R+SPostC組相比，H/R+SPostC+ISI-1組的細(xì)胞增殖百分比顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表1)。

表1 4組細(xì)胞增殖檢測結(jié)果比較

2.24組MIF表達(dá)水平比較與Control組比較，其余3組MIF表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)，與H/R組比較，H/R+SPostC組MIF的表達(dá)水平顯著增加，而H/R+SPostC+ISI-1組顯著下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與H/R+SPostC組相比，H/R+SPostC+ISI-1組MIF的水平顯著降低(P<0.01，詳見表2。

表2 4組MIF表達(dá)水平比較

2.34組MPKα基因mRNA水平比較采用qRT-PCR檢測各組AMPKα基因mRNA表達(dá)，結(jié)果表明各組間AMPKα的mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 4組細(xì)胞中AMPKα基因mRNA水平比較

2.44組AMPKα和p-AMPKα表達(dá)水平比較采用Western Blot檢測AMPKα和p-AMPKα表達(dá)水平，與Control組相比AMPKα表達(dá)水平在各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而H/R+SPostC組中p-AMPKα表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與H/R組相比，H/R+SPostC組p-AMPKα的水平顯著增加，而H/R+SPostC+ISO-1較H/R+SPostC組有所降低(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 4組AMPKα和p-AMPKα表達(dá)水平比較

2.54組ATP、ADP、AcCoA、ROS含量比較為探索MIF-AMPK信號通路對能量代謝和線粒體應(yīng)激反應(yīng)的影響，采用比色法檢測ATP、ADP、AcCoA含量；采用熒光比色法檢測ROS的含量。與Control組相比，其余3組ADP、ATP的合成均顯著減少，與H/R+SPostC組比較，H/R+SPostC+ISO-1組ADP、ATP含量均顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+SPostC組和H/R+SPostC+ISO-1組ATP含量顯著增加，而H/R+SPostC+ISO-1組ATP含量較H/R+SPostC組有所降低(P<0.05)。見表5。

與Control組比較，H/R組和H/R+SPostC+ISO-1組的AcCoA含量顯著增加；與H/R比較，H/R+SPostC組AcCoA含量顯著降低(P<0.05)；與H/R+SPostC組比較，H/R+SPostC+ISO-1組AcCoA含量顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

與Control組比較，其余3組ROS的含量顯著增加；與H/R組比較，H/R+SPostC和H/R+SPostC+ISO-1組ROS的含量顯著降低；與H/R+SPostC比較，H/R+SPostC+ISO-1組ROS含量顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 4組ATP、ADP、AcCoA、ROS含量比較

3 討論

本研究采用H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)，建立H/R損傷模型，給予SPostC以及采用MIF阻滯劑ISO-1，探索SPostC減輕心肌H/R過程中MIF-AMPK信號通路的作用及對能量代謝的影響。本研究結(jié)果表明，SPostC能夠顯著改善心肌細(xì)胞H/R后的細(xì)胞存活率,并增加細(xì)胞發(fā)生H/R后MIF的表達(dá)水平,MIF的表達(dá)增加可以顯著改善AMPK的磷酸化水平，從而增加ATP的合成，并減少AcCoA堆積，改善心肌能量代謝，同時減少ROS的產(chǎn)生，從而實(shí)現(xiàn)SPostC對抗心肌H/R損傷。研究結(jié)果表明MIF-AMPK通路在SPostC對抗心肌H/R過程中通過調(diào)控能量代謝發(fā)揮重要作用。

七氟醚作為目前臨床使用非常普遍的吸入性麻醉藥物，能夠在細(xì)胞與細(xì)胞膜之間擴(kuò)散，不需特殊受體的介導(dǎo)而直接結(jié)合相應(yīng)的受體形成復(fù)合物，可改變細(xì)胞內(nèi)多種酶和離子通道結(jié)構(gòu)，活化缺氧敏感基因等。由于其獨(dú)特的藥理學(xué)特性，SPostC對抗心肌I/R發(fā)揮心肌保護(hù)作用在臨床和基礎(chǔ)研究中得到廣泛認(rèn)可[8-9]，本研究也再次證實(shí)了這一結(jié)論。

MIF作為一種多功能的炎癥因子[10]，參與炎癥和免疫調(diào)控[11-12]。有研究表明，MIF對糖尿病和I/R損傷后心臟功能均能夠產(chǎn)生一定的影響[13-15]。有研究認(rèn)為，在缺血預(yù)處理過程中通過介導(dǎo)MIF，從而激活RISK和AMPK信號通路，減少心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡[16]，抑制ROS生成[17]和炎性浸潤，維持內(nèi)皮細(xì)胞功能[18]，從而改善心肌I/R導(dǎo)致的心功能不全[19]。本研究結(jié)果表明，在SPostC對抗心肌I/R過程中MIF發(fā)揮重要作用。為驗(yàn)證SPostC對抗心肌I/R損傷過程中，MIF對AMPK的調(diào)控作用，本研究采用MIF的抑制劑ISO-1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SPostC通過增加MIF的表達(dá)水平，并未增加AMPK的mRNA和蛋白表達(dá)水平，而顯著增加AMPK的磷酸化水平，從而介導(dǎo)SPostC對抗心肌I/R損傷。

心肌細(xì)胞在常氧條件下, 其中絕大多數(shù)的ATP 來自線粒體的氧化磷酸化，可將葡萄糖、游離脂肪酸高效代謝為AcCoA，從而產(chǎn)生豐富的ATP[20]。余下的ATP主要來自糖酵解, 極少部分來自三羧酸循環(huán)。AcCoA作為三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝的匯聚點(diǎn)，作為有氧氧化供能和合成脂肪的重要底物。心肌缺氧時，線粒體氧化代謝下降，葡萄糖和游離脂肪酸氧化增加，糖酵解成為合成ATP的主要來源，從而導(dǎo)致AcCoA 的堆積[21]。為更進(jìn)一步驗(yàn)證MIF-AMPK通路在SPostC對抗心肌I/R損傷過程中對能量代謝的調(diào)控作用，本研究檢測了各組ADP、ATP、AcCoA和ROS的水平。結(jié)果表明，SPostC通過MIF-AMPK信號通路改善了心肌能量合成，降低了心肌應(yīng)激反應(yīng)，減少了ROS的合成，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

綜上所述，本研究采用H9C2心肌H/R損傷模型，驗(yàn)證了SPostC對抗心肌H/R損傷中通過增加MIF的表達(dá)水平，增加AMPK的磷酸化水平，增加ADP、ATP并減少AcCoA 堆積，促進(jìn)胞能量生成，降低ROS生成，進(jìn)而減輕心肌細(xì)胞H/R損傷。