張 瑤， 馬桂娟， 高 琳， 王紫昕， 吳龍國

(1. 寧夏食品檢測研究院（國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（枸杞和葡萄酒質(zhì)量安全）），寧夏 銀川 750021;2. 寧夏大學(xué)，寧夏 銀川 750021)

0 引 言

黃瓜種植過程中易多發(fā)生病菌感染及病蟲害[1]，目前主要通過噴灑農(nóng)藥進(jìn)行防治。由于部分病蟲害抗藥性增強(qiáng)，為提高黃瓜產(chǎn)量，大量使用多種農(nóng)藥進(jìn)行防治，造成黃瓜農(nóng)藥殘留嚴(yán)重，影響其質(zhì)量安全。且部分農(nóng)戶在噴灑農(nóng)藥后安全間隔期不足即采摘上市，致使黃瓜中農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)升高[2]。因此建立黃瓜中農(nóng)藥殘留檢測方法對(duì)于保障黃瓜產(chǎn)品質(zhì)量安全，降低飲食的潛在風(fēng)險(xiǎn)具有現(xiàn)實(shí)意義。

目前，常規(guī)的農(nóng)藥殘留常通過高效液相色譜法[3]、氣相色譜法[4]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5-9]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[10]進(jìn)行檢測分析。氣相色譜法和液相色譜法因其靈敏度低且在對(duì)多物質(zhì)進(jìn)行檢測時(shí)難以達(dá)到完全分離，定性能力弱，易存在假陽性。由于色譜法存在上述不足，故而色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)逐漸廣泛應(yīng)用于多農(nóng)殘檢測。液相色譜質(zhì)譜法法雖具有高通量、高靈敏度的特點(diǎn)，但是由于部分農(nóng)殘（如菊酯類）不能檢測，因此常與氣質(zhì)聯(lián)用法互為補(bǔ)充。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有高靈敏度、寬分離度、廣泛的分析范圍等優(yōu)點(diǎn)，使得其在農(nóng)藥殘留檢測方面應(yīng)用頗多[10-14]。目前，對(duì)于黃瓜中農(nóng)藥殘留的氣質(zhì)法所測的種類均比較單一且農(nóng)藥數(shù)量較少[15-16]，黎宙等[17]利用液液微萃取及氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)黃瓜中9種有機(jī)磷進(jìn)行檢測；張志龍等[18]、白國濤等[19]均采用QUECHERS結(jié)合氣質(zhì)法對(duì)黃瓜種15種有機(jī)磷及菊酯類物質(zhì)或10種殺菌劑進(jìn)行檢測。

本研究以設(shè)施黃瓜為研究對(duì)象，經(jīng)調(diào)研確定了黃瓜生產(chǎn)中使用的62種農(nóng)藥，涵蓋有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯、醇類、醚類、酰胺類等多種殺蟲劑、殺菌劑。采用氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)合固相萃取凈化技術(shù)，同時(shí)優(yōu)化程序升溫條件，使得62種農(nóng)藥待測物在色譜柱中可達(dá)到完全分離。鑒于此點(diǎn)，對(duì)于氣相色譜法檢測多農(nóng)殘時(shí)難以完全分離從而產(chǎn)生的假陽性問題得到了解決，此方法亦可推廣用于氣相色譜檢測。此外，實(shí)驗(yàn)前處理采用多種固相萃取小柱串接，更適合于成分復(fù)雜或顏色較深樣本的檢測，可減少雜質(zhì)及基質(zhì)影響，減少干擾，有利于待測物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量，具有更強(qiáng)可操作性和較好的凈化效果。該方法簡便、快速、穩(wěn)定性好，可推廣用于基層檢測機(jī)構(gòu)中其他果蔬類多農(nóng)藥殘留的檢測與分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

GC/MS（7890B-7000C，安捷倫科技有限公司）；數(shù)顯型分散機(jī)（IKAT25，德國IKA公司）；氮吹儀（HGC-24，北京恒奧德儀器儀表有限公司）； Envi-18柱（2 g/12 mL）, Envi-Carb（0.5 mg/6 mL）柱:美國色譜科；Sep-Pak (0.5 g/6 mL)：沃特世科技(上海)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（ BUCHI V-850，瑞士步琦實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室公司）；電子天平（BS 224，賽多利斯科學(xué)儀器公司）；高速離心機(jī)（K3-15，德國 Sigma 公司）。

1.1.2 試劑

丙酮（色譜純）；乙腈（色譜純）；無水硫酸鈉（分析純）；正己烷（色譜純）；62種農(nóng)藥中英文對(duì)照名稱見表1。均購于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所。

1.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件

1.2.1 氣相色譜條件

彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）DB-1 701 ，載氣為高純氦氣，初始體積流量 1.2 mL/min；不分流進(jìn)樣；升溫程序：初始溫度 40 ℃，保持 1 min，以 30 ℃/min 升至 130 ℃，以5 ℃/min 升至 250 ℃，以 10 ℃/min 升至 300 ℃，保持 6 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

GC-MS接口280 ℃，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿質(zhì)量分析溫度150 ℃，進(jìn)樣量1 μL。

1.3 樣品處理

稱取20.00 g(精確至0.01 g)黃瓜于100 mL離心管中，加入乙腈40 mL，置于離心機(jī)中10 000 r/min勻漿1 min，然后加入5 g氯化鈉于離心管中，再10 000 r/min勻漿提取1 min，離心4 000 r/min離心5 min，取20 mL上清液待凈化。將Envi-18柱經(jīng)活化后，加入提取液并用15 mL乙腈洗滌柱，收集所有流出液于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL，過經(jīng)5 mL乙腈+甲苯（3+1）溶液活化的Envi-Carb與Sep-Pak的串接柱，并分3次用2 mL乙腈+甲苯（3+1）洗滌雞心瓶，用25 mL乙腈+甲苯（3+1）淋洗，收集所有洗脫液，于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL，于 35 ℃下氮?dú)獯蹈桑? mL正己烷溶解殘?jiān)?，?jīng)微孔濾膜（0.2 μm）過濾，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將配制的標(biāo)準(zhǔn)品用正己烷配置成10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存在–4℃冰箱中備用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，上機(jī)測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

一般而言，未能有效分離的化學(xué)物，即使色譜峰重疊，但由于定性、定量離子的差異性，最終也可以獲得質(zhì)譜分離，從而進(jìn)行準(zhǔn)確定量。但是合理的程序升溫條件，可使多種化合物得以分離，亦能推廣應(yīng)用于氣相色譜法。本文優(yōu)化了程序升溫條件，使用了4種不同的程序升溫條件。程序1：設(shè)置初始溫度為60 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升至120 ℃，以5 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。程序2：初始溫度60 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升至170 ℃，再以10 ℃/min的速率升至300 ℃，保持5 min。程序3：初始溫度 40 ℃，保持 1 min，以 30 ℃/min 升至 120 ℃，以5 ℃/min 升至 300 ℃，保持 6 min。程序4：初始溫度 40 ℃，保持 1 min，以 30 ℃/min 升至 130 ℃，以5 ℃/min 升至 250 ℃，以 10 ℃/min 升至 300 ℃，保持 6 min。經(jīng)多種升溫方式比較，程序4最為合適此62種農(nóng)藥的分離。程序1和程序2不能很好地將待測化合物進(jìn)行分離，程序3分離時(shí)間較長，在大批量做樣時(shí)，不利于節(jié)省時(shí)間，故選擇程序4作為程序升溫條件。結(jié)果如圖1所示。

圖1 62種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖

由圖1可知，62種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液可以在33 min之前全部出峰，且均可以得到較好的分離，以各物質(zhì)響應(yīng)最高且無基質(zhì)干擾的離子做定量離子，以響應(yīng)較高的離子作為定性離子，可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量檢測。

2.2 優(yōu)化前處理?xiàng)l件

2.2.1 溶劑的篩選

根據(jù)相似相溶的原理，大部分農(nóng)藥為有機(jī)農(nóng)藥，所以其易溶于乙酸乙酯、乙腈、丙酮。因試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)丙酮提取，有機(jī)相顏色較深，可能是丙酮將試樣本身攜帶的色素提取較多，對(duì)測定產(chǎn)生的干擾較強(qiáng)，并且分層效果不明顯，鹽析效果不如乙腈。使用乙酸乙酯進(jìn)行提取，雖然大部分回收率符合回收要求，但提取液中的雜質(zhì)較多，對(duì)后續(xù)分析干擾較大。以乙腈作為提取溶劑，可以減少黃瓜中色素的提取量，并且絕大多數(shù)農(nóng)藥的回收率處于合理范圍。另外加入氯化鈉，經(jīng)勻漿和高速離心后，一方面使有機(jī)相與水相更好地分離，另一方面可使黃瓜中的糖分、有機(jī)酸等雜質(zhì)溶于水，降低雜質(zhì)的干擾，從而提高各待測化合物回收率，因此本文選擇乙腈作為提取溶劑。用含有石墨化碳黑的小柱處理農(nóng)殘樣品時(shí)，有些分子結(jié)構(gòu)是平面的農(nóng)藥會(huì)被石墨化碳黑吸附，很難洗脫，導(dǎo)致回收率低[20]。在洗脫SPE小柱過程中，甲苯可以將其從SPE柱中洗脫下來，以提高平面分子結(jié)構(gòu)農(nóng)藥的回收率。故經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用乙腈+甲苯（3+1）作為洗脫液，要優(yōu)于用乙腈、正己烷+乙酸乙酯（1+1），可提高樣本回收率。

2.2.2 固相萃取柱的選擇

固相萃取柱主要的作用是選擇性吸附與洗脫，去除雜質(zhì)。C18柱具有強(qiáng)疏水性，主要用于去除脂類，對(duì)非極性的組分有極強(qiáng)的吸附作用。GCB柱適用于去除色素、甾醇類等干擾。Sep-Pak固相萃取柱能與部分官能團(tuán)的分子形成氫鍵，可有效去除磺酸根離子等陰離子，同時(shí)能夠吸附目標(biāo)待測物，提高目標(biāo)化合物回收率。以此，本實(shí)驗(yàn)選擇了C18、GCB、Sep-Pak作為凈化用固相萃取柱。

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng)

由于樣品基質(zhì)中存在部分共提取物組分，這些組分對(duì)待測化合物的測定精確度存在一定的影響，從而形成了基質(zhì)增強(qiáng)或減弱的效應(yīng)。主要表現(xiàn)為基質(zhì)標(biāo)液與同濃度的純?nèi)軇?biāo)液相比，具有更高或更低的響應(yīng)值。

式中：ME——基質(zhì)效應(yīng)；

Km——基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

Ks——溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

當(dāng) ME＜0時(shí)，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，當(dāng) ME＞0，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。當(dāng)ME＜20%時(shí)，表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)，可忽略不計(jì)；20%＜ME＜50%時(shí)，表現(xiàn)為中等基質(zhì)效應(yīng)；ME＞50%時(shí)表示基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)。在氣質(zhì)常常表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，為了避免基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量的影響，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

由于基質(zhì)中的雜質(zhì)會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物離子的定量測定產(chǎn)生干擾，因此提取空白基質(zhì)作為對(duì)照。使用正己烷分別將配制的62種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成10.0 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用空白基質(zhì)將混合標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 配 置 成20，50，100，200，500，750，1 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。采用空白樣品添加方式考察62種農(nóng)藥的檢出限（S/N=3），根據(jù)不同農(nóng)藥測定的峰面積和對(duì)應(yīng)的濃度分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，結(jié)果見表1。

表1 62種農(nóng)藥的質(zhì)譜分析參數(shù)、線性回歸方程及檢出限

續(xù)表1 62種農(nóng)藥的質(zhì)譜分析參數(shù)、線性回歸方程及檢出限

由表1可知：62種農(nóng)藥的保留時(shí)間范圍為7～33 min之間，r2在0.966 0～0.999 2之間，可能是基質(zhì)影響了樣品的離子化，且對(duì)不同濃度樣品影響不同，因此各物質(zhì)的線性相關(guān)系數(shù)存在一定的差異性。檢出限為0.03～20 μg/kg，可滿足日常檢測所需。

2.3 回收率和精密度

方法的準(zhǔn)確度和精密度分別用添加回收率和添加回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）進(jìn)行評(píng)價(jià)。在空白黃瓜基質(zhì)樣品中進(jìn)行0.02，0.08，0.15 mg/kg 3個(gè)水平的添加回收試驗(yàn)，每個(gè)水平6次重復(fù)，按建立的方法和色譜條件進(jìn)行樣品處理和測定，計(jì)算不同添加水平下的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果如表2所示。

由表2可知，不同添加水平下，同種農(nóng)藥的回收率存在一定差異。農(nóng)藥化合物的加樣回收率范圍主要集中在60.0%～120.0%之間，RSD為1.3%～15.3%；在低水平的加標(biāo)回收中存在回收率大于130.0%或小于60.0%的現(xiàn)象，這主要是由于樣品在質(zhì)譜離子化過程和離子傳輸過程中的復(fù)雜環(huán)境，容易受到樣本本底及雜質(zhì)干擾、自身極性、穩(wěn)定性等理化性質(zhì)的影響存在一定的定量偏差。

表2 62種農(nóng)藥不同添加水平的回收率和精密度

續(xù)表2 62種農(nóng)藥不同添加水平的回收率和精密度

2.4 實(shí)際樣品的檢測

本文通過優(yōu)化的方法對(duì)21批次的黃瓜中62種農(nóng)藥進(jìn)行檢測，如表3所示。其中己唑醇檢出率最高為14.3%，檢出量最高為0.036 mg/kg，溴螨酯檢出率為9.5%，最高檢出量為0.041 mg/kg，甲氰菊酯、速滅磷等檢出率均低于5%，且檢出量都不高，參照GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》，均低于標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的最大殘留量。經(jīng)研究以上幾種農(nóng)藥分別為廣譜殺菌劑，殺蟲劑，可用于治療黃瓜白粉病、茶黃螨、跗線螨、紅蜘蛛等。

表3 黃瓜中農(nóng)藥的檢出結(jié)果

3 結(jié)束語

本文利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合固相萃取技術(shù)，優(yōu)化前處理、確定了最佳的質(zhì)譜條件及程序升溫方式，對(duì)黃瓜中62種農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測。同時(shí)考察了方法的線性、不同水平的回收率、檢出限與精密度等參數(shù)，并以實(shí)際樣品進(jìn)行檢測進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)，此方法凈化效果好，特別適合顏色較深、基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜的樣品，且操作簡便、靈敏度較高，具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可用于大批量樣品的快速檢測。對(duì)其他蔬菜、水果、糧谷類等農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測提供一定的參考價(jià)值。