王 娟，孫 峰，楊晶晶，魯 超

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)研究中心，安徽 合肥 230601; 3.安徽理工大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 淮南 232001)

肝纖維化(hepatic fibrosis)是營養(yǎng)代謝和病毒感染等引發(fā)的慢性肝臟疾病，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝臟中過度積聚[1-2]。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)是肝纖維化發(fā)生的主體細(xì)胞類型，其活化會影響肝纖維化疾病的轉(zhuǎn)歸，但目前關(guān)于HSCs活化的分子機(jī)制尚未了解完全[3]。證據(jù)表明，線粒體裂變在細(xì)胞活化增殖和纖維化疾病中發(fā)揮重要作用[4-5]。線粒體裂變(mitochondrial fission)是指一個線粒體變成兩個線粒體，并且外膜完全分離，與線粒體融合動態(tài)變化維持線粒體穩(wěn)態(tài)[6-7]。在哺乳動物細(xì)胞里，這個過程主要由線粒體動力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)來介導(dǎo)的。Wang等[4]研究表明，Drp1在活化的成纖維細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，提示Drp1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的活化增殖，但Drp1是否參與調(diào)控HSCs活化增殖尚不清楚，值得進(jìn)一步研究。

研究表明表觀遺傳修飾在線粒體裂變中發(fā)揮重要作用，可通過調(diào)控Drp1的表達(dá)來調(diào)節(jié)線粒體裂變的發(fā)生促進(jìn)纖維化發(fā)生發(fā)展[8]。作為DNA甲基化關(guān)鍵酶之一的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNA methyltransferase 3A，DNMT3A)在HSCs活化增殖中發(fā)揮重要作用[9-10]。那么在活化的HSCs中Drp1的表達(dá)升高是否是由DNMT3A介導(dǎo)的甲基化修飾引起的？DNMT3A是否通過調(diào)控Drp1從而促進(jìn)HSCs活化增殖及肝纖維化？這一科學(xué)問題目前尚未見報道，值得我們進(jìn)一步研究。本研究擬通過探究DNMT3A對Drp1的調(diào)控，并觀察對HSCs活化增殖和遷移能力的影響，明確DNMT3A是否通過調(diào)控Drp1介導(dǎo)的線粒體裂變促進(jìn)HSCs活化，從而為肝纖維化的臨床治療提供新的理論依據(jù)和作用靶點(diǎn)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物處理TGF-β1購自PeproTech公司。實(shí)驗(yàn)前先用檸檬酸鹽緩沖液(10 nmol·L-1，pH 3.0)配成濃度為0.1 g·L-1的儲備液，置于-20 ℃冰箱保存；臨用時稀釋成濃度為2 mg·L-1的工作液，置于4 ℃冰箱保存。

1.3 主要試劑DMEM 培養(yǎng)基(Hylcone)、胎牛血清(Gibco，USA)；胰蛋白酶(Multicell)；Transwell小室(Corning)；CCK-8試劑盒(Biosharp)；BCA試劑盒(碧云天)；TRIzol試劑(Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR試劑盒(艾科瑞生物)；兔源一抗GAPDH、CollagenⅠ、α-SMA、Drpl和Fis1(Proteintech)；兔源一抗DNMT3A(Abcam)；兔源二抗(Bioworld)。引物序列由上海生工公司合成，見Tab 1。

1.4 主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺(蘇州凈化)；高壓滅菌鍋(博迅)；倒置熒光顯微鏡(蔡司)，CO2培養(yǎng)箱(賽默飛)，實(shí)時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)，酶標(biāo)儀(Varioskan LUX)，低溫離心機(jī)(德國艾本德)；電子天平(賽多利斯)。

Tab 1 The primer sequences

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)至鋪滿瓶底，然后傳代，保留5代后方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 TGF-β1誘導(dǎo)HSCs細(xì)胞活化HSC-T6細(xì)胞以30%的密度接種于6孔板，于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；次日用含5 μg·L-1TGF-β1的無血清DMEM培養(yǎng)基替代，再培養(yǎng)24 h。待其他分組處理后收集細(xì)胞，制作提取RNA和總蛋白的樣品。

2.3 DNMT3A慢病毒轉(zhuǎn)染按照吉瑪基因慢病毒操作手冊，首先通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)感染方法和感染參數(shù)。將對數(shù)期的HSC-T6消化計數(shù)至1×108L-1鋪板于6孔板中，貼壁后用5 μg·L-1TGF-β1刺激24 h活化。取DNMT3A慢病毒，按MOI值為30的滴度與無血清培養(yǎng)基混合稀釋，并加入終濃度為5 mg·L-1的Polybrene(聚凝胺)用來增加轉(zhuǎn)染效率；同時設(shè)置相同MOI滴度的病毒陰性對照組；24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，感染72 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)細(xì)胞如上處理后，每孔加入1 mL TRIzol試劑慢提RNA。于260 nm波長處檢測其濃度，按照試劑盒(艾科瑞)要求以不超過50 mg·L-1濃度進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得cDNA。再按照qPCR試劑盒(艾科瑞)要求混合液體，以兩步法PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計算mRNA的相對表達(dá)量。

2.5 Western blot細(xì)胞分組處理后加入RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，洗膜，4 ℃過夜孵育一抗，次日取出洗膜，室溫孵育二抗1 h，洗膜，用ECL法顯影。結(jié)果采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CCK-8)用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。以每孔2 000個接種于96孔板中，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)4 h，貼壁后進(jìn)行后續(xù)處理，每組設(shè)6個復(fù)孔，用無菌PBS填充邊緣孔。慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，輕輕敲擊混勻96孔板，在培養(yǎng)箱中孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。根據(jù)增殖率/%=(實(shí)驗(yàn)組 - 空白對照)/(陰性對照 - 空白對照)×100%計算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)按“2.3”處理后的細(xì)胞以過夜長滿的密度鋪在提前在底部劃橫線的6孔板上，48 h后用200 μL的無菌槍頭垂直底部平行線進(jìn)行劃痕，用PBS清洗3～4次后，加入無血清DMEM，置于37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中。分別用倒置顯微鏡觀察0 h，48 h傷口寬度的變化規(guī)律，并對劃痕面積進(jìn)行ImageJ統(tǒng)計。遷移率/%=(初始劃痕面積-48 h后劃痕面積)/初始劃痕面積×100%，每孔隨機(jī)選取3個視野，每孔重復(fù)3次。

2.8 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)Transwell下室提前1 h加入無血清培養(yǎng)基進(jìn)行基底膜水化。將慢病毒處理好的各組細(xì)胞用胰酶消化離心，然后重懸于DMEM中，并稀釋為5×108L-1。取100 μL接種于上室中，并加入適量10%FBS于下室，孵育30～40 h。小室洗滌后用4%的多聚甲醛室溫固定30 min，晾干；隨后用0.1%的結(jié)晶紫水溶液室溫下染色20 min。用棉簽輕輕除去上室膜細(xì)胞，洗滌后每孔任意選擇5個視野進(jìn)行拍照，用ImageJ進(jìn)行計數(shù)分析，每組3個復(fù)孔，取平均值。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析采用 Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。組間差異采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 DNMT3A在HSCs細(xì)胞中的表達(dá)情況在用TGF-β1刺激HSC-T6細(xì)胞后，DNMT3A的含量升高，結(jié)果如Fig 1所示。用MOI值為30的DNMT3A慢病毒感染72 h后，F(xiàn)ig 1A，B結(jié)果顯示，與NC組比較，病毒感染組DNMT3A水平明顯降低(P<0.01)，病毒感染成功，DNMT3A沉默模型成功構(gòu)建。

Fig 1 Expression of DNMT3A in each group after lentivirus infection n=3)A：qPCR of DNMT3A;B：Western blot of DNMT3A,1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+LV5-NC；4：TGF-β1+LV5-DNMT3A;*P<0.05,**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs TGF-β1+ LV5-NC group.

3.2 DNMT3A調(diào)控collagen Ⅰ，α-SMA mRNA的表達(dá)Fig 2結(jié)果顯示，用TGF-β1刺激HSCs細(xì)胞后，與正常組相比，Collagen Ⅰ、α-SMA mRNA含量明顯升高(P<0.05)；而DNMT3A慢病毒感染后，Collagen Ⅰ、α-SMA mRNA含量明顯低于NC組(P<0.01)，提示DNMT3A被抑制，HSCs的活化也被抑制。

3.3 DNMT3A調(diào)控collagen Ⅰ，α-SMA 蛋白的表達(dá)Fig 3結(jié)果顯示，用TGF-β1刺激HSCs細(xì)胞后，與正常組比較，Collagen Ⅰ，α-SMA蛋白含量明顯升高(P<0.01)，HSCs被活化；而DNMT3A慢病毒感染后，Collagen Ⅰ、α-SMA蛋白水平明顯低于NC組(P<0.01)，提示DNMT3A被抑制，纖維化水平被抑制。

Fig 2 Effect of DNMT3A on collagen Ⅰ,*P<0.05,**P<0.01 vs Control group;#P<0.05 vs TGF-β1+ LV5-NC group.

Fig 3 Effect of DNMT3A on expression of collagen Ⅰ,1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+LV5-NC；4：TGF-β1+LV5-DNMT3A.*P<0.05，**P<0.01 vs Control group.##P<0.01 vs TGF-β1+ LV5-NC group.

3.4 DNMT3A調(diào)控Drp1 mRNA的表達(dá)Fig 4結(jié)果顯示，用TGF-β1刺激HSCs細(xì)胞后，與正常組比較，Drp1 mRNA的含量明顯升高(P<0.01)；而DNMT3A慢病毒感染后，Drp1 mRNA含量明顯低于NC組(P<0.05)，提示DNMT3A被抑制，線粒體裂變也被抑制。

3.5 DNMT3A調(diào)控Drp1蛋白的表達(dá)Fig 5結(jié)果顯示，用TGF-β1刺激HSCs細(xì)胞后，與正常組比較，Drp1蛋白含量明顯升高(P<0.01)；而DNMT3A慢病毒感染后，Drp1蛋白含量明顯低于NC組(P<0.01)，提示DNMT3A被抑制，與線粒體裂變有關(guān)的蛋白也被抑制。

Fig 4 Effect of DNMT3A on Drp1 mRNA expression n=3)1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+LV5-NC；4：TGF-β1+LV5-DNMT3A.**P<0.01 vs Control group;#P<0.05 vs TGF-β1+LV5-NC group.

Fig 5 Effect of DNMT3A on expression of 1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+LV5-NC；4：TGF-β1+LV5-DNMT3A.**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs TGF-β1+LV5-NC group.

3.6 DNMT3A調(diào)控HSCs的增殖Fig 6結(jié)果顯示，用TGF-β1刺激HSCs細(xì)胞后，與正常組比較，細(xì)胞活化增殖活性明顯升高(P<0.01)；而DNMT3A慢病毒感染后，細(xì)胞活化增殖活性明顯低于NC組(P<0.01)，提示DNMT3A被抑制，細(xì)胞活化增殖活性也被抑制。

3.7 DNMT3A調(diào)控HSCs的遷移Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用TGF-β1刺激HSCs細(xì)胞后，細(xì)胞遷移能力較正常組明顯升高(P<0.01)；而DNMT3A慢病毒感染后，細(xì)胞遷移能力明顯低于NC組(P<0.01)，提示DNMT3A被抑制，細(xì)胞遷移能力也被抑制(Fig 7A)。如Fig 7B所示，劃痕實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了上述結(jié)果。

Fig 6 Effect of DNMT3A on HSCs proliferation n=6)1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+LV5-NC；4：TGF-β1+LV5-DNMT3A.**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs TGF-β1+ LV5-NC group.

4 討論

線粒體的生物發(fā)生和動力學(xué)是協(xié)調(diào)的，為保持線粒體穩(wěn)態(tài)，線粒體分裂蛋白會做相應(yīng)的表達(dá)變化[7]。Drp1是線粒體裂變的標(biāo)志性分子，其在線粒體發(fā)生分裂過程中合成和表達(dá)增多且它的功能是必需的[11]。已有文獻(xiàn)報道，Drp1在腎臟和血管纖維化中發(fā)揮重要作用，Drp1的上調(diào)會導(dǎo)致線粒體裂變增加，進(jìn)而促進(jìn)纖維化細(xì)胞活化增殖，促進(jìn)纖維化發(fā)展[4-5]。但Drp1在肝纖維化中的作用不明確。Das等[12]研究表明，線粒體裂變的增加可促進(jìn)HSCs的活化增殖，HSCs活化增殖的增強(qiáng)可進(jìn)一步促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活化的HSCs中Drp1的合成和表達(dá)增多，提示Drp1介導(dǎo)的線粒體裂變可能在HSCs的活化過程中發(fā)揮重要作用，調(diào)控Drp1的關(guān)鍵分子可能是抗肝纖維化的潛在靶點(diǎn)。但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

DNMT3A作為一種穩(wěn)定可遺傳的表觀遺傳機(jī)制，在基因組中通過CpG島從頭甲基化過程來調(diào)控纖維化的發(fā)生發(fā)展[13-14]。然而，DNMT3A在HSCs活化和肝纖維化進(jìn)展中的作用在國內(nèi)外很少報道。我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化與HSCs的增殖狀態(tài)密切相關(guān)，可參與調(diào)控HSCs活化增殖[15]。在本實(shí)驗(yàn)中，使用TGF-β1刺激HSCs后，Collagen Ⅰ和α-SMA表達(dá)升高，細(xì)胞的增殖和遷移能力增強(qiáng)，說明HSCs活化增殖模型建立成功，此時DNMT3A水平顯著升高，提示在活化的HSCs中DNMT3A可能發(fā)揮重要作用。

Du等[16]的研究表明，表觀遺傳修飾調(diào)控線粒體裂變在肝臟缺血/再灌注中發(fā)揮重要作用，但DNMT3A是否調(diào)控Drp1介導(dǎo)的線粒體裂變促進(jìn)HSCs活化增殖還未見報道。為了進(jìn)一步明確DNMT3A和Drp1的關(guān)系，我們利用慢病毒感染沉默DNMT3A后發(fā)現(xiàn)，HSCs合成的collagen Ⅰ、α-SMA的表達(dá)下調(diào)，并且HSCs細(xì)胞的增殖和遷移能力受到抑制，同時Drp1的含量也明顯降低，提示沉默DNMT3A可以抑制Drp1表達(dá)，同時有效地降低了HSCs增殖與遷移能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，DNMT3A在Drp1的表達(dá)調(diào)控中具有重要的作用，DNMT3A可能通過影響線粒體裂變發(fā)揮抑制HSCs活化作用。

Fig 7 Effect of DNMT3A on HSCs migration ability n=5)A:Representative results of transwell migration (×200).B:Representative results of wound healing (×200).C:Statistical analysis of the effect of DNMT3A on HSCs on the migration ability;D:Statistical analysis of the effect of DNMT3A on HSCs on the migration and healing ability.1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+LV5-NC；4：TGF-β1+LV5-DNMT3A.*P<0.05，**P<0.01 vs Control group.##P<0.01 vs TGF-β1+LV5-NC group.

綜上，DNMT3A可能通過調(diào)控Drp1介導(dǎo)的線粒體裂變促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化增殖和遷移能力，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。預(yù)期研究成果將有利于從表觀遺傳學(xué)方向結(jié)合線粒體裂變角度深入理解肝纖維化發(fā)病的分子作用機(jī)制，從而為肝纖維化的臨床治療提供新的理論依據(jù)和新的作用靶點(diǎn)。