郭夢婷，呂孝旺，王志瑋，周婷婷，馬 鑫

(江南大學無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫 214122)

高血壓是全球死亡率升高的主要原因之一，有11.3億人患有高血壓[1]。隨著生活水平的提高，飲食條件的改善，肥胖問題已成為影響公共健康的重要因素。肥胖是引起高血壓的主要原因，大約75%的高血壓發(fā)病率與肥胖(定義為體重指數(shù) ≥ 30 kg/m2)直接相關[2-3]。肥胖患者伴隨著糖脂代謝紊亂，引發(fā)血管內(nèi)皮功能異常，有研究表明肥胖與收縮壓升高呈正相關[4-5]。因此，單純針對降低血壓或降脂的治療已不能適應當前的治療，必須尋求既能改善心血管又能改善代謝指標的藥物[6]。葛根是一種常見的中藥材，具有抗心血管疾病、抗高血壓、抗炎、抗心律不齊等藥理學性質(zhì)[7]。越來越多的證據(jù)表明，葛根素(puerarin，Pue)在高血壓等心血管疾病治療中有突出作用[8-9]。吳昀等[10]研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可以通過內(nèi)皮依賴性和非依賴性腸系膜動脈的舒張功能降壓。玉從容等[11]研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可明顯降低高脂高糖飲食誘導的胰島素抵抗小鼠的血脂和血壓。最近的研究表明[12]，高脂飲食誘導的C57 BL/6J雄性小鼠由于脂肪的積累易于發(fā)展為嚴重肥胖，使其成為研究人類肥胖的理想模型，但對主動脈在高脂飲食所誘導的肥胖小鼠所發(fā)揮的作用研究頗少，因而本研究擬探討葛根素是否通過保護主動脈內(nèi)皮功能而降低高脂飲食所誘導肥胖小鼠的血壓，同時也為臨床提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡SPF級♂ C57 BL/6J小鼠(上海斯萊克公司提供)，飼養(yǎng)于江南大學醫(yī)學院實驗動物中心(倫理號：JN.No20201230c0600601[371])，進行12 h晝夜交替，小鼠飼養(yǎng)于通風良好的環(huán)境，溫度在18～25 ℃，相對濕度40%～70%，適應性飼養(yǎng)7 d后開始正式實驗。

1.2 主要試劑與藥物生理鹽水購自中國國藥集團(貨號：H34023609)、葛根素購自美國阿拉丁公司(貨號：P111270-5 g)、甘油三脂(TG)測定試劑盒、總膽固醇(TC)測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所(貨號：A110-1-1、A111-1-1、A113-1-1、A112-1-1)、左旋硝精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME，貨號：N109211)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh，貨號：A2661)、HC-067047購自英國Tocris Bioscience公司(貨號:SML0143)、甲基噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium，MTT)比色法試劑盒購自中國碧云天生物科技(貨號：C0009M)、Krebs溶液成分(mmol·L-1)：NaCl 119 、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KCl 4.7、KH2PO41.2、CaCl22.5、D-glucose 11.1、60 mmol·L-1KCl溶液成分(mmol)：KCl 60、NaCl 63、NaHCO325、MgCl · 6H2O 1、KH2PO41.2、CaCl22.5、D-glucose 11.1。

1.3 儀器BP-2000大小鼠無創(chuàng)血壓計(美國II TC生命科學儀器公司)、Wire myograph 620 M(丹麥DMT公司)、全功能微孔檢測儀Synergy H4(美國伯騰儀器有限公司)、血糖儀(中國魚躍生物科技公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1模型建立及實驗分組 將C57 BL/6J小鼠分籠適應性飼養(yǎng)一周后，以45%高脂飼料喂養(yǎng)小鼠20周構建肥胖小鼠模型(diet-induced obesity，DIO)，普通飼料喂養(yǎng)小鼠作為對照組，期間每周定時監(jiān)測小鼠體重，模型組小鼠體重漲幅超過對照組20%。尾套法監(jiān)測小鼠收縮壓、舒張壓變化情況，20周后模型組收縮壓升至110～115 mmHg范圍。模型組小鼠采取隨機分組，分為肥胖小鼠模型組(DIO)、模型組+葛根素低劑量組Pue(L) 20 mg·kg-1·d-1、模型組+葛根素中劑量組Pue (M) 40 mg·kg-1·d-1、模型組+葛根素高劑量組Pue(H) 80 mg·kg-1·d-1，每組各6只小鼠，連續(xù)8周腹腔注射葛根素，在實驗期間每周記錄體重和血壓。

1.4.2原代內(nèi)皮細胞分離與培養(yǎng) 使用高濃度CO2將小鼠安樂死，打開胸腔，取出主動脈組織于無菌PBS中，在無菌超凈臺中將主動脈組織用剪刀剪碎后溶于含有胰酶(2 g·L-1)的PBS中，在37 ℃水浴震蕩30 min后離心1 200 r·min-1，5 min；之后用ECM(Endothelial Cell Medium)培養(yǎng)基重懸細胞沉淀種于6孔板中，2 h后換液，此為第一代細胞，傳代后的第二代細胞用于實驗。

1.4.3血清指標檢測 給藥8周末將小鼠禁食過夜，采取眼眶靜脈取血。將血樣室溫靜置2 h后，4 ℃離心4 000 r·min-1，15 min。之后取上清，用試劑盒測定甘油三脂TG、總膽固醇TC、高密度脂蛋白膽固醇HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇LDL-C，按照試劑盒法進行檢測，最后于酶標儀上測定。

1.4.4血壓測定 使用II TC無創(chuàng)血壓計測量小鼠血壓，先將恒溫箱設為34 ℃，預熱30 min后將小鼠放于小鼠固定同筒中固定，腹部朝下，尾巴穿過橡皮圈，適應30 min后進行測量，重復3次的平均值作為小鼠的血壓值。給藥期間每周測量小鼠血壓。

1.4.5小鼠離體主動脈環(huán)的制備與內(nèi)皮功能檢測 取雄性小鼠裝入可通CO2的泡沫塑料盒中，向其中通入CO2等待約1 min，待小鼠安樂死后，打開胸腔迅速取出主動脈組織，于4 ℃氧飽和的Krebs溶液中，小心分離出主動脈，剔除脂肪和結締組織，操作過程中避免牽拉；主動脈制備成2～3 mm血管環(huán)，每只小鼠制備四個血管環(huán)進行平行實驗，血管環(huán)用2根金屬絲(40 μm)連于張力換能器上，浴槽中加入5 mL Krebs溶液溫度為(37±0.5) ℃，持續(xù)通入5% CO2+95% O2，pH 7.4)。調(diào)節(jié)血管環(huán)的初張力，并穩(wěn)定在 0 mN，平衡約 60 min，調(diào)至3 mN平衡約30 min，每15 min換液1次。待血管環(huán)穩(wěn)定后，用60 mmol·L-1KCl預收縮血管3次，待血管恢復血管活力后，向浴槽中加入Phe(1 μmol·L-1)刺激血管收縮，到達收縮平臺后累積給藥法依次加入ACh(1 nmol·L-1～10 μmol·L-1)，注意在加入下一劑量時必須等上一劑量反應到達平臺期。觀察血管環(huán)對 ACh的反應性，計算ACh引起的血管舒張率，舒張率%=(最大收縮張力值-ACh給藥后張力值)/(最大收縮張力值-基礎張力值) 100%，血管舒張85%以上表明內(nèi)皮功能完好，此為內(nèi)皮完整組(+Endo)

1.4.6去內(nèi)皮主動脈環(huán)的制備與內(nèi)皮功能檢測 取已剔除結締組織和脂肪的主動脈環(huán)，將粗細適當?shù)拇笫蠛毚┻M血管環(huán)，并來回摩擦去除血管段中的內(nèi)皮層，待血管穩(wěn)定后，加入60 mmol·L-1KCl刺激血管3次，待刺激達到坪值后，加入Phe(1 μmol·L-1)預收縮血管，穩(wěn)定后加入梯度濃度ACh，舒張率低于10%視為內(nèi)皮去除完全，此為去內(nèi)皮組(-Endo)

1.4.7L-NAME和HC-067047對葛根素舒張小鼠主動脈的測定 內(nèi)皮完整的主動脈環(huán)經(jīng)內(nèi)皮功能檢測后，分別敷育一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制劑L-NAME(100 μmol·L-1)和TRPV4抑制劑HC-067047(1 μmol·L-1)，30 min。對照組不敷育L-NAME和HC-067047。eNOS 通路是促進大血管舒張的重要通路，加入其抑制劑以揭示在抑制eNOS活性后各組的反應性是否仍存在差異；已有研究證實葛根素為TRPV4激動劑，TRPV4也是血管舒張的重要通路之一[13]。在浴槽中加入其抑制劑以揭示抑制TRPV4活性后血管舒張差異。待血管恢復活力后，加入Phe(1 μmol·L-1)刺激血管收縮，收縮穩(wěn)定后加入梯度濃度ACh，計算ACh引起的血管舒張率。

1.4.8細胞Transwell實驗 將2 d內(nèi)分離的DIO小鼠原代內(nèi)皮細胞分別孵育25、50、100 μmol·L-1葛根素24 h，隨后使用胰酶消化處理，將4萬個細胞重懸至200 μL DMEM基礎培養(yǎng)基后接種到小室中，24孔板中加入500 μL ECM培養(yǎng)基，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h之后，用PBS洗兩次，再用4% PFA(多聚甲醛)固定，用PBS去除殘留的PFA后，用1%結晶紫染色15 min，最后用PBS清洗3～5次后，擦掉上室殘留細胞，使用正置顯微鏡拍攝小室的多個視野，使用Image J統(tǒng)計遷移率差異。

Tab 1 Effects of puerarin on blood lipid of obese mice induced by high fat diet

1.4.9血糖檢測 于8周末將小鼠禁食過夜，更換墊料進行籠底清潔，小鼠進行正常飲水，分別采集小鼠尾尖血液于血糖試紙上，采用血糖儀測定血糖濃度。

1.4.10MTT細胞增殖實驗 將可用于實驗的DIO小鼠原代內(nèi)皮細胞種于96孔板中，大約每孔5 000個細胞左右，并孵育25、50、100 μmol·L-1葛根素24 h，然后與 MTT溶液(0.5 g·L-1)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱下共敷育 4 h，然后加入DMSO以溶解甲臜晶體最后于570 nm處測定吸光度。

2 結果

2.1.1葛根素對DIO小鼠體質(zhì)量、血清中血脂、空腹血糖的影響 如Fig 1A所示，45%高脂飼料喂養(yǎng)小鼠后體重明顯增加，與Con組相比體型肥胖；而低、中、高劑量葛根素處理8周后可明顯降低小鼠體質(zhì)量增加的幅度(P<0.0001)。如Fig 1B所示，DIO組空腹血糖與Con組相比明顯增高(P<0.0001)，與DIO相比高劑量組空腹血糖明顯降低，(P<0.0001)。如Tab 1 所示，DIO組TG、TC、LDL-C的水平明顯高于對照組，HDL-C 則明顯低于其他各組，高劑量葛根素組可有效逆轉高脂飲食所引發(fā)的TG、TC、LDL-C水平的升高以及HDL-C的降低。

2.1.2葛根素對DIO小鼠血壓的影響 如Tab 2-4所示，DIO組血壓明顯高于對照組，低劑量組SBP(systolic blood pressure)、DBP(diastolic blood pressure)、MAP(mean arterial blood pressure)與對照組無明顯差異，中、高劑量組可明顯降低DIO組的高血壓(P<0.01)。

Fig 1 Effects of puerarin on body weight (A) ,fasting *P<0.05 vs control;#P<0.05 vs DIO

Tab 2 Effects of puerarin on systolic blood pressure of obese mice induced by high fat

Tab 3 Effects of puerarin on diastolic blood pressure of obese mice induced by high fat

Tab 4 Effects of puerarin on mean arterial blood pressure of obese mice induced by high fat

2.2 葛根素改善DIO小鼠主動脈舒張功能血管張力結果如Fig 2A所示，與DIO組相比，葛根素組主動脈環(huán)對ACh引發(fā)的舒張明顯降低。如Fig 2B所示，在ACh累積濃度為1 μmol·L-1時，對照組血管舒張率在50%左右，而葛根素組舒張率可達80%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明高劑量葛根素干預可明顯增強DIO小鼠主動脈對ACh的舒張作用，從而改善血管舒張功能。

2.3 葛根素可改善DIO小鼠主動脈的內(nèi)皮依賴性血管舒張去內(nèi)皮組血管舒張結果如Fig 3A所示，去內(nèi)皮組(-Endo)主動脈環(huán)對ACh引起的舒張作用與對照組(+Endo)比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。內(nèi)皮完整組加入L-NAME處理后血管舒張結果如Fig 3B所示，L-NAME組主動脈對ACh引起血管舒張程度低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。內(nèi)皮完整組加入HC-067047處理后血管舒張結果如Fig 3C所示，HC-067047組主動脈與對照組相比，血管舒張明顯減弱，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.4 葛根素可改善肥胖小鼠內(nèi)皮增殖遷移能力MTT細胞增殖實驗如Fig 4A所示，50 μmol·L-1葛根素組細胞活性明顯高于DIO模型組(P<0.01),100 μmol·L-1葛根素組也會顯著增加細胞增殖能力，結果有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。DIO小鼠內(nèi)皮細胞Transwell細胞遷移實驗結果如Fig 4B所示，與模型組比較，25 μmol·L-1葛根素組對細胞遷移率無影響，50、100 μmol·L-1葛根素組細胞遷移率明顯增加(P<0.01)。

Fig 2 Puerarin treatment improved aortic diastolic function of DIO miceRepresentative traces (A) and effects of ACh-induced vasodilation in aorticl rings (B) ,n=6,from three mice

Fig 3 Puerarin improved endothelium-dependent vasodilation of aortaEffects of ACh-induced relaxation in Phe(1 μmol·L-1) in aorta with endothelium (Endo+)or without endothelium(Endo-)(A).Effects of Pue-induced vasodilation in DIO mouse aorta of endothelium (Endo+) with or without L-NAME(100 μmol·L-1).(B) Effects of Pue-induced vasodilation in DIO mouse aorta of endothelium (Endo+) with or without HC-067047(1 μmol·L-1).(C) n=6,from three mice **P<0.01 vs DIO

Fig 4 Puerarin improved proliferation and migration of endothelial cell isolated from obese miceMAECs were cultured with Pue (25,50,100 μmol·L-1) for 24 h,and then the cell viability was detected by MTT assay.(A)MAECs were cultured with Pue (25,50,100 μmol·L-1) for 24 h,and then conducted the Transwell assay.Representative images of migration assays.(B-C) Scale bar,20 μm **P<0.01 vs DIO

3 討論

肥胖會引發(fā)血脂血糖代謝異常、高血壓、高血脂且導致血管內(nèi)皮功能改變。血管內(nèi)皮細胞是血管壁的重要組成成分，內(nèi)皮細胞的增殖遷移有助于維持血管壁內(nèi)皮的完整性和細胞骨架的形成，從而改善血管內(nèi)皮功能降低血壓[14]。主動脈中內(nèi)皮依賴性舒張主要由NO介導。TRPV4 通道介導內(nèi)皮依賴性引起的血管舒張，可促進內(nèi)皮細胞產(chǎn)生NO，NO可以擴散到內(nèi)皮細胞周圍組織和平滑肌細胞中，然后通過平滑肌細胞介導主動脈血管舒張作用[15]。當TRPV4 通道打開會引起細胞內(nèi) Ca2+水平升高，激活eNOS引起血管舒張，TRPV4-eNOS信號傳導在內(nèi)皮功能中具有重要作用。葛根素是從葛根中提取的異黃酮類物質(zhì)，在心腦血管疾病、糖尿病及高血壓等臨床疾病中廣泛應用[16]。已報道的研究多聚焦于葛根素對高血壓大鼠降壓機制的研究，但對于高脂飲食誘導的肥胖小鼠的降壓機制鮮有報道[17]。DIO小鼠隨肥胖而血壓升高其模型特點與因肥胖而造成的高血壓人群更為接近。

本文研究發(fā)現(xiàn)葛根素治療會降低肥胖小鼠的血壓，主要通過改善主動脈血管功能。細胞水平的增殖和遷移實驗結果表明葛根素能夠促進內(nèi)皮細胞的增殖與遷移；動物實驗結果表明葛根素能夠改善DIO小鼠的血管張力受損，并且內(nèi)皮依賴性性的NO途徑和TRPV4通道的激活參與上述調(diào)節(jié)。綜上所述，本文的研究發(fā)現(xiàn)葛根素是能夠增強主動脈內(nèi)皮依賴性舒張和內(nèi)皮細胞的遷移能力，降低肥胖小鼠的血壓。本實驗結果為探究葛根素治療肥胖相關疾病包括血壓升高提供了理論依據(jù)，極大地豐富了中藥成分葛根素的在肥胖相關疾病的機制研究，說明中醫(yī)藥在臨床中發(fā)揮的重要作用，同時也為未來中醫(yī)藥在肥胖相關性高血壓的治療及預防提供了更多的實踐基礎和有豐富的參考價值。