張 昕，符麗娟

(錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

糖尿病人群易發(fā)心肌并發(fā)癥，主要有冠心病、心肌病、心功能失常等，其中糖尿病心肌病(diabetic cardio myopathy，DCM)發(fā)病率較高，心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是DCM的一種主要病理特征，心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblast，CFs)是心肌間質(zhì)的主要細(xì)胞，對維持心肌的結(jié)構(gòu)與功能具有十分重要的作用[1]。丹參中含有豐富的丹酚酸物質(zhì)，丹酚酸B(salvianolic acid B，SalB)是丹酚酸中含量最豐富、生物活性最強(qiáng)的物質(zhì)。越來越多的證據(jù)表明，它對多種器官和組織具有抗纖維化作用，包括肝臟[2]和腎臟[3]等。RhoA/ROCK途徑影響著細(xì)胞增殖、黏附、遷移、凋亡等生物行為，是重要的調(diào)節(jié)樞紐之一[4]。在糖尿病心肌中，RhoA表達(dá)和活性的增加導(dǎo)致ROCK靶點(diǎn)磷酸化增加，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白聚合增加，可能與糖尿病心臟功能障礙有關(guān)。ROCK蛋白有兩種亞型，ROCK1和ROCK2，但二者在調(diào)控心肌功能方面有著一定的區(qū)別，目前認(rèn)為，ROCK1參與血管平滑肌增生、心肌肥厚和組織纖維化過程，而ROCK2則更傾向于影響心肌細(xì)胞肥大功能。但ROCK1、ROCK2在高糖誘導(dǎo)CFs增殖、轉(zhuǎn)分化及糖尿病心肌纖維化過程中具體作用如何，目前尚不十分明確。因此，本實(shí)驗(yàn)基于RhoA/ROCK1信號通路，建立糖尿病大鼠模型以及高糖誘導(dǎo)CFs，探討SalB對糖尿病大鼠心肌纖維化的作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物、藥品與試劑 錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心選購♂Sprague-Dawley大鼠；鼠齡在1～3d之間的大鼠乳鼠，選購標(biāo)準(zhǔn)符合實(shí)驗(yàn)要求；鏈脲佐菌素STZ(sigma公司)；SalB(美侖MB6598)；ROCK抑制劑Y-27632(APEX BIO公司A3008)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；增強(qiáng)型CCK8試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；α-SMA抗體(博士德公司W(wǎng)L02509)；CollagenⅠ抗體(博士德公司W(wǎng)L0088)；RhoA抗體(abcam公司ab187027)；ROCK1抗體(abcam公司ab134181)、CollagenⅢ(博士德公司W(wǎng)L03186)。

1.1.2儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；酶標(biāo)儀(奧地利Anthos公司)；熒光顯微鏡(德國Leica公司)；電泳系統(tǒng)、化學(xué)發(fā)光凝膠系統(tǒng)成像儀(美國Bio-Rad公司)；高速冷凍離心機(jī)(Hitachi公司)。

1.2 方法

1.2.1糖尿病大鼠模型建立及分組 隨機(jī)選取體質(zhì)量(250±20)g，健康 ♂ SD大鼠50只，其中40只尾靜脈一次性注射30 mg·kg-1STZ(由枸櫞酸緩沖液提前配置)制備糖尿病大鼠模型。72 h后檢測血糖指標(biāo)(血糖濃度大于16.7 mmol·L-1)，尿糖檢測呈陽性的大鼠視為模型建立成功。另外10只設(shè)為正常對照組(Control)，尾靜脈注射等量的0.1 mmol·L-1枸櫞酸緩沖液。將建模成功的糖尿病大鼠隨機(jī)分為4組:DM組、DM+SalB低劑量組(80 mg·kg·d-1)、DM+SalB中劑量組(120 mg·kg·d-1)、DM+SalB高劑量組(160 mg·kg·d-1)。SalB組在建模成功后每天進(jìn)行灌胃給藥處理。共飼養(yǎng)12周。

1.2.2天狼星紅染色 取左室心肌組織，用新鮮配置的多聚甲醛溶液固定，不同濃度的無水乙醇脫水處理，石蠟包埋，常規(guī)石蠟切片脫蠟，天狼星紅染色10 min，無水乙醇稍洗后 瀝干，脫水透明，中性樹脂封片，于鏡下觀察膠原纖維呈紅色，拍照保存。

1.2.3CFs原代培養(yǎng) 新生SD大鼠乳鼠，1～3 d，♀♂不拘，75%酒精消毒，用無菌的手術(shù)剪刀將心臟快速取出，放于預(yù)冷的PBS緩沖液燒杯中清洗干凈，再使用眼科剪將心肌組織剪成大約1 mm3的組織碎塊，將燒杯中剩余的PBS液體吸去，再加入0.25%的胰蛋白酶消化液，并將組織碎塊轉(zhuǎn)移至離心管中進(jìn)行消化，5 min后將上清吸去。繼續(xù)加入胰酶消化液并放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中8 min，搖晃使組織碎塊充分的消化，靜置后，將離心管中的上清液吸出，并置于裝有新鮮配置的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(完全培養(yǎng)基)的離心管中終止消化，重復(fù)消化數(shù)次直至組織碎塊消失。消化好的上清液合并后，1 200 r·min-1離心5 min，吸除上清液，再加入完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞沉淀輕輕吹散，混懸均勻后接種于培養(yǎng)瓶中差速貼壁1 h，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)貼至融合時(shí)，進(jìn)行消化傳代處理，后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用2～4代細(xì)胞。

1.2.4檢測細(xì)胞活力 將CFs細(xì)胞接種到96孔板，加入完全培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)1 d后，更換無血清培養(yǎng)基，使CFs處在同步生長狀態(tài)。將CFs分為6組，每組設(shè)5復(fù)孔：正常組(Control組)，高糖組(HG組，25 mmol·L-1葡萄糖)，高滲透壓對照組(MG組，19.5 mmol·L-1甘露醇+5.5 mmol·L-1葡萄糖)，不同濃度SalB組(12.5 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1)預(yù)處理1 h，高糖誘導(dǎo)24 h，觀測CFs的活力情況，確定SalB最佳給藥濃度。CCK-8試劑盒檢測各分組的吸光度OD值。

1.2.5細(xì)胞分組及藥物處理 ①Control組(5.5 mmol·L-1葡萄糖)，②HG組(25 mmol·L-1葡萄糖)，③HG+SalB組(25 μmol·L-1SalB預(yù)處理CFs 1 h，HG誘導(dǎo))，④HG+Y-27632組(10 μmol·L-1ROCK抑制劑Y-27632預(yù)處理細(xì)胞1 h，HG誘導(dǎo))，⑤HG+Y-27632+SalB組(10 μmol·L-1ROCK抑制劑Y-27632預(yù)處理細(xì)胞1 h，25 μmol·L-1SalB預(yù)處理CFs 1 h，HG誘導(dǎo))

1.2.6免疫熒光實(shí)驗(yàn) 將CFs接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞覆蓋70%視野時(shí)，將各分組加入不同藥物作用24 h，棄培養(yǎng)液，PBS緩沖液清洗；4%多聚甲醛固定40 min，0.5% Triton X-100處理30 min，PBS緩沖液清洗；5% BSA作用30 min；各孔加入稀釋的RhoA一抗溶液(1 ∶100)，4 ℃孵育過夜；PBS漂洗后，加入TRITC標(biāo)記的熒光二抗，室溫下避光靜置孵育1 h；PBS漂洗，DAPI染細(xì)胞核避光5 min，吸出DAPI染液，PBS漂洗，于熒光顯微鏡下拍照保存。

1.2.7Western blot 各組處理因素作用CFs 24 h后，將培養(yǎng)基倒掉，立即放入預(yù)冷的裂解液中，在冰上進(jìn)行操作，使用微量移液器吹打，冰浴中靜置裂解30 min。將裂解好的CFs置于冷凍離心機(jī)離心(10 000×g、4 ℃、25 min)，取上清液，用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定。SDS-PAGE凝膠電泳，用移液器逐個(gè)上樣，上樣量為20 μg。結(jié)束后將PVDF膜于封閉液中室溫封閉1 h，分別加入稀釋后的兔抗大鼠CollagenⅠ一抗、兔抗大鼠CollagenⅢ一抗、兔抗大鼠RhoA一抗、兔抗大鼠ROCK1一抗、兔抗大鼠α-SMA一抗，4 ℃過夜。次日TBST洗膜3次，每次10 min，加入山羊抗兔二抗稀釋液(1:5000)，室溫孵育1 h。TBST清洗后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯影檢測蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 SalB對糖尿病大鼠左室心肌膠原表達(dá)的影響在顯微鏡下膠原組織顯紅色。Control組大鼠左室心肌膠原纖維呈現(xiàn)均勻分布狀態(tài)；與Control組相比，DM組織間隙變大，紅色膠原面積明顯增多；與DM組相比，DM+SalB(80 mg·kg·d-1)、DM+

Fig 1 Effect of SalB on collagen expression in left ventricular myocardium of diabetic rats(×200)A:Control group;B:DM group;C:DM+SalB(80 mg·kg·d-1)group;D:DM+SalB(120 mg·kg·d-1)group;E:DM+SalB(160 mg·kg·d-1)group

SalB(120 mg·kg·d-1)和DM+SalB(160 mg·kg·d-1)各組膠原面積表達(dá)明顯減少，組織間隙明顯減小(Fig 1)。

2.2 SalB對糖尿病大鼠左室心肌組織α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達(dá)的影響Western(Fig 2)顯示：與Control組相比，DM組α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與DM組相比，DM+SalB(80 mg·kg·d-1)組、DM+SalB(120 mg·kg·d-1)和DM+SalB(160 mg·kg·d-1)組α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白水平均降低(P<0.01)，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

Fig 2 Effects of SalB on expression of α-SMA,Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ in left ventricular myocardium of diabetic rats(n=3)1:Control group;2:DM group;3:DM+SalB(80 mg·kg·d-1)group;4:DM+SalB(120 mg·kg·d-1)group;5:DM+SalB(160 mg·kg·d-1)group.**P<0.01 vs Control group；##P<0.01 vs DM group

2.3 不同濃度SalB對高糖誘導(dǎo)CFs活力的影響如Tab 1所示，與Control組相比，HG組(25 mmol·L-1)誘導(dǎo)CFs活力明顯增強(qiáng)(P<0.01)；與HG組相比，不同濃度SalB(12.5、25、50 μmol·L-1)干預(yù)，對CFs活力均出現(xiàn)抑制作用(P<0.05)，25 μmol·L-1SalB給藥組已具有極顯著性差異(P<0.01)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取SalB的給藥濃度為25 μmol·L-1。MG組細(xì)胞無明顯變化(P>0.05)，提示滲透壓對CFs活力無影響。

Tab 1 Effects of different concentrations SalB on the viability of

2.4 SalB對高糖誘導(dǎo)CFs內(nèi)RhoA蛋白表達(dá)的影響免疫熒光結(jié)果實(shí)驗(yàn)顯示(Fig 3)，藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核，紅色熒光代表RhoA，與Control組相比，HG組細(xì)胞RhoA紅色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；與HG組相比，HG+SalB組以及HG+Y-27632組RhoA熒光強(qiáng)度減弱；HG+Y-27632+SalB組RhoA熒光強(qiáng)度減弱更加明顯。

Fig 3 Effect of SalB on expression of RhoA in CFs induced by high glucose(×400)

2.5 SalB對高糖誘導(dǎo)CFs內(nèi)α-SMA、RhoA、ROCK1、CollagenⅠ、CollagenⅢ表達(dá)的影響Western(Fig 4)顯示：與Control組相比，HG組α-SMA、RhoA、ROCK1、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與HG組相比，HG+SalB組與HG+Y-27632組上述蛋白水平降低(P<0.01)；HG+Y-27632+SalB組水平降低更加顯著。

Fig 4 Effects of SalB on expression of α-SMA,RhoA,ROCK1,Collagen Ⅰ,Collagen Ⅲ in CFs induced by high glucose(n=3)1：Control group 2：HG group 3：HG+SalB group 4：HG+Y-27632 group 5：HG+Y-27632 +SalB group.**P<0.01 vs Control group；##P<0.01 vs HG group

3 討論

長期糖尿病會(huì)導(dǎo)致心血管并發(fā)癥的發(fā)生，包括心肌纖維化[5]。心肌纖維化的主要特征是CFs活力增強(qiáng)和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積[6]。CFs是心肌內(nèi)的主要細(xì)胞，約占60%～70%；在心肌細(xì)胞外基質(zhì)中，存在多種類型的膠原蛋白，其中分布最多的主要是膠原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)和膠原蛋白Ⅲ(Collagen Ⅲ)。當(dāng)機(jī)體處于正常的生理狀態(tài)時(shí)，心肌中的膠原蛋白始終處于動(dòng)態(tài)平衡，確保維持心肌組織的正常功能，不斷合成與降解保證結(jié)構(gòu)和功能的完整性，任一膠原蛋白發(fā)生改變，都有可能引起心肌功能的紊亂。本研究中，糖尿病大鼠心肌和高糖誘導(dǎo)CFs的CollagenⅠ和Collagen Ⅲ的表達(dá)出現(xiàn)同步上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)心肌纖維化的形成，和已知文獻(xiàn)[7]保持一致。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用不同劑量的SalB干預(yù)后，糖尿病大鼠左室心肌膠原表達(dá)減少，α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)降低，提示SalB能夠抑制糖尿病大鼠心肌纖維化。

RhoA/ROCK1途徑是一條參與細(xì)胞增殖等多種生物行為的信號通路，與肌動(dòng)蛋白纖維形成有著關(guān)鍵的作用，是一個(gè)重要的分子機(jī)制[8]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的靶點(diǎn)中，ROCK1有調(diào)節(jié)作用，阻斷RhoA/ROCK1通路，可以減輕組織纖維化[9]。糖尿病心肌RhoA活性與肌動(dòng)蛋白聚合有著密切關(guān)聯(lián)，其活性的增強(qiáng)會(huì)引發(fā)ROCK靶點(diǎn)磷酸化增加，從而致使纖維化因子表達(dá)水平增高，引起器官纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

我們前期實(shí)驗(yàn)中，25 mmol·L-1葡萄糖誘導(dǎo)CFs 24 h已出現(xiàn)明顯增殖效果[10]，故本實(shí)驗(yàn)使用此方法模擬高糖狀態(tài)。在本實(shí)驗(yàn)中，高糖誘導(dǎo)CFs 24 h后，CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)水平顯著上升；RhoA、ROCK1以及 α-SMA蛋白表達(dá)水平也均出現(xiàn)上升趨勢；給予ROCK1抑制劑Y-27632及SalB單獨(dú)進(jìn)行預(yù)處理后，上述各蛋白表達(dá)降低；給予Y-27632及SalB雙重因素處理后，二者產(chǎn)生了累加效應(yīng)，各蛋白顯著降低，提示在糖尿病心肌纖維化的進(jìn)程中，高糖可以通過激活RhoA/ROCK1信號通路，膠原蛋白表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)心肌纖維化的形成，而SalB對糖尿病心肌纖維化具有一定的保護(hù)作用，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，在細(xì)胞水平及在體水平，SalB對改善糖尿病心肌纖維化具有一定的作用；其機(jī)制可能與抑制RhoA/ROCK1信號通路有關(guān)。