陳麗華 凌梓韻▲ 李靄燕 吳小桃

1.廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院眼科，廣東廣州 511400；2.廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 511400

糖尿病視網(wǎng)膜病變?yōu)榕R床常見的糖尿病慢性并發(fā)癥，也是當(dāng)前導(dǎo)致成年人失明的主要原因之一。糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期表現(xiàn)為視網(wǎng)膜形成血管瘤、滲血等[1]，病情進(jìn)展到中晚期可出現(xiàn)新生血管、視網(wǎng)膜脫離[2]，給患者的生活帶來嚴(yán)重不良影響。近年來有研究報(bào)道[3-4]，微血管損傷為糖尿病視網(wǎng)膜病變的主要病理基礎(chǔ)，微血管損傷可導(dǎo)致視網(wǎng)膜出血、滲出，進(jìn)而誘發(fā)視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展。因此，減輕或阻止視網(wǎng)膜微血管損傷是防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的主要措施。通絡(luò)明目膏為廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院（我院）中藥房自擬方組成的新膏方，有活血化瘀、通絡(luò)明目、益氣養(yǎng)陰的功效，目前尚處于研究階段，其在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展過程中的防治作用還有待研究。為此，本研究開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以探究通絡(luò)明目膏對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的防治作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60例SD大鼠，屬于無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)別，鼠齡約為6周，生產(chǎn)批號(hào)：20200923，雌雄各半，體重 180～ 250 g，平均（213.02±20.41）g，均飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（許可證號(hào)：NO.44005800005550）。所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，再應(yīng)用隨機(jī)數(shù)表法將其分為空白組、陽(yáng)性對(duì)照組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，每組各10只大鼠。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物處置均符合動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)（審批號(hào)：2020089）。

1.2 藥物和試劑

通絡(luò)明目膏（由三七10 g、黃芪15 g、丹參12 g、玄參 12 g、葛根 20 g、陳皮 6 g、茯苓 20 g、瓜蔞 12 g、法半夏 6 g、熟地黃 20 g、生地黃 20 g、山藥 20 g、山萸肉10 g、澤瀉 12 g、牡丹皮12 g、柴胡12 g、當(dāng)歸5 g、五味子5 g、黨參 15 g、麥冬 15 g、菊花 15 g、青葙子15 g、決明子 15 g、谷精草 15 g、茺蔚子 15 g、山楂5 g、雞血藤20 g、黃明膠2g、龜甲膠2 g所組成）由我院藥學(xué)部提供。羥苯磺酸鈣膠囊（北京京豐制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字H20010795，規(guī)格：0.5 g/粒），實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水將上述藥物配制成實(shí)驗(yàn)所需濃度的溶液。鼠抗兔血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司，產(chǎn)品編號(hào)：ab28775）、鼠抗兔血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體 2：（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2）單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司，產(chǎn)品編號(hào)：ab2349）。

1.3 方法

1.3.1 構(gòu)建糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型 陽(yáng)性對(duì)照組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組以高脂高糖飼料（購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司）飲食聯(lián)合注射2%鏈脲佐菌素溶液（北京索萊寶科技有限公司，規(guī)格：100 mg/支）建立糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型[5]，具體方法：上述5組大鼠予以高脂高糖飼料喂養(yǎng)5周，隨后禁食12 h，經(jīng)大鼠腹腔注射60 mg/kg鏈脲佐菌素[用0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，規(guī)格：100 ml/瓶）配制]。72 h后采集其尾靜脈血測(cè)定其空腹血糖，若大鼠的空腹血糖＞16.7 mmol/L，說明糖尿病大鼠模型建模成功。與此同時(shí)繼續(xù)予以高脂高糖飼料喂養(yǎng)，并每日對(duì)大鼠進(jìn)行眼底鏡檢查，若見大鼠視網(wǎng)膜持續(xù)1周均存有血管瘤、毛細(xì)血管擴(kuò)張，說明糖尿病視網(wǎng)膜病變模型構(gòu)建成功?？瞻捉M大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中予以普通飼料，正常飲食水。

1.3.2 給藥干預(yù) 按人-大鼠體表面積比值折算大鼠的等效劑量，中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組的對(duì)應(yīng)劑量分別為 10、40、60 mg/（kg·d），為臨床等效劑量的0.5、1、3倍，蒸餾水配制灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組羥苯磺酸鈣膠囊劑量為100 mg/（kg·d），蒸餾水配制灌胃；模型組和空白組予以等體積生理鹽水灌胃。每日灌胃相應(yīng)藥物1次，持續(xù)灌胃干預(yù)12周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 HE染色觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 給藥結(jié)束后每組隨機(jī)選擇3只大鼠，以斷頭法將大鼠處死，取大鼠的眼球組織，制作為石蠟切片。常規(guī)進(jìn)行脫蠟、HE染色后在顯微鏡下計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞數(shù)、血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)。

1.4.2 伊文思藍(lán)（evans blue，EB）滲漏實(shí)驗(yàn)觀察大鼠血-視網(wǎng)膜屏障通透性 給藥結(jié)束后每組隨機(jī)選取3只大鼠，以斷頭法將大鼠處死，取出大鼠眼球?qū)⑵湟暰W(wǎng)膜組織分離出來。經(jīng)漂洗、孵育、離心處理后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值，計(jì)算差值，以視網(wǎng)膜干重標(biāo)準(zhǔn)化EB含量描述血-視網(wǎng)膜屏障通透性。

1.4.3 視網(wǎng)膜組織VEGFR-2、VEGF表達(dá)量測(cè)定 采用免疫組化染色法檢測(cè)。藥物干預(yù)后以斷頭法處死每組剩余4只大鼠，取出眼球，制作為石蠟切片。經(jīng)孵育、封閉、滴加一抗、二抗、顯色、復(fù)染、封片處理后，應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析軟件視網(wǎng)膜組織的累積光密度（integrated optical density，IOD）值，用于反映視網(wǎng)膜VEGFR-2、VEGF表達(dá)量。

1.5 觀察指標(biāo)

①比較各組大鼠視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞數(shù)、血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)；②比較各組大鼠視網(wǎng)膜組織EB滲透量；③比較各組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGFR-2、VEGF的IOD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞數(shù)、血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)比較

中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、模型組的視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞數(shù)低于空白組，血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞數(shù)高于模型組，血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。中藥低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組的視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞數(shù)、血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。中藥高劑量組視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞數(shù)高于中藥低劑量組、中藥中劑量組，血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)低于中藥低劑量組、中藥中劑量組，呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見表1。HE染色鏡檢見圖1。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞數(shù)和血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)，x ± s）

圖1 鏡檢下各組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞排列情況（HE染色，200×）

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織EB滲透量比較

空白組大鼠視網(wǎng)膜EB滲透量為（4.07±0.21）ng/mg，模 型 組 為（24.94±1.23）ng/mg，陽(yáng)性對(duì)照組為（14.47±0.84）ng/mg，中藥低劑量組為（16.87±2.28）ng/mg，中藥中劑量組為（11.45±1.43）ng/mg，中藥高劑量組為（8.24±0.79）ng/mg，多組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=93.716，P=0.000）。中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、模型組的視網(wǎng)膜組織EB滲透量高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組的EB滲透量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。中藥高劑量組、中藥中劑量組的EB滲透量低于中藥低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。中藥低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組的EB滲透量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGFR-2、VEGF的IOD值比較

空白組的視網(wǎng)膜組織VEGFR-2、VEGF的IOD值顯著低于其他組別（P＜ 0.05）。中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組視網(wǎng)膜組織中VEGFR-2、VEGF的IOD值顯著低于模型組（P＜ 0.05）。中藥高劑量組的 VEGFR-2、VEGF 的IOD值明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜ 0.05）。陽(yáng)性對(duì)照組與中藥低劑量組、中藥中劑量組的視網(wǎng)膜組織VEGFR-2、VEGF的IOD值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見表2。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGFR-2、VEGF的IOD值比較（x ± s）

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變的病理特征主要是視網(wǎng)膜血管微循環(huán)障礙，具體表現(xiàn)為視網(wǎng)膜組織血流動(dòng)力學(xué)及血液流變學(xué)改變[6]。糖尿病患者機(jī)體長(zhǎng)期處于高血糖水平，易導(dǎo)致視網(wǎng)膜的血-視網(wǎng)膜屏障受損，促使血小板活化凝聚，進(jìn)而影響視網(wǎng)膜血液流變學(xué)，造成視網(wǎng)膜毛細(xì)血管狹窄堵塞，出現(xiàn)視網(wǎng)膜無灌注區(qū)。隨著視網(wǎng)膜微循環(huán)障礙程度加重，視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞逐漸丟失，由于血管周細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密接觸，故周細(xì)胞丟失可促使內(nèi)皮細(xì)胞變薄，或?qū)е缕湓鲋?、分化、遷移，誘使新生血管形成[7-8]。由此可見，保護(hù)視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞是糖尿病視網(wǎng)膜病變治療的關(guān)鍵。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，糖尿病視網(wǎng)膜病變與“消渴”密切相關(guān)，病機(jī)以氣陰虛為本，痰濁瘀血為標(biāo)[9]。通絡(luò)明目膏是我院的院內(nèi)制劑，其方中熟地黃、山萸肉、黃明膠、龜甲膠、麥冬、五味子、澤瀉滋養(yǎng)肝腎之陰，清瀉虛火；茺蔚子、三七、丹參、當(dāng)歸、雞血藤、山楂活血化瘀通絡(luò)；黨參、黃芪、山藥、茯苓健脾益氣；生地黃、玄參、牡丹皮清熱養(yǎng)陰；決明子、菊花、青葙子、谷精草清熱明目退翳；葛根、柴胡、陳皮理氣升發(fā)清陽(yáng)，引藥上行，藥達(dá)病所；瓜蔞、法半夏化痰散結(jié)。諸藥配伍發(fā)揮活血化瘀、通絡(luò)明目、益氣養(yǎng)陰的作用。

在胚胎血管成熟過程中，周細(xì)胞被認(rèn)為決定著血管從新生到成熟的過程，其可通過多種細(xì)胞因子途徑被募集到新生的血管周圍，改善視網(wǎng)膜微循環(huán)，但一旦周細(xì)胞募集被抑制可引起血管異常重構(gòu)，故周細(xì)胞數(shù)量升高提示視網(wǎng)膜血管病變得以改善。與此同時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移為新生血管形成的主要環(huán)節(jié)之一，故視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量減少能夠有效抑制新生血管生成。此外，有研究指出，通過檢測(cè)視網(wǎng)膜血管內(nèi)EB含量，可利用EB的特性比較精確地衡量早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變中血-視網(wǎng)膜通透性改變情況，故EB含量越低，提示視網(wǎng)膜血管滲漏下降。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠予以通絡(luò)明目膏干預(yù)，結(jié)果顯示，中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞數(shù)顯著高于模型組，且血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)、EB滲透量顯著低于模型組（P＜ 0.05），與陳茜等[10]研究相符，證實(shí)通絡(luò)明目膏可有效改善糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜微循環(huán)，保護(hù)視網(wǎng)膜周細(xì)胞，減少血管滲漏，進(jìn)而抑制新生血管形成，使其對(duì)視網(wǎng)膜病變有良好的防治作用。

VEGF及其受體是在糖尿病視網(wǎng)膜病變毛細(xì)血管增生機(jī)制中起著關(guān)鍵作用的生長(zhǎng)因子[11]，其作用主要是促進(jìn)新生血管形成和提高血管通透性，是當(dāng)前臨床研究中已知極強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增強(qiáng)劑[12]。相關(guān)研究報(bào)道[13-14]，VEGF及其受體表達(dá)水平與糖尿病視網(wǎng)膜病變的病程呈正相關(guān)，隨著糖尿病視網(wǎng)膜病情加重，視網(wǎng)膜增殖變化更為顯著，VEGF/VEGFR-2表達(dá)水平最值升高。另有文獻(xiàn)指出[15]，VEGF與VEGFR-2有協(xié)同作用，收縮血管作用顯著，可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，血管完整性受到破壞。本研究中，空白組的視網(wǎng)膜組織VEGFR-2、VEGF的IOD值顯著低于其他組別，但中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組視網(wǎng)膜組織中VEGFR-2、VEGF的IOD值顯著低于模型組，與秦裕輝等[16]研究結(jié)果相似，進(jìn)一步說明糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜VEGFR-2、VEGF呈高表達(dá)，而通絡(luò)明目膏可能通過下調(diào)VEGF、VEGFR-2水平，進(jìn)而抑制其相互作用，改善微循環(huán)障礙，進(jìn)而對(duì)視網(wǎng)膜微血管損傷發(fā)揮修復(fù)作用。與此同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)中藥高劑量組的大鼠視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞數(shù)顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組，血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)、EB滲透量以及VEGFR-2、VEGF的IOD值顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組，提示通絡(luò)明目膏對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠的微血管保護(hù)作用呈一定的量效關(guān)系，且劑量愈高，其對(duì)大鼠視網(wǎng)膜微血管的改善及保護(hù)作用就愈強(qiáng)，這可為臨床應(yīng)用通絡(luò)明目膏用量提供參考。但本研究存在樣本量少、未對(duì)通絡(luò)明目膏安全性進(jìn)行研究等不足之處，故今后需擴(kuò)大樣本量，增加觀察指標(biāo)，進(jìn)行更高水平層次探討通絡(luò)明目膏量效關(guān)系及其作用機(jī)制，為臨床推廣應(yīng)用提供高質(zhì)量循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

綜上所述，通絡(luò)明目膏可對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠微血管發(fā)揮良好的保護(hù)作用，有效改善大鼠視網(wǎng)膜微血管形態(tài)學(xué)及通透性，且該保護(hù)作用具有一定的量效關(guān)系，其作用機(jī)制可能與下調(diào)VEGFR-2、VEGF表達(dá)有關(guān)。