任濤 張開(kāi)偉

1貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽(yáng) 550025；2貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科，貴陽(yáng) 550001

肩關(guān)節(jié)周?chē)资且环N以肩部疼痛、關(guān)節(jié)僵硬和運(yùn)動(dòng)功能障礙為主要特征的肩部周?chē)浗M織疾病，患者肩部疼痛，夜間疼痛為甚，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1-2］。肩關(guān)節(jié)周?chē)椎陌l(fā)病率為2%～5%，約占肩部疾病的42%［3-5］。因此，迫切需要找到治療該病的方法。目前，西醫(yī)治療肩關(guān)節(jié)周?chē)椎闹饕椒ㄓ锌诜幬?、局部麻醉、局部阻斷治療、物理治療和手術(shù)治療等［4］。手術(shù)治療適應(yīng)證有限，費(fèi)用高，風(fēng)險(xiǎn)大［6］。雖然還有很多其他的治療方法，但只能暫時(shí)緩解癥狀，遠(yuǎn)期效果不佳，且西藥口服有一定的不良反應(yīng)［7］。隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展，其在治療肩關(guān)節(jié)周?chē)字芯哂酗@著優(yōu)勢(shì)，膏藥不良反應(yīng)小、使用簡(jiǎn)便［8］，對(duì)治療肩關(guān)節(jié)周?chē)拙哂兄匾呐R床意義。

既往研究表明，膏藥具有溫陽(yáng)活血的作用，對(duì)于寒凝血瘀型肩周炎的止痛效果好［9］。筋痛靈膏是張開(kāi)偉教授根據(jù)貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院沈馮君名老中醫(yī)“以筋為先，筋骨并重，筋病及骨”的學(xué)術(shù)思想整理而得，其是張開(kāi)偉教授在臨床上長(zhǎng)期外用治療肩關(guān)節(jié)周?chē)?、肌筋膜炎的?jīng)驗(yàn)用方，由川烏、半夏、天南星、乳香、沒(méi)藥5種藥物組成，對(duì)肩關(guān)節(jié)周?chē)?，肌筋膜炎的臨床療效顯著，方中君藥為川烏，臣藥為天南星，佐藥為半夏，使藥為乳香、沒(méi)藥，全方具有散寒除濕、舒筋活血、通絡(luò)止痛的作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門(mén)基于疾病基因藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的新興學(xué)科，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)相互作用研究中醫(yī)藥的基礎(chǔ)生物學(xué)知識(shí)，幫助我們闡明生物分子水平中藥有效成分的藥理作用機(jī)制。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，預(yù)測(cè)筋痛靈膏治療肩關(guān)節(jié)周?chē)椎乃幚碜饔脵C(jī)制，為后期實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。

資料與方法

1、數(shù)據(jù)處理軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)

所用數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件包括：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）（https：∕∕old.tcmsp-e.com∕tcmsp.php）、Uniprot（http：∕∕www.uniprot.org∕）、GeneCards（https：∕∕www.genecards.org∕）、PharmGkb（https：∕∕www.pharmgkb.org∕）、TTD（http：∕∕db.idrblab.net∕ttd∕）、DrugBank（https：∕∕www.drugbank.ca∕）、OMM（https：∕∕omim.org∕）、Cytoscape（http：∕∕cytoscape.org∕）、STRING（https：∕∕string-db.org∕）、PubChem（https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov∕）、RCSB PDB（https：∕∕www.rcsb.org）、OpenBabel軟件、R軟件、PyMOL、Autodock vina。

2、筋痛靈膏活性成分及其靶點(diǎn)的篩選

筋痛靈膏藥物的主要成分通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)檢索，選擇口服生物利用度（OB）≥30%和類(lèi)藥性（DL）≥0.18作為篩選指標(biāo)。篩選后獲取篩選藥物有效成分和靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，并在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)查找對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)和靶基因名稱(chēng)。

3、肩關(guān)節(jié)周?chē)装悬c(diǎn)獲取

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCard、OMIM、pharmGkb、TTD、DrugBank）檢索關(guān)鍵詞“periarthritis of shoulder”，獲取疾病靶點(diǎn)。然后，整理并刪除重復(fù)項(xiàng)，運(yùn)用Venny2.1.0平臺(tái)得出藥物和疾病靶點(diǎn)的交集，從而獲得筋痛靈膏治療肩關(guān)節(jié)周?chē)椎淖饔没虬悬c(diǎn)并繪制韋恩圖。

4、網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將藥物活性成分和疾病靶點(diǎn)輸入到Cytoscape3.7.2軟件中來(lái)構(gòu)建復(fù)合靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。使用節(jié)點(diǎn)和節(jié)點(diǎn)之間的連接來(lái)分別表示網(wǎng)絡(luò)中的藥物活性成分∕靶標(biāo)和相互作用。

5、蛋白質(zhì)相互網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建

在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入交集靶標(biāo)進(jìn)行PPI數(shù)據(jù)分析，將物種設(shè)置為“人類(lèi)”，高置信水平設(shè)置為0.400。在Cytoscape3.7.2軟件中導(dǎo)入tsv格式，然后利用disgenet和CytoNCA插件來(lái)鑒定核心基因從而篩選出核心靶標(biāo)。

6、基因本體論（GO）和京都基因與基因組大百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）通路富集分析

將交集基因?qū)雖etascape，并利用R軟件中的Bioconductor包進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

7、分子對(duì)接

在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)和PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中分別下載小分子受體2D結(jié)構(gòu)和蛋白受體，通過(guò)SailVina平臺(tái)進(jìn)行Autodock vina分子對(duì)接，并利用Pymol2.3.4可視化處理。

結(jié) 果

1、筋痛靈膏活性成分及靶基因

通過(guò)檢索得到76個(gè)筋痛靈膏的活性成分，包括川烏3個(gè)，半夏13個(gè)，天南星7個(gè)，乳香8個(gè)，沒(méi)藥45個(gè)（表1）。

表1 筋痛靈膏的部分有效成分

2、靶點(diǎn)結(jié)果

通過(guò)在GeneCard、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中得到肩周炎相關(guān)靶點(diǎn)3 411個(gè)，然后，將筋痛靈膏與肩關(guān)節(jié)周?chē)紫嚓P(guān)靶點(diǎn)通過(guò)Venny平臺(tái)進(jìn)行交集，得到共有基因121個(gè)（圖1）。

圖1 筋痛靈膏藥物和疾病靶點(diǎn)交集基因韋恩圖

3、目標(biāo)網(wǎng)絡(luò)及分析

活性成分分-靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)由Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建（圖2）。圓形節(jié)點(diǎn)代表了筋痛靈膏的活性成分，每條邊描述了功能成分與靶基因之間的關(guān)系。綠色表示沒(méi)藥的活性成分，紫色表示半夏的活性成分，粉紅色表示川烏的活性成分。由圖2中可以看出，連接到較多的靶標(biāo)分別是槲皮素（MOL000098）、豆 甾 醇（MOL000449）、β-谷 甾 醇（MOL000358）和黃芩素（MOL002714）。

圖2 筋痛靈膏的活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

4、PPI網(wǎng)絡(luò)分析

網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯瑢⒔钔挫`膏的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Bisogenet中，限定研究物種為“Homo Sapiens”得到蛋白互相關(guān)系，并運(yùn)用Cytoscape軟件中的插件CytoNCA，設(shè)置DC＞61和BC＞200。并 對(duì)degree取2倍 中 位 數(shù) 和 其 中Betweenness、Closeness、BC、LAC、CC、NC中位值打分獲得核心靶點(diǎn)：JUN（度值52）、ESR1（度值42）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）14（度值24）、MAPK1（度值18）、TP53（度值20）。篩選得到富集程度高的蛋白互作關(guān)系，構(gòu)建PPI核心網(wǎng)絡(luò)圖。見(jiàn)圖3。

圖3 筋痛靈膏治療肩關(guān)節(jié)周?chē)椎鞍踪|(zhì)相互網(wǎng)絡(luò)圖

5、GO和KEGG分析

藥物和疾病基因通過(guò)R3.7.2軟件來(lái)進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析。共得到2 272個(gè)GO富集結(jié)果，包括2 029個(gè)生物過(guò)程（BP）、60個(gè)細(xì)胞組分（CC）以及183個(gè)分子功能（MF）。BP、CC和MF的前10項(xiàng)分別如圖4所示。BP主要富集在異生素刺激的反應(yīng)、傷口愈合、細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)和氧氣水平的反應(yīng)等方面。CC主要涉及到膜微區(qū)和膜筏。MF主要體現(xiàn)在DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等方面。采用KEGG信號(hào)通路分析方法來(lái)確定與筋痛靈膏治療肩關(guān)節(jié)周?chē)紫嚓P(guān)的信號(hào)通路，共篩選出171個(gè)KEGG富集通路。根據(jù)P＜0.05，繪制了前30條KEGG通路結(jié)果的柱狀圖（圖5）。在KEGG通路中，筋痛靈膏治療肩關(guān)節(jié)周?chē)字饕患诎准?xì)胞介素（IL）17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路等（圖6）。

圖5 基因本體論（GO）功能富集分析結(jié)果

圖6 京都基因與基因組大百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）通路富集分析結(jié)果

6、分子對(duì)接結(jié)果

通過(guò)篩選出來(lái)的核心靶點(diǎn)蛋白（JUN、TP53、RELA、MAPK14、MAPK1）和對(duì)應(yīng)的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，以結(jié)合能≤-5.0 kJ∕mol作為標(biāo)準(zhǔn)。分子對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)核心靶點(diǎn)蛋白與活性成分對(duì)接后結(jié)合能均小于-5.0 kJ∕mol（圖7），表明關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白之間具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)槲皮素（MOL000098）與JUN結(jié)合能力最好，為-9.2 kJ∕mol。

圖7 分子對(duì)接圖（A為JUN—槲皮素，B為T(mén)P53—黃芩素，C為T(mén)P53—槲皮素，D為MAPK14—牽?；ㄉ?，E為MAPK1—槲皮素，F(xiàn)為RELA—槲皮素）

討 論

肩關(guān)節(jié)周?chē)资且环N發(fā)病率高且疼痛大的疾病。目前，肩關(guān)節(jié)周?chē)追乐畏椒ǘ喾N多樣，非甾體類(lèi)抗炎藥物、關(guān)節(jié)鏡松解、推拿療法、中藥內(nèi)服等，其中膏藥外敷也是治療肩關(guān)節(jié)周?chē)椎闹匾侄危?0-12］。然而，膏藥治療肩關(guān)節(jié)周?chē)椎淖饔脵C(jī)制尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為研究中草藥的復(fù)雜藥理機(jī)制提供了新的方法。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)來(lái)探索筋通靈膏治療肩關(guān)節(jié)周?chē)椎淖饔脵C(jī)理。筋痛靈膏的有效成分和作用靶點(diǎn)通過(guò)TCMSP獲得，其中潛在有效成分53個(gè)，作用靶標(biāo)24個(gè)。根據(jù)degree值得到槲皮素、谷甾醇、β-谷甾醇、黃芩素連接比較多的靶點(diǎn)。

槲皮素能抑制IL-17和TNF-α，提高免疫功能，達(dá)到消炎和鎮(zhèn)痛的作用［13］。據(jù)報(bào)道，槲皮素能清除缺氧，提高p-MAPK蛋白表達(dá)水平，減少缺氧對(duì)細(xì)胞的損傷［14］。β-谷甾醇具有抗炎作用［15］。有科學(xué)研究證實(shí)β-谷甾醇有抑制破骨細(xì)胞，保護(hù)成骨細(xì)胞，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的功能［16］，而豆甾醇則有消炎、鎮(zhèn)痛的功效［17］。據(jù)報(bào)道豆甾醇能夠?qū)π∈筇弁串a(chǎn)生鎮(zhèn)痛的效果［18］。Ahmad Khan等［19］研究表明豆甾醇通過(guò)抑制p38MAPK和NFkBp6通路，防治關(guān)節(jié)炎的主要藥物。黃芩素具有顯著抗炎效果，可以減少I(mǎi)L-1β、IL-6、TNF-ɑ，抑制細(xì)胞凋亡，改善關(guān)節(jié)軟骨的作用［20］。這些結(jié)果表明核心成分在治療肩關(guān)節(jié)周?chē)字衅鹬匾饔谩?/p>

通過(guò)PPI篩選得到的核心靶點(diǎn)（TP53、ESR1、JUN、MAPK1）是治療肩關(guān)節(jié)周?chē)椎年P(guān)鍵靶點(diǎn)。TP53與細(xì)胞免疫相關(guān)，對(duì)人體免疫應(yīng)答能力有重要的影響［21］。TP53可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和增殖來(lái)影響細(xì)胞衰老和凋亡［22-23］。MAPK參加了細(xì)胞因子與受體結(jié)合后調(diào)控轉(zhuǎn)錄的進(jìn)程，對(duì)生物細(xì)胞的繁殖、分化、應(yīng)激適應(yīng)和炎性反應(yīng)具有重要的調(diào)控作用［24］。JUN作為一種原癌基因，它編碼的c-JUN蛋白是轉(zhuǎn)錄因子AP-1家族的重要一員，在控制細(xì)菌的增殖、分化、侵染和凋亡方面起著關(guān)鍵作用［25-26］。

KEGG分析結(jié)果顯示，IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路等與肩關(guān)節(jié)周?chē)椎姆乐涡Ч嘘P(guān)。而AGE-RAGE通路也與炎癥的產(chǎn)生相關(guān)，它能夠升高M(jìn)APK磷酸化作用水平，從而提高了TNF-α、IL-1和IL-6等炎癥因子的表達(dá)［27］。IL-17為IL的一種，參與炎性反應(yīng)。有研究表明，IL-17是關(guān)節(jié)炎發(fā)生的重要因素，IL-17的減少可緩解人體軟骨破壞抑制炎性因子的表現(xiàn)［28］。TNF信號(hào)通路既有抗腫瘤作用，又有炎癥介質(zhì)功能。TNF-α是肩袖損傷患者的磨損肌腱組織和肩峰下滑囊組織中常見(jiàn)的炎癥細(xì)胞因子［29］。這些通路與人體免疫相關(guān)，可能是筋痛靈膏通過(guò)這些通路調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，從而達(dá)到治療肩關(guān)節(jié)周?chē)椎淖饔谩?/p>

本研究對(duì)筋痛靈膏的核心靶點(diǎn)蛋白（JUN、TP53、RELA、MAPK14、MAPK1）與對(duì)應(yīng)的活性成分（槲皮素、β-谷甾醇、谷甾醇和黃芩素）進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示，核心靶點(diǎn)蛋白與活性成分對(duì)接的親和力小于-5.0 kJ∕mol，表明關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白之間具有較好結(jié)合活性。此外，本研究還發(fā)槲皮素與JUN結(jié)合能力最好，為-9.2 kJ∕mol。分子對(duì)接表明筋痛靈膏可能通過(guò)靶向這些核心靶點(diǎn)蛋白在肩關(guān)節(jié)周?chē)字邪l(fā)揮作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)筋痛靈膏通過(guò)槲皮素、谷甾醇等化學(xué)成分作用于JUN、TP53、RELA等關(guān)鍵靶點(diǎn)，在IL-17、TNF等信號(hào)通路下調(diào)節(jié)免疫力，減低炎性反應(yīng)，從而達(dá)到防治肩關(guān)節(jié)周?chē)椎男Ч?，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突