李嶺慧，廖 婉#，張 倩，余方坤，譚立偉，李章才，胡瓊丹，張心潔，廖洋樣，侯曙光, *，李 銳*

·藥劑與工藝·

基于Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化姜黃素-乳鐵蛋白納米粒制備工藝和體外評價(jià)研究

李嶺慧1, 2，廖 婉1, 2#，張 倩1,2，余方坤1, 2，譚立偉3，李章才3，胡瓊丹1, 2，張心潔1, 2，廖洋樣1, 2，侯曙光1, 2, 3*，李 銳1, 2*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué) 西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137 2. 四川普銳特藥業(yè)有限公司，四川 成都 610041

運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化姜黃素-乳鐵蛋白納米粒（curcumin-lactoferrin nanoparticles，Cur-LF-NPs）的制備處方工藝。采用去溶劑化法制備Cur-LF-NPs，基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇反溶劑/溶劑體積比、乳鐵蛋白/ 姜黃素投料比和pH值作為后續(xù)Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的考察因素；以包封率、粒徑和多分散系數(shù)經(jīng)CRITIC權(quán)重分析計(jì)算后得到的綜合評分作為評價(jià)指標(biāo)，使用Design Expert 10軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合并驗(yàn)證優(yōu)化后的處方工藝。最后對納米粒形態(tài)、粒徑電位、載藥能力、穩(wěn)定性及體外釋放行為等進(jìn)行表征評價(jià)。經(jīng)優(yōu)化后的制備工藝條件為反溶劑/溶劑體積比16∶1、乳鐵蛋白/姜黃素投料比8∶1、pH值為6。Cur-LF-NPs粒徑為（72.6±5.2）nm、PDI為0.084±0.015、ζ電位為（24.5±3.7）mV，包封率（94.8±1.6）%、載藥量（10.2±0.5）%。Cur-LF-NPs體外釋放相較于姜黃素原料藥具有一定的緩釋效果。經(jīng)Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法篩選獲得制備Cur-LF-NPs的最佳處方工藝，該制劑粒徑均一、載藥能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好，為后續(xù)的體內(nèi)外研究提供穩(wěn)定的制劑基礎(chǔ)。

姜黃素；乳鐵蛋白納米粒；Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法；CRITIC權(quán)重分析；制備工藝篩選

姜黃素主要來源于姜科姜黃屬多年生草本植物姜黃L.的根莖[1]。作為世界公認(rèn)的藥食同源物質(zhì)之一，姜黃素既可作為食品調(diào)味劑和著色劑[2]，也有研究報(bào)道其具有抗氧化、抗炎、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和神經(jīng)保護(hù)等藥理活性[3]。基于明確的神經(jīng)保護(hù)藥效作用，姜黃素被廣泛開展于如阿爾茨海默癥[4]、帕金森病[5]及腦缺血[6]等腦神經(jīng)退化/損傷疾病治療的研究。然而，與大多數(shù)天然活性化合物相似，水溶性差、口服生物利用度低等成藥性缺陷限制了姜黃素在臨床中的應(yīng)用。不僅如此，對于腦部疾病，游離藥物靶向性缺失及特殊的生理屏障-血腦屏障（blood brain barrier，BBB）[7]則進(jìn)一步限制藥物進(jìn)入腦部發(fā)揮藥效。近年來，納米載藥技術(shù)的發(fā)展為藥物的腦靶向遞送提供了一系列研發(fā)策略，如脂質(zhì)體[8]、微乳液[9]、膠束[10-11]等納米制劑和細(xì)胞穿膜肽（CPPs）[12]、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[13]（如轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白）等修飾技術(shù)均有效提高了藥物在腦組織的富集。其中，作為人體內(nèi)源性物質(zhì)的乳鐵蛋白，不僅可實(shí)現(xiàn)對于BBB的高效透過[14]及神經(jīng)損傷部位的主動(dòng)靶向[15]，還因其來源廣泛[16]、可結(jié)合基團(tuán)多[17]、生物相容性高[18]等優(yōu)點(diǎn)，具有成為藥物腦部遞送候選載體的潛力。

乳鐵蛋白是相對分子質(zhì)量約為80 000的單體糖蛋白，等電點(diǎn)（PI）為8.0～8.5[19]。將其作為納米載體包載姜黃素治療神經(jīng)退行性疾病有多方面優(yōu)勢。其一，乳鐵蛋白生物相容性高，是具有營養(yǎng)價(jià)值的美國GRAS認(rèn)證原料[20]；其二，乳鐵蛋白具有腦靶向作用，乳鐵蛋白受體在腦內(nèi)皮細(xì)胞和與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的神經(jīng)元中高度表達(dá)[21]；其三，乳鐵蛋白具有改善神經(jīng)系統(tǒng)的功能。衰老和神經(jīng)退化的大腦中含有較高水平的鐵，其作為鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠通過與鐵的螯合作用來減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)和改善鐵代謝來保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[22]。綜上所述，將姜黃素包載于乳鐵蛋白中有助于實(shí)現(xiàn)其腦組織高效遞送及兩者在神經(jīng)損傷中的協(xié)同治療作用。

盡管目前關(guān)于乳鐵蛋白納米粒的制備方法已有相關(guān)報(bào)道，但制備工藝中非藥用交聯(lián)劑[23]、有毒有機(jī)試劑的使用[24]，使制劑的安全性有待商榷。因此，本研究采用去溶劑化法制備姜黃素-乳鐵蛋白納米粒（curcumin-lactoferrin nanoparticles，Cur-LF-NPs），通過Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法篩選提供了一種簡單、安全的處方工藝，并制備出粒徑均一、載藥能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好的Cur-LF-NPs，以期為后續(xù)的體內(nèi)外評價(jià)建立制劑基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Agilent 1260 Infinity II型高效液相色譜儀（HPLC），美國Agilent公司；XS205DU型十萬分之一電子天平、S210型pH計(jì)，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；WH620型加熱磁力攪拌器，WIGGENS公司；Biosafer 900-92型超聲波細(xì)胞破碎儀，南京賽飛生物科技有限公司；TG-1850型臺(tái)式高速離心機(jī)，上海錦玟儀器設(shè)備有限公司；SCIENTZ-10N型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；SHA-C型水浴恒溫振蕩器，江蘇科析儀器有限公司；Milli-Q超純水儀，德國Merck公司；NanoBrook 90 Plus PALS粒度儀，美國Brookhaven公司；HT7800型透射電子顯微鏡（TEM），日立公司；Victor Nivo型全自動(dòng)酶標(biāo)儀，PerkinElmer公司。

乳鐵蛋白（批號A16GS145363，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%）、甘露醇（批號M24GS149532，AR級）、海藻糖（批號S28J12H138585，BR級）均購自上海源葉生物科技有限公司；姜黃素（批號C12811019，AR級）購自成都麥克林生物科技有限公司；姜黃素對照品（批號PS012299，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%）購自成都普思生物科技股份有限公司；CE型透析袋（相對分子質(zhì)量8000～10 000），冰醋酸、乙腈和甲醇為HPLC級，無水乙醇為AR級，購自成都科隆化學(xué)品有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 Cur-LF-NPs溶液的制備

參考Hasanpoor等[25]報(bào)道的去溶劑化法制備Cur-LF-NPs。稱取48 mg乳鐵蛋白超聲溶于16 mL超純水中，加入5%檸檬酸鈉調(diào)節(jié)pH值至6，冰箱放置過夜以充分溶解，為反溶劑相；將6 mg姜黃素超聲溶于1 mL無水乙醇中，為溶劑相。使用注射器將姜黃素乙醇溶液以1 mL/min的速率緩慢地滴入磁力攪拌（400 r/min）中的乳鐵蛋白溶液，隨后在探針超聲儀上勻化制得的納米粒（功率900 W，振幅10%，開2 s、關(guān)3 s，循環(huán)2 min）。最后通過4000 r/min離心10 min以分離游離姜黃素，上清液過0.22 μm微孔濾膜即得Cur-LF-NPs溶液?？瞻譒F-NPs的制備除不加姜黃素外同法制備。

2.2 包封率、載藥量的測定

2.2.1 離心沉淀-濾膜法測定包封率 姜黃素極難溶于水，未包封的游離藥物常以微晶的形式存在于溶液中[26]，故通過離心聯(lián)合濾過的方式除去游離姜黃素。具體操作方法為取1 mL“2.1”項(xiàng)下探針超聲前的Cur-LF-NPs置于20 mL量瓶中，加入適量甲醇超聲破壞納米粒，冷卻后加甲醇定容，采用HPLC法測得的藥物質(zhì)量濃度為加入藥物總量（t）；吸取“2.1”項(xiàng)下離心-過膜后的Cur-LF-NPs 1 mL同上法處理后測得的質(zhì)量濃度為被包封藥物的量（e），包封率按下列公式求得。

包封率＝e/t

2.2.2 載藥量 將Cur-LF-NPs冷凍干燥48 h后儲(chǔ)存于棕色干燥器中，備用。精密稱取Cur-LF-NPs凍干粉（總）至20 mL量瓶中，加入適量甲醇超聲破壞納米粒，冷卻后加甲醇定容，采用HPLC法測得的質(zhì)量濃度為凍干粉中藥物的量（藥），載藥量按下列公式求得。

載藥量＝藥/總

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 色譜條件 色譜系統(tǒng)為Agilent 1260 Infinity II型HPLC系統(tǒng)；色譜柱為Aglient Zorbax Eclipse Plus C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相為4%冰醋酸-乙腈（52∶48）；檢測波長430 nm；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；保留時(shí)間7.8 min左右；理論塔板數(shù)大于12 000。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取姜黃素對照品24.00 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度線，配制成質(zhì)量濃度為472.8 μg/mL的對照品母液。移取相應(yīng)體積的對照品母液，用甲醇稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.76、3.78、18.91、47.28、70.92、94.56、141.84 μg/mL的一系列對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取1 mL“2.1”項(xiàng)下的Cur-LF-NPs溶液至50 mL量瓶中，加入適量甲醇超聲破壞納米粒，冷卻至室溫后用甲醇稀釋至刻度線，即得；空白LF-NPs供試品溶液同法制備。

2.3.4 專屬性考察 分別取空白LF-NPs供試品溶液、Cur-LF-NPs供試品溶液和姜黃素對照品溶液按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。色譜圖見圖1，空白LF-NPs供試品溶液未出現(xiàn)干擾峰，且Cur-LF-NPs供試品溶液和姜黃素對照品溶液出峰時(shí)間一致，證明該色譜方法專屬性良好。

圖1 空白LF-NPs溶液(A)、Cur-LF-NPs供試品溶液(B)和姜黃素對照品(C) 的HPLC圖

2.3.5 線性關(guān)系考察 將“2.3.2”項(xiàng)下配制的0.76、3.78、18.91、47.28、70.92、94.56、141.84 μg/mL一系列對照品溶液按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（），得線性回歸方程＝58 893－20 895，2＝0.999 8，結(jié)果表明姜黃素在0.76～141.84 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 取低、中、高質(zhì)量濃度（0.76、47.28、141.84 μg/mL）的姜黃素對照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件，在同一天9:00、15:00、21:00時(shí)，將每個(gè)質(zhì)量濃度連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)間峰面積的RSD值，分別為0.72%、0.12%、0.18%，可見日內(nèi)精密度良好。連續(xù)3 d在9:00時(shí)將每個(gè)質(zhì)量濃度連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算3 d間峰面積的RSD值，分別為0.89%、0.44%、0.46%，可見日間精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取新鮮制備的Cur-LF-NPs溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下方法平行制得6份供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示姜黃素平均質(zhì)量濃度為298.6 μg/mL，RSD為0.48%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.4”項(xiàng)下方法處理后的供試品溶液，于0、6、12、24、48 h進(jìn)樣測定姜黃素含量，計(jì)算其RSD為1.48%，結(jié)果顯示供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下方法配制一定質(zhì)量濃度的Cur-LF-NPs供試品溶液，精密吸取1 mL置10 mL量瓶中，超聲破壞納米粒后用甲醇稀釋至刻度線，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算供試品質(zhì)量濃度。取9份1 mL上述供試品溶液分別置于10 mL量瓶中，分為3組，每組3份；分別加入1 mL 70.92、94.56、141.84 μg/mL姜黃素對照品溶液，同上法破壞納米粒后進(jìn)樣測定，計(jì)算姜黃素的加樣回收率。結(jié)果顯示，各組樣品的平均回收率分別為96.3%、95.1%、96.1%，RSD分別為1.07%、1.03%、0.95%，可見本實(shí)驗(yàn)回收率良好。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對反溶劑/溶劑體積比、乳鐵蛋白/姜黃素投料比、pH值、磁攪轉(zhuǎn)速、超聲時(shí)間和超聲功率進(jìn)行單因素考察實(shí)驗(yàn)，以包封率和粒徑作為評價(jià)指標(biāo)，為后續(xù)Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)初篩對Cur-LF-NPs制備過程中影響較大的實(shí)驗(yàn)因素。

2.4.1 反溶劑/溶劑體積比 固定乳鐵蛋白/姜黃素投料比10∶1，pH值為6、磁攪轉(zhuǎn)速400 r/min、探針超聲（45 W、2 min）?？疾旆慈軇?溶劑體積比為4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1時(shí)對Cur-LF-NPs包封率和粒徑的影響，結(jié)果見表1。文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[27]表明，乳鐵蛋白具有親水區(qū)和疏水區(qū)，姜黃素主要依靠疏水作用力和氫鍵作用力與之結(jié)合。制備過程中，藥物分子需要進(jìn)入靶標(biāo)蛋白結(jié)合空腔，因此，加入適量的乙醇可以與存在于靶標(biāo)蛋白結(jié)合空腔中的水形成氫鍵，以促進(jìn)空腔中水分子的外排[28]，從而增加姜黃素與靶標(biāo)蛋白結(jié)合空腔的締合效率，提高藥物包封率。然而，制備體系中如果存在大量的乙醇便會(huì)與蛋白質(zhì)之間形成氫鍵，從而破壞其內(nèi)部原有的氫鍵結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)變性[29]，引起蛋白質(zhì)沉淀、溶液渾濁，藥物包封率降低。由表1可知，當(dāng)反溶劑/溶劑體積比小于4∶1時(shí)，體系中含有較大比例的乙醇，包封率較低；隨著反溶劑/溶劑體積比增加至8∶1及以上時(shí)，包封率顯著增大；當(dāng)反溶劑/溶劑比超過16∶1時(shí)，體系中較低的乙醇含量不能提供足夠的去溶劑化能，即無法較好地排出靶標(biāo)蛋白結(jié)合空腔中的水使更多的姜黃素進(jìn)入其內(nèi)，故包封率出現(xiàn)降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，反溶劑/溶劑體積比為12∶1時(shí)包封率最高，且8∶1～16∶1粒徑變化趨勢不明顯，因此，選擇這一范圍進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

表1 反溶劑/溶劑體積比考察(, n = 3)

Table 1 Investigation of anti-solvent/solvent volume ratio (, n = 3)

反溶劑/溶劑體積比包封率/%粒徑/nm 4∶148.2±3.6168.2±12.5 8∶189.6±1.5124.5±5.8 12∶195.8±0.6119.3±3.4 16∶192.6±1.8114.5±5.6 20∶187.1±2.3131.6±8.2

2.4.2 乳鐵蛋白/姜黃素投料比 固定反溶劑/溶劑體積比12∶1、pH值為6、磁攪轉(zhuǎn)速為400 r/min、探針超聲（45 W、2 min）?？疾烊殍F蛋白/姜黃素投料比為6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1對Cur-LF-NPs包封率和粒徑的影響，結(jié)果見表2。隨著乳鐵蛋白/姜黃素投料比不斷增大，納米粒包封率呈增大的趨勢，粒徑呈減小的趨勢。當(dāng)投料比為8∶1～14∶1時(shí)，納米粒包封率和粒徑變化皆趨向平穩(wěn)，包封率在87.2%～96.4%，粒徑為96.2～135.5 nm。同時(shí)考慮到乳鐵蛋白/姜黃素投料比影響納米粒的載藥量，故選擇乳鐵蛋白/姜黃素投料比為8∶1～12∶1進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

表2 乳鐵蛋白/姜黃素投料比考察(, n = 3)

Table 2 Investigation of lactoferrin/curcumin weight ratio (, n = 3)

乳鐵蛋白/姜黃素投料比包封率/%粒徑/nm 6∶168.2±3.2184.6±8.3 8∶187.2±1.4135.5±5.3 10∶191.8±1.2116.8±9.2 12∶195.1±0.3102.3±2.8 14∶196.4±0.296.2±1.2

2.4.3 pH值 固定反溶劑/溶劑體積比12∶1、乳鐵蛋白/姜黃素投料比10∶1、磁攪轉(zhuǎn)速400 r/min、探針超聲（45 W、2 min）?？疾靝H值4、5、6、7對Cur-LF-NPs包封率和粒徑的影響，結(jié)果見表3。當(dāng)pH值從4變化至6時(shí)，包封率逐漸增大；從pH值6變化至7時(shí)，包封率出現(xiàn)下降，原因可能是姜黃素的酚羥基在靠近中性至堿性條件下不穩(wěn)定造成的。且pH值為6時(shí)納米粒粒徑最小，故選擇pH值范圍為5～7進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

表3 pH值考察(, n = 3)

Table 3 Investigation of pH values (, n = 3)

pH值包封率/%粒徑/nm 468.4±3.4133.5±5.5 582.3±2.3162.4±6.2 691.8±1.2123.3±3.8 786.1±2.6149.5±4.2

2.4.4 磁攪轉(zhuǎn)速 固定反溶劑/溶劑體積比12∶1、乳鐵蛋白/姜黃素投料比10∶1、pH值為6、探針超聲（45 W、2 min）?？疾齑艛囖D(zhuǎn)速200、400、600、800 r/min對Cur-LF-NPs包封率和粒徑的影響，結(jié)果見表4。磁攪速度對包封率無顯著影響；當(dāng)磁攪轉(zhuǎn)速從200 r/min增至400 r/min時(shí)，粒徑明顯減小，繼續(xù)增加磁攪速度對粒徑無顯著影響。故選擇磁攪速度為400 r/min。

2.4.5 超聲時(shí)間 固定反溶劑/溶劑體積比12∶1、乳鐵蛋白/姜黃素投料比10∶1、pH值為6、磁攪轉(zhuǎn)速400 r/min、探針超聲功率為45 W?？疾斐晻r(shí)間0、2、5 min對Cur-LF-NPs包封率和粒徑的影響，結(jié)果見表5。探針超聲2 min與不超聲相比，包封率略降低，粒徑因?yàn)槌晱?qiáng)烈的剪切作用而變??；但超聲5 min時(shí)，較長的超聲時(shí)間破壞了納米體系的穩(wěn)定性使藥物泄漏，導(dǎo)致包封率明顯降低、粒徑顯著增大，故選擇超聲時(shí)間為2 min。

表4 磁攪轉(zhuǎn)速考察(, n = 3)

Table 4 Investigation of magnetic stirring speed (, n = 3)

磁攪轉(zhuǎn)速/(r?min?1)包封率/%粒徑/nm 20091.2±1.6143.3±6.2 40094.3±1.3122.1±3.5 60091.8±1.5123.8±3.6 80092.2±2.8118.6±2.3

表5 超聲時(shí)間考察(, n = 3)

Table 5 Investigation of ultrasonic time (, n = 3)

超聲時(shí)間/min包封率/%粒徑/nm 093.2±.6116.8±4.6 292.7±1.5101.2±2.9 585.1±1.2146.6±7.3

2.4.6 超聲功率 固定反溶劑/溶劑體積比12∶1、乳鐵蛋白/姜黃素投料比10∶1、pH值為6、磁攪轉(zhuǎn)速400 r/min、探針超聲時(shí)間2 min?？疾斐暪β?5、90、180 W對Cur-LF-NPs包封率和粒徑的影響，結(jié)果見表6。超聲功率對包封率和粒徑的影響，同超聲時(shí)間影響結(jié)果類似，故選擇超聲功率為90 W。

表6 超聲功率考察 (, n = 3)

Table 6 Investigation of ultrasonic power (, n = 3)

超聲功率/W包封率/%粒徑/nm 4592.5±1.8112.8±5.2 9095.9±0.2104.3±3.5 18087.2±2.5148.6±8.2

2.5 Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.5.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對Cur-LF-NPs制備過程中影響較大的3個(gè)因素作為考察因素，分別為反溶劑/溶劑體積比（1）、乳鐵蛋白/姜黃素投料比（2）和pH值（3），每因素設(shè)置3水平，以代碼值表示：?1（低水平）、0（中水平）、+1（高水平）；以包封率（1）、粒徑（2）和多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI，3）3者經(jīng)CRITIC權(quán)重分析加權(quán)后的綜合評分（）作為評價(jià)指標(biāo)，使用Design Expert 10軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合并驗(yàn)證優(yōu)化后的工藝。因素與水平見表7。

2.5.2 CRITIC權(quán)重分析法 CRITIC法是以各評價(jià)指標(biāo)間對比強(qiáng)度與沖突性為理論基礎(chǔ)的客觀權(quán)重賦值法，其中對比強(qiáng)度是指同一指標(biāo)中不同方案取值的差距大小，以標(biāo)準(zhǔn)差表示，標(biāo)準(zhǔn)差越大，權(quán)重越大；沖突性又稱相關(guān)性，2個(gè)指標(biāo)間相關(guān)性越強(qiáng)則沖突性越低，權(quán)重越小。此法適合于多指標(biāo)評價(jià)體系[30]。各指標(biāo)權(quán)重分析前，先將星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)得到的各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，轉(zhuǎn)換為0～1的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值。對于包封率來說取值越大越好，以公式包封率＝(Y－min)/(max－min)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換；對于粒徑、PDI來說取值越小越好，以公式粒徑/PDI＝(max－Y)/(max－min)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。然后通過網(wǎng)站SPSS AU進(jìn)行權(quán)重分析，結(jié)果見表8。包封率、粒徑和PDI的權(quán)重系數(shù)分別為30.82%、26.37%、42.81%，加權(quán)后綜合得分公式為＝(包封率×0.31＋粒徑×0.26＋PDI×0.43)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

Table 7 Experiment and results of Box-Behnken design

序號X1X2X3Y1/%Y2/nmY3Y 116 (+1)10 (0)7 (+1)88.072.60.07882.5 28 (?1)10 (0)5 (?1)73.5186.20.19912.7 316 (+1)8 (?1)6 (0)95.379.40.06793.6 412 (0)10 (0)6 (0)90.576.60.08384.2 516 (+1)10 (0)5 (?1)93.377.60.11880.9 612 (0)12 (+1)5 (?1)91.397.80.10676.0 712 (0)10 (0)6 (0)92.780.40.08785.7 812 (0)10 (0)6 (0)91.179.40.09681.8 916 (+1)12 (+1)6 (0)94.367.60.04898.6 1012 (0)12 (+1)7 (+1)92.886.90.08485.0 1112 (0)10 (0)6 (0)92.282.50.09283.5 128 (?1)8 (?1)6 (0)80.5145.80.26218.8 138 (?1)12 (+1)6 (0)85.7121.10.16451.3 1412 (0)10 (0)6 (0)91.577.30.82085.6 1512 (0)8 (?1)5 (?1)85.5103.40.16055.7 1612 (0)8 (?1)7 (+1)87.9108.40.14261.6 178 (?1)10 (0)7 (+1)82.2150.40.25621.4

表8 CRITIC分析結(jié)果

Table 8 Results of CRITIC

指標(biāo)指標(biāo)對比強(qiáng)度指標(biāo)沖突性權(quán)重/% 包封率0.2630.22430.82 粒徑0.2800.18026.37 PDI0.2980.27542.81

2.5.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素及實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Design Expert 10擬合后符合2次多項(xiàng)回歸模型：＝84.18＋31.431＋10.152＋3.153－6.8812－1.7813＋0.7723－19.4012＋0.8022－15.4032，其顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表9。該模型的＜0.000 1（極顯著），且失擬項(xiàng)的＝0.277 1＞0.05（不顯著），證明2次多項(xiàng)回歸模型能較好的反應(yīng)綜合評分（）與反溶劑/溶劑體積比（1）、乳鐵蛋白/姜黃素投料比（2）和pH值（3）之間的關(guān)系。模型的變異系數(shù)為2.71，表明模型穩(wěn)定；決定系數(shù)和校正決定系數(shù)分別為0.998 0、0.995 4，表明模型具有良好的擬合程度，并能解析99.54%響應(yīng)面值變化情況；預(yù)測決定系數(shù)為0.979 7，表明該模型具有較好的預(yù)測性。

表9 響應(yīng)面二次回歸模型的方差分析

Table 9 ANOVA for response surface quadratic model

誤差源平方和自由度均方F值P值 模型11 737.3191 304.15381.68＜0.000 1 X17 900.2517 900.252 312.14＜0.000 1 X2824.181824.18241.21＜0.000 1 X379.38179.3823.230.001 9 X1X2189.061189.0655.330.000 1 X1X312.60112.603.690.096 3 X2X32.4012.400.700.429 2 X121 585.0811 585.08463.90＜0.000 1 X222.6812.680.780.405 4 X32998.891998.89292.34＜0.000 1 殘差23.9273.42 失擬項(xiàng)13.9334.641.860.277 1 凈誤差9.9942.50 總離差1 1761.2316

各因素交互作用的三維效應(yīng)面圖和二維等高線圖如圖2所示，其中固定1個(gè)因素，繪制另外2個(gè)因素的交互作用對綜合評分的影響情況。為了得到較高的載藥量，根據(jù)軟件預(yù)測的最佳制備工藝為反溶劑/溶劑體積比為16∶1、乳鐵蛋白/姜黃素投料比為8∶1、pH值為6，在此條件下預(yù)測的綜合評分結(jié)果為93.7，合意性為0.971。

2.5.4 處方工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 測定最佳制備工藝條件下的3個(gè)批次的包封率、粒徑和PDI，按“2.5.2”求得綜合評分并與預(yù)測值相比較，計(jì)算實(shí)際值與預(yù)測值之間的偏差，結(jié)果見表10。3個(gè)批次的平均相對偏差為1.2%，可知實(shí)測值與預(yù)測值的結(jié)果相近且驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好，證明了使用Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化Cur-LF-NPs制備工藝結(jié)果可靠、重現(xiàn)性高。

偏差＝(實(shí)際值－預(yù)測值)/預(yù)測值

2.6 納米粒形態(tài)觀察

由圖3-A可知，優(yōu)化后的納米粒制劑外觀呈澄清透亮的黃色，無沉淀和不溶性微粒存在。使用TEM觀察納米粒的微觀形貌，用滴管吸取少量Cur-LF-NPs并滴加于專用銅網(wǎng)上，使用2.0%磷鎢酸鈉負(fù)染色，自然揮干后觀察。TEM圖3-B顯示納米粒呈規(guī)則圓球狀。

圖2 各因素對綜合評分的效應(yīng)面和等高線圖

表10 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table 10 Results of confirmatory experiment

批次包封率/%粒徑/nmPDI綜合評分偏差/% 實(shí)測值預(yù)測值 195.068.50.08292.593.7?1.2 295.373.90.07094.2 0.5 396.467.40.09692.0 ?1.8

圖3 Cur-LF-NPs的外觀 (A) 和TEM圖 (B, ×50 000)

2.7 粒徑、ζ電位、包封率和載藥量的測定

使用NanoBrook 90 Plus PALS粒度儀對優(yōu)化后的納米粒進(jìn)行粒徑和電位的測定，結(jié)果見圖4。平行多組實(shí)驗(yàn)后Cur-LF-NPs的平均粒徑為（72.6±5.2）nm；多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.084±0.015；ζ電位值為（24.5±3.7）mV。優(yōu)化后的納米粒粒徑小于100 nm且分布均一，體系帶正電荷，呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定性。

圖4 Cur-LF-NPs的粒徑 (A) 和ζ電位 (B) 圖

按照“2.2”項(xiàng)下所述方法測定優(yōu)化后的納米粒的包封率與載藥量，平行多組實(shí)驗(yàn)得出Cur-LF-NPs的包封率為（94.8±1.6）%、載藥量為（10.2±0.5）%，表明其具有良好的載藥能力。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.8.1 物理穩(wěn)定性 作為藥物遞送系統(tǒng)，需要考察Cur-LF-NPs在各體系中的物理穩(wěn)定性。取適量Cur-LF-NPs，分別加入超純水、生理鹽水、PBS緩沖液（pH 7.4、5.0）和含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋10倍?；靹蚝蟮渭佑?6孔板中，在恒溫振蕩器中以37 ℃、100 r/min的條件孵育24 h，以相應(yīng)的溶劑作為陰性對照，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別于0、1、2、4、8、12、24 h用酶標(biāo)儀測定各體系在685 nm波長下的吸光度（）值，結(jié)果見圖5?？芍?4 h內(nèi)各體系中的Cur-LF-NPs在685 nm波長處的值變化情況穩(wěn)定，未見納米粒團(tuán)聚或崩解產(chǎn)生較強(qiáng)的光散射[31]，初步證明Cur-LF-NPs的物理穩(wěn)定性良好。

圖5 Cur-LF-NPs在各體系中的物理穩(wěn)定性(, n = 3)

2.8.2 儲(chǔ)存穩(wěn)定性 將Cur-LF-NPs分別置于室溫25 ℃（7 d）和冰箱4 ℃（30 d）條件下，記錄粒徑和PDI值隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化情況，結(jié)果見表11?？芍{米粒在室溫2 d內(nèi)粒徑、PDI幾乎無變化，從第5天開始粒徑和PDI的增長速率明顯加快但肉眼未見納米粒團(tuán)聚現(xiàn)象，到第7天開始出現(xiàn)不溶性微粒。納米粒在4 ℃冰箱內(nèi)放置30 d內(nèi)粒徑和PDI較穩(wěn)定。

2.9 冷凍干燥工藝考察

選擇0.5%、2%、5%的甘露醇、乳糖和海藻糖作為凍干保護(hù)劑，以凍干前后粒徑、PDI和ζ電位值的變化情況優(yōu)選合適的凍干保護(hù)劑及用量，結(jié)果見表12。選擇2%的海藻糖作為凍干保護(hù)劑，制得的凍干品復(fù)溶后的粒徑、PDI和ζ電位值與凍干前的參數(shù)基本一致。凍干品外觀圖見圖6，形為飽滿圓整的餅狀樣，色澤均一，復(fù)溶時(shí)間短。

表11 Cur-LF-NPs在室溫和4 ℃條件下的儲(chǔ)存穩(wěn)定性(, n = 3)

Table 11 Storage stability of Cur-LF-NPs at room temperature and 4 ℃(, n = 3)

t/d室溫（25 ℃）t/d4 ℃ 平均粒徑/nmPDI平均粒徑/nmPDI 073.6±2.30.103±0.013070.2±1.50.093±0.007 182.2±5.50.076±0.025270.5±2.80.102±0.015 274.4±4.20.088±0.023476.4±5.20.094±0.019 398.8±8.70.104±0.015784.6±8.10.094±0.005 4107.4±10.60.108±0.0311294.5±1.40.099±0.010 5136.8±5.90.134±0.0351895.2±3.90.121±0.015 6152.4±10.50.164±0.0332597.5±6.20.116±0.018 7189.5±22.70.236±0.0593097.7±4.60.093±0.024

表12 凍干工藝考察(, n = 3)

Table 12 Study on freeze-drying process (, n = 3)

凍干保護(hù)劑粒徑/nmPDIζ電位/mV 凍干前76.5±4.20.078±0.01022.6±1.1 無凍干保護(hù)劑95.2±1.00.090±0.0219.2±1.5 0.5%乳糖148.9±17.40.267±0.0208.1±0.9 2%乳糖191.4±10.20.264±0.01215.2±2.2 5%乳糖297.4±64.30.369±0.02610.9±1.9 0.5%甘露醇87.2±0.80.096±0.0287.3±0.7 2%甘露醇115.3±8.50.151±0.02215.8±1.4 5%甘露醇386.2±41.90.373±0.08612.1±0.6 0.5%海藻糖72.3±2.60.183±0.0169.9±1.6 2%海藻糖73.4±1.90.097±0.01521.3±0.5 5%海藻糖77.2±3.80.165±0.0246.2±0.4

圖6 凍干品外觀

2.10 體外釋放實(shí)驗(yàn)

采用透析袋法考察姜黃素原料藥溶液與Cur-LF-NPs的體外釋放情況。各取1 mL姜黃素50% DMSO溶液與Cur-LF-NPs分別裝入蒸餾水洗滌后的透析袋中，質(zhì)量濃度均為300 μg/mL。隨后浸入預(yù)熱至37 ℃的30 mL含30%乙醇的PBS緩沖液中（pH 7.4、5.0）。恒溫?fù)u床的水浴溫度為（37±1）℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24 h完全更換等體積的釋放介質(zhì)，平行3組實(shí)驗(yàn)，用HPLC法測定透析液中姜黃素的質(zhì)量濃度，按公式計(jì)算累積釋放度（），結(jié)果見圖7。

為釋放介質(zhì)體積，C為各個(gè)時(shí)間點(diǎn)測得的姜黃素質(zhì)量濃度，為初始透析袋內(nèi)藥物含量

圖7 姜黃素原料藥和Cur-LF-NPs的體外釋放曲線(, n = 3)

Fig. 7 Invitro release curves of curcumin solution and Cur-LF-NPs (, n = 3)

由圖7可知，Cur-LF-NPs相較于姜黃素原料藥具有一定的緩釋效果；且Cur-LF-NPs在中性PBS緩沖液（pH 7.4）和酸性PBS緩沖液（pH 5.0）中的釋放行為相似。通過Origin 2018軟件，分別應(yīng)用零級方程、一級方程和Higuchi方程對兩者的體外釋放行為進(jìn)行擬合，結(jié)果見表13。姜黃素原料藥和Cur-LF-NPs體外釋放均符合一級方程，證明了2者通過擴(kuò)散控制機(jī)制主導(dǎo)姜黃素的釋放行為[32]。

3 討論

姜黃素極難溶于水，制成納米制劑后其抗腫瘤效果得到明顯改善[33]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測得其在25 ℃條件下于水中的飽和溶解度僅為（11.33±0.73）ng/mL，因此改善姜黃素在水中的分散性是促進(jìn)其臨床發(fā)展應(yīng)用的前提。乳鐵蛋白作為多功能糖蛋白[17]，既可作為配體修飾于載體上發(fā)揮靶向作用；也可充當(dāng)載體遞送活性藥物、其本身也是活性分子具有抗微生物、抗癌和神經(jīng)保護(hù)等藥理作用。本實(shí)驗(yàn)擬設(shè)計(jì)、篩選Cur-LF-NPs的制備工藝，以期獲得充分發(fā)揮乳鐵蛋白腦靶向、運(yùn)載和治療活性作用的姜黃素納米制劑，并用于后期腦部神經(jīng)退行性疾病的治療。

表13 姜黃素原料藥和Cur-LF-NPs體外釋放的擬合結(jié)果

Table 13 Fitting results of invitro release of curcumin solution and Cur-LF-NPs

樣品擬合模型擬合結(jié)果R2 姜黃素零級方程Q＝1.96 t＋52.270.375 6 （pH 7.4）一級方程Q＝79.80(1－e?1.05 t)0.979 0 Higuchi方程Q＝12.83 t1/2＋36.760.654 3 Cur-LF-NPs零級方程Q＝2.58 t＋20.050.631 0 （pH 7.4）一級方程Q＝62.22(1－e?0.33 t)0.974 9 Higuchi方程Q＝14.86 t1/2＋6.320.896 6 Cur-LF-NPs零級方程Q＝2.59 t＋23.570.574 9 （pH 5.0）一級方程Q＝63.70(1－e?0.43 t)0.974 3 Higuchi方程Q＝15.25 t1/2＋9.160.860 7

本實(shí)驗(yàn)采用去溶劑化法制備Cur-LF-NPs，通過單因素考察結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法篩選最佳制備處方工藝。優(yōu)選反溶劑/溶劑體積比，利用適當(dāng)?shù)囊掖既ト軇┗苁菇S素緊密的結(jié)合于乳鐵蛋白的疏水區(qū)域；優(yōu)選乳鐵蛋白/姜黃素投料比，以期最大程度的發(fā)揮乳鐵蛋白的載體利用率從而提高納米粒的載藥量；優(yōu)選pH值，為納米粒的生成和穩(wěn)定提供適宜的條件。優(yōu)化后的Cur-LF-NPs粒徑小于100 nm，有利于穿過緊密的腦組織間隙到達(dá)作用部位；且該納米粒具有理想的包封率（94.8±1.6）%和載藥量（10.2±0.5）%；其體外釋放24 h后累積釋放量達(dá)60%以上，相較于姜黃素原料藥展現(xiàn)出一定的緩釋效果。

對于體外釋放研究，在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，采取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取液并補(bǔ)液的方法，但隨著納米粒釋放時(shí)間的延長，透析袋內(nèi)外游離姜黃素質(zhì)量濃度差越來越小，使其后的釋放不能滿足最佳漏槽條件。透析袋內(nèi)納米粒釋放出的游離姜黃素未能及時(shí)透過透析袋而在其內(nèi)形成了大量結(jié)晶，且經(jīng)透析72 h后仍無法釋放，累積釋放量僅為（28.3±2.6）%。故正式實(shí)驗(yàn)時(shí)采取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)完全更換釋放介質(zhì)的動(dòng)態(tài)透析方法進(jìn)行體外釋放研究，這與體內(nèi)不斷流動(dòng)、更替的體液循環(huán)相似。

儲(chǔ)存穩(wěn)定性考察中，發(fā)現(xiàn)Cur-LF-NPs溶液的穩(wěn)定性受時(shí)間、溫度等因素影響較大，且在4 ℃條件下的穩(wěn)定性也僅為1個(gè)月左右，這不利于其長期儲(chǔ)存?zhèn)溆?。因此，擬通過將Cur-LF-NPs制備成凍干粉以延長其穩(wěn)定時(shí)間。冷凍干燥技術(shù)是儲(chǔ)存和穩(wěn)定納米粒的常用方法，但蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)可能會(huì)在長時(shí)間的低溫冷凍和干燥失水的情況下受到破壞。糖類作為常見的凍干保護(hù)劑，可提供羥基替代失去的水的羥基與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)原有的氫鍵結(jié)構(gòu)，稱為“水替代假說”[34]。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)篩選，2%的海藻糖作為凍干保護(hù)劑能較好的穩(wěn)定Cur-LF-NPs的物理化學(xué)性質(zhì)，凍干復(fù)溶前后未見明顯的粒徑、PDI和ζ電位值的變化。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法篩選制備了一種工藝簡單、綠色安全且性質(zhì)穩(wěn)定的Cur-LF-NPs，為后續(xù)該納米制劑的體內(nèi)腦靶向研究和相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的藥效評價(jià)提供了穩(wěn)定的制劑基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 李曼菱, 鄒志余, 張蕊. 姜黃素的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展 [J]. 世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘, 2019, 19(43): 51.

[2] Mehanny M, Hathout R M, Geneidi A S,. Exploring the use of nanocarrier systems to deliver the magical molecule; Curcumin and its derivatives [J]., 2016, 225: 1-30.

[3] Jiang J L, Jin X L, Zhang H,. Identification of antitumor constituents in curcuminoids fromL. based on the composition-activity relationship [J]., 2012, 70: 664-670.

[4] Reddy P H, Manczak M, Yin X,. Protective effects of Indian spice curcumin against amyloid-β in Alzheimer’s disease [J]., 2018, 61(3): 843-866.

[5] del Prado-Audelo M L, Caballero-Florán I H, Meza-Toledo J A,. Formulations of curcumin nanoparticles for brain diseases [J]., 2019, 9(2): 56.

[6] 劉小艷, 田野, 劉驥飛, 等. 姜黃素對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制研究進(jìn)展 [J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2019, 24(11): 1305-1309.

[7] 馬一星, 葉青. 突破血腦屏障納米藥物遞送系統(tǒng)的研究進(jìn)展 [J]. 中國藥事, 2016, 30(2): 141-149.

[8] Singh M, Devi S, Rana V S,. Delivery of phytochemicals by liposome cargos: Recent progress, challenges and opportunities [J]., 2019, 36(3): 215-235.

[9] Shinde R L, Devarajan P V. Docosahexaenoic acid-mediated, targeted and sustained brain delivery of curcumin microemulsion [J]., 2017, 24(1): 152-161.

[10] Zhang L, Yang S L, Wong L R,.andcomparison of curcumin-encapsulated chitosan-coated poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles and curcumin/ hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complexes administered intranasally as therapeutic strategies for Alzheimer’s disease [J]., 2020, 17(11): 4256-4269.

[11] Pitombeira N A O, Veras Neto J G, Silva D A,. Self-assembled nanoparticles of acetylated cashew gum: Characterization and evaluation as potential drug carrier [J]., 2015, 117: 610-615.

[12] Lin T T, Liu E G, He H N,. Nose-to-brain delivery of macromolecules mediated by cell-penetrating peptides [J]., 2016, 6(4): 352-358.

[13] Mourtas S, Canovi M, Zona C,. Curcumin-decorated nanoliposomes with very high affinity for amyloid-β1-42 peptide [J]., 2011, 32(6): 1635-1645.

[14] 趙超越, 張?jiān)平? 姜曉藝, 等. 乳鐵蛋白作為靶向功能分子的研究進(jìn)展 [J]. 中國生化藥物雜志, 2014, 34(9): 181-184.

[15] El-Fakharany E M. Nanoformulation of lactoferrin potentiates its activity and enhances novel biotechnological applications [J]., 2020, 165(Pt A): 970-984.

[16] Sabra S, Agwa M M. Lactoferrin, a unique molecule with diverse therapeutical and nanotechnological applications [J]., 2020, 164: 1046-1060.

[17] Elzoghby A O, Abdelmoneem M A, Hassanin I A,. Lactoferrin, a multi-functional glycoprotein: Active therapeutic, drug nanocarrier & targeting ligand [J]., 2020, 263: 120355.

[18] 唐慧嫻, 張振海, 趙志英, 等. 乳鐵蛋白作為藥物載體的研究進(jìn)展 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 50(6): 675-681.

[19] Wang B, Timilsena Y P, Blanch E,. Lactoferrin: structure, function, denaturation and digestion [J]., 2019, 59(4): 580-596.

[20] Kumari S, Kondapi A K. Lactoferrin nanoparticle mediated targeted delivery of 5-fluorouracil for enhanced therapeutic efficacy [J]., 2017, 95: 232-237.

[21] Kondapi A K. Targeting cancer with lactoferrin nanoparticles: Recent advances [J]., 2020, 15(21): 2071-2083.

[22] Ndayisaba A, Kaindlstorfer C, Wenning G K. Iron in neurodegeneration - Cause or consequence? [J]., 2019, 13: 180.

[23] Pandey A P, More M P, Karande K P,. Optimization of desolvation process for fabrication of lactoferrin nanoparticles using quality by design approach [J]., 2017, 45(6): 1-14.

[24] Zhang Z H, Wang X P, Ayman W Y,. Studies on lactoferrin nanoparticles of gambogic acid for oral delivery [J]., 2013, 20(2): 86-93.

[25] Hasanpoor Z, Mostafaie A, Nikokar I,. Curcumin-human serum albumin nanoparticles decorated with PDL1 binding peptide for targeting PDL1-expressing breast cancer cells [J]., 2020, 159: 137-153.

[26] 吳斯宇, 曾盈蓉, 唐聘, 等. RGD環(huán)肽修飾的姜黃素/黃芩苷靶向共遞送納米脂質(zhì)體的制備工藝優(yōu)化及表征 [J]. 中草藥, 2021, 52(22): 6834-6844.

[27] Araújo J F, Bourbon A I, Sim?es L S,. Physicochemical characterisation and release behaviour of curcumin-loaded lactoferrin nanohydrogels into food simulants [J]., 2020, 11(1): 305-317.

[28] 邵勝男. 酶交聯(lián)及乙醇去溶劑化法制備乳清蛋白—鋅納米微粒及其特性研究 [D]. 長春: 吉林大學(xué), 2016.

[29] 蔣良. 淺談對蛋白質(zhì)變性及其變化形式的認(rèn)識 [J]. 化學(xué)教與學(xué), 2017(6): 9-12.

[30] 王敏, 林茂, 高仕琴, 等. 白藜蘆醇納米粒的制備及其對阿爾茨海默模型大鼠認(rèn)知功能影響的初步考察 [J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 37(5): 412-418.

[31] 鐘雪梅, 鮮靜, 石金鳳, 等. 紅細(xì)胞膜包被的雷公藤甲素-紅素仿生共載脂質(zhì)體的制備及表征研究 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2021, 56(12): 3252-3260.

[32] Tai K D, Rappolt M, He X Y,. Effect of β-sitosterol on the curcumin-loaded liposomes: Vesicle characteristics, physicochemical stability,release and bioavailability [J]., 2019, 293: 92-102.

[33] 張惜琴, 范媛媛, 梁靚靚, 等. 姜黃素納米制劑抗消化系統(tǒng)腫瘤的藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 藥物評價(jià)研究, 2022, 45(7): 1440-1445.

[34] 李文慧, 王玨, 李玲, 等. 海藻糖水替代機(jī)制對凍干紅細(xì)胞保護(hù)作用的探討 [J]. 中國輸血雜志, 2018, 31(3): 240-243.

Optimization of curcumin-lactoferrin nanoparticles prescription process based on Box-Behnken design-response surface method andevaluation

LI Ling-hui1, 2, LIAO Wan1, 2, ZHANG Qian1, 2, YU Fang-kun1, 2, TAN Li-wei3, LI Zhang-cai3, HU Qiong-dan1, 2, ZHANG Xin-jie1, 2, LIAO Yang-yang1, 2, HOU Shu-guang1, 2, 3, LI Rui1, 2

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 3. Sichuan Purity Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu 610041, China

To optimize prescription process of curcumin lactoferrin nanoparticles (Cur-LF-NPs) by Box-Behnken design-response surface method.Cur-LF-NPs were prepared by the desolvation method. Based on the results of single factor experiment, the anti-solvent/solvent volume ratio, lactoferrin/curcumin weight ratio and pH value were selected as the investigational factors for the subsequent Box-Behnken design optimization experiment. The comprehensive score of entrapment efficiency, particle size and polydispersity coefficient obtained by CRITIC weight analysis and calculation were chosen as the evaluation parameters, and simulated and verified by Design Expert 10 software. Finally, the physical property of Cur-LF-NPs, including the morphology, particle size, potential, drug loading capacity, stability andrelease behavior were characterized and evaluated.The optimized prescription process were obtained as follows: the volume ratio of anti-solvent/ solvent was 16:1, the weight ratio of lactoferrin / curcumin was 8:1 and the pH value was 6. The particle size of Cur-LF NPs was (72.6 ± 5.2) nm, the PDI was 0.084 ± 0.015, and the ζ potential was (24.5 ± 3.7) mV; The entrapment efficiency was (94.8 ± 1.6)%, and the drug loading was (10.2 ± 0.5)%. Compared with free curcumin, therelease of Cur-LF-NPs has a certain sustained-release effect.The process for the preparation of Cur-LF-NPs was optimized by the Box-Behnken design-response surface screening method, the Cur-LF-NPs showed uniform particle size, good drug loading capacity and acceptable stability. This study provided a solid preparation basis for futureandresearch of Cur-LF-NPs.

curcumin; lactoferrin nanoparticles; Box-Behnken design-response surface method; CRITIC weight analysis; prescription process screening

R283.6

A

0253 - 2670(2022)19 - 5980 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.005

2022-04-25

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（82073994）；四川省科技計(jì)劃重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2020YFN0152）；四川省科技廳科技項(xiàng)目（2020JDJQ0049）；農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（2019CC02）；成都中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)者學(xué)科人才科研提升計(jì)劃（QJJJ2021002）

李嶺慧，女，碩士研究生，從事中藥新制劑、新劑型和新技術(shù)研究。E-mail: 1354776917@qq.com

侯曙光，男，博士，首席教授，博士生導(dǎo)師，從事創(chuàng)新型藥物遞送及藥劑學(xué)研究。E-mail: shuguang.hou@scpurity.com

李 銳，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥的化學(xué)分析、質(zhì)量控制及體內(nèi)代謝研究。E-mail: lirui@cdutcm.edu.cn

#共同第一作者：廖 婉，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事新制劑、新劑型及中藥炮制工藝與機(jī)制研究。E-mail: liaowan@cdutcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]