藍(lán)惠華 潘燕如 張夢情 黃榕 張玲

陸軍第七十三集團(tuán)軍醫(yī)院廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院檢驗(yàn)科，廈門 361003

地中海貧血（又稱地貧）是全球最常見的遺傳性疾病之一，由α-珠蛋白和β-珠蛋白基因組突變引起。地貧主要分布在地中海、非洲、中東地帶、印度和東南亞的沿海地區(qū)［1］。在中國，地貧主要散布在中國南方，特別是廣西、廣東和海南，福建區(qū)域也有一定的地貧基因的攜帶量，尤其是毗鄰廣東的閩南地區(qū)［2-4］。重型地貧患者往往胎死子宮內(nèi)或嬰兒早期死亡，而中型地貧患者則往往表現(xiàn)為終身貧血，且必須長期輸血和祛鐵治療，給家人和社區(qū)帶來了很大壓力［5］。所以，地貧攜帶者的檢測和產(chǎn)前診斷，對減少地貧高發(fā)區(qū)域內(nèi)的地貧病死率必不可少。目前，針對我國南方人群常見類型α、β地貧的檢測，市面上通用的幾種地貧基因檢測試劑盒基本上都能涵蓋，不過，由于地貧基因的分子基礎(chǔ)相對復(fù)雜、突變種類眾多，在臨床工作中也會(huì)碰到一些血液學(xué)表型與基因突變檢測結(jié)果明顯不相符，可能存在罕見突變基因的例子［6］。我們收集了2017年11月至2022年5月來廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院就診的38例臨床血液學(xué)檢測異常但常規(guī)地貧基因突變檢測結(jié)果陰性，可能含有罕見地貧基因突變的樣本38份，使用了跨越斷裂點(diǎn)聚合酶鏈反應(yīng)（GAP-PCR）和電泳、基因測序檢查方法對其進(jìn)行了檢測評價(jià)，用以進(jìn)一步明確診斷并逐步擴(kuò)充本地區(qū)的地貧基因突變譜。

資料與方法

1、一般資料

收集了2017年11月至2022年5月來廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院就診的臨床血液學(xué)檢測異常但常規(guī)地貧基因突變檢測結(jié)果陰性的患者38例，其中男16例，年齡5～47歲；女22例，年齡15～56歲。38例樣本分別來自福建閩南地區(qū)的9個(gè)不同地方，包括廈門思明區(qū)、廈門同安區(qū)、漳州龍海區(qū)、漳州薌城區(qū)、漳州云霄、漳州詔安、泉州晉江、泉州安溪、泉州石獅。樣本采用EDT A-2K抗凝的真空管靜脈血2 ml，在4℃環(huán)境下郵寄送至廣東凱普生物有限公司進(jìn)行測序分析。患者已在廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院進(jìn)行了血液學(xué)分析、血紅蛋白電泳分析和地貧常規(guī)基因突變的檢測。上述樣本的測序檢測與廣東凱普生物有限公司合作完成。全部的檢測都通過受試者的知情同意，并簽訂了知情同意書。罕見α-地貧的納入標(biāo)準(zhǔn)［7］：血紅蛋白H（Hb H）病表型而基因型僅為標(biāo)準(zhǔn)型的患者；生育過Hb H病患兒而基因型正常的父母；非缺鐵性的小細(xì)胞低色素貧血，基因型正常的患者。罕見β-地貧的納入標(biāo)準(zhǔn)［7］：血紅蛋白（Hb）電泳HbA2＞3.5%，且呈小細(xì)胞低色素貧血而基因型卻是正常的患者；重型地貧表型而基因型僅為攜帶者的患者。

2、檢測方法

血液學(xué)常規(guī)分析采用深圳邁瑞CAL8000自動(dòng)化血細(xì)胞分析流水線及其配套試劑進(jìn)行檢測；血紅蛋白電泳運(yùn)用HYDRASYS 2全自動(dòng)電泳儀進(jìn)行分析；運(yùn)用Veriti Dx96聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀及HHM-2醫(yī)用核酸分子快速雜交儀，對常見的3種α-地貧缺失基因（--SEA、-α3.7和-α4.2）、3種α-地貧突變基因（CS、QS、WS）及IVS-II-654（C-T）、-28（A-G）、-29（A-G）、CD14∕15（+G）、CD17（A-T）、CD27∕28（+C）、βE（G-A）、CD41∕42（-TTCT）、CD43（G-T）、CD71∕72（+A）、IVS-I-1（G-T，G-A）、IVS-I-5（G-C）、Cap（-AAAC）、Int（T-G）、CD31（-C）等15個(gè)β-地貧基因突變位點(diǎn)通過GAP-PCR方法、PCR擴(kuò)增和導(dǎo)流雜交的原理實(shí)現(xiàn)［8］。全血DNA提純、PCR擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物雜交均采用由廣東凱普生公司提供的試劑盒，嚴(yán)格規(guī)定遵照操作程序執(zhí)行各項(xiàng)檢測。

α及β地貧的測序分析利用Sanger雙去氧鏈終止法完成，先利用外周血中DNA提取試劑盒抽取基因組DNA，再利用GAP-PCR技術(shù)測定缺失型α及β地中?；颍瑢CR的擴(kuò)增物質(zhì)采用瓊脂糖凝膠電泳，確定得到目的片段后，再將擴(kuò)增產(chǎn)物與之對應(yīng)的引物，送到廣州凱普公司進(jìn)行測序技術(shù)分析，在完成測序技術(shù)后，通過與http：∕∕blast.ncbi.nlm.nih.Gov∕對比，分析測序圖紙，以判斷是否有新突變位點(diǎn)的存在，擴(kuò)增引物和反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)［6］。

結(jié) 果

38例可疑為罕見地貧的樣本中檢出21例為稀有類型地貧，當(dāng)中包含了6種罕見的α珠蛋白基因突變，分別為8例泰國型缺失（--THAI）、2例中國香港型缺失（HKαα）、2例菲律賓型（--FIL）、1例CD 30（-GAG）、1例CD 122 CAC＞CAG，WSM和1例αα∕αααanti4.2；其中2例--FIL源于一對母子。6種罕見β珠蛋白基因突變，分別為2例IVS I-129 A＞G雜合突變、1例CD56 GGC＞GAC雜合突變、1例CD54 GTT＞GTC，Val＞Val雜合復(fù)合Terminal CD+32 A＞C雜合突變、1例113A＞G（Poly A（A＞G）AATAAA＞AATAAG）雜合突變，1例越南型（Vietnamese）遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)癥（hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）缺失型β地貧，其中CD54 GTT＞GTC雜合突變以往未見報(bào)道，其測序圖見圖1。21例罕見地貧的基因突變詳見表1。

圖1 CD54 GTT＞GTC雜合突變測序結(jié)果

表1 21例罕見地貧的基因突變類型

討 論

本研究通過對38例疑似罕見地貧患者的血液樣本進(jìn)行測序分析，共發(fā)現(xiàn)21例罕見型地貧，陽性率高達(dá)55.26%，其中α-地貧15例，α地貧以--THAI最常見（占53.33%），其次是--FIL和HKαα。α地貧在整個(gè)東南亞很常見，最常見的原因是16號染色體短臂上α珠蛋白基因簇的不同DNA片段缺失，該基因復(fù)合體包括2個(gè)α基因（α2和α1）、1個(gè)胚胎基因（ζ2）、幾個(gè)假基因（ψα1、ψα2、ψζ1）和1個(gè)功能未知的基因（θ1），順序?yàn)?’-ζ2-ψζ1-ψα1-ψα2-α2-α1-θ1-3’［19］。在整個(gè)熱帶和亞熱帶地區(qū)，2個(gè)α基因（αα）中的1個(gè)缺失（-α）是常見的，而涉及2個(gè)α基因（--）的缺失最常見于東南亞和地中海盆地，即Hb H?。?-∕-α）和Hb Barts胎兒水腫綜合征（--∕--）的高發(fā)地，在東南亞，以--SEA缺失型最常見，它是約20 kb長度的α基因簇的缺失，即α1和α2基因完全缺失，僅保留ζ2和ψζ1基因不變［19］。然而在泰國和菲律賓地貧患者中首次發(fā)現(xiàn)其中一條染色體上的ζ-α復(fù)合體完全缺失，因而分別稱之為--THAI和--FIL，由于這些缺失延伸到5’端的ζ基因之外和3’端的α基因之外，它們位于θ1基因之外的一個(gè)小序列DNA區(qū)域附近，該區(qū)域被命名為a-珠蛋白3'高變區(qū)（3'HVR），因此通過珠蛋白復(fù)合物的常規(guī)限制性圖譜，不能在雜合子（--∕αα）中明確識別它們，因此在遺傳咨詢和產(chǎn)前檢測期間可能會(huì)遺漏這些缺失［9］。--THAI和--FIL這2個(gè)缺失被定位到5’斷點(diǎn)的ζ2珠蛋白基因上游約4 kb的區(qū)域，--FIL缺失30～34 kb，--THAI缺失長度為34～38 kb，與3'HVR不同的是，用于識別5'斷點(diǎn)的探針可識別對2種突變中的每一種都具有特異性的獨(dú)特片段，并可用于常規(guī)產(chǎn)前檢測［9］。與--SEA相比，--THAI和--FIL突變在Hb H疾病和Hb Bart胎兒水腫綜合征受試者中相對少見或表達(dá)不足，需要進(jìn)行更廣泛的研究，以確定其在這些人群中的真實(shí)頻率。--THAI或--FIL突變的純合子中可以產(chǎn)生由ε4或γ4制成的血紅蛋白，這兩者都不可能支持發(fā)育中胚胎和胎兒的氧氣需求，因此，受影響父母的后代（--∕αα）很可能出現(xiàn)高頻率的早期自然流產(chǎn)，這些突變體的復(fù)合雜合子和常見的東南亞決定基因（--FIL∕--SEA或--THAI∕--SEA）也會(huì)患有Hb-Bart胎兒水腫綜合征，并且在早期胚胎和胎兒生命中也可能受到嚴(yán)重?fù)p害，因?yàn)橹挥幸粋€(gè)功能性ζ-珠蛋白基因，這也可能導(dǎo)致早期流產(chǎn)。在東南亞人群中的“高?！狈驄D中鑒定這些突變體尤為重要，尤其是采用常規(guī)方法無法鑒定識別的--FIL∕αα和--THAI∕αα攜帶者。本研究發(fā)現(xiàn)2例HKαα。HKαα異?；蛐鸵?005年在中國香港首次報(bào)道檢出而命名，是一種極少見的在α-珠蛋白基因簇同源區(qū)域錯(cuò)位與減數(shù)分裂過程中的發(fā)生的不平衡交叉連接，它同時(shí)含有-α 3.7缺失及αααanti4.2基因等位基因的交叉連接片段，HKαα的基因組成成分有1個(gè)α2基因和1個(gè)由α2和α1部分片段組成的融合基因（即右缺失片段）［10，20］。HKαα等位基因既不包含缺失，也不包含三倍體，因此這種等位基因的攜帶者不太可能受到任何有害影響，其血液學(xué)和臨床表現(xiàn)都是正常的。然而，這種重排在個(gè)體中的存在對于基于PCR的α地貧分子診斷具有重要意義，臨床采用的常規(guī)檢測方法只能檢測-α3.7缺失，不能檢測到αααanti4.2，因而常常誤診為-α 3.7∕--，而導(dǎo)致產(chǎn)前咨詢時(shí)誤導(dǎo)臨床給出錯(cuò)誤的建議。

本研究檢出1例αα∕αααanti4.2基因型。根據(jù)αααanti4.2基因的分子生物學(xué)特性，這個(gè)基因的載體表達(dá)的α鏈比野生型個(gè)體多，這將導(dǎo)致比野生型個(gè)體更多的α鏈合成，從而導(dǎo)致α鏈與β鏈的比例失衡［10］。當(dāng)個(gè)體僅攜帶αααanti4.2基因時(shí)，α鏈與β鏈的比率略有不平衡，攜帶者不會(huì)遇到嚴(yán)重問題，然而，當(dāng)它們同時(shí)攜帶β地貧等位基因時(shí)，合成α鏈與β鏈的比率進(jìn)一步失衡，導(dǎo)致不同程度的貧血。大多數(shù)臨床機(jī)構(gòu)使用的常規(guī)檢測試劑的檢測范圍不包括αααanti3.7、αααanti4.2和HKαα基因，因此，很難常規(guī)檢測這些變化，由于檢測方法的復(fù)雜性，以往的研究沒有充分研究這些變異在人群中的攜帶情況，大多數(shù)檢測機(jī)構(gòu)也沒有對其予以重視。

本研究檢出1例CD 30（-GAG）突變，該突變?yōu)閍2基因外顯子1的密碼子30缺失，即α2基因編碼序列的91-93號堿基GAG缺失，然而，這并不影響該區(qū)域的剪接位點(diǎn)一致性序列，因?yàn)橥怙@子的最后2個(gè)核苷酸（AG）和中間序列中的前6個(gè)核苷酸保持完整，這種框內(nèi)缺失導(dǎo)致少1個(gè)氨基酸的α珠蛋白鏈，截短的蛋白質(zhì)高度不穩(wěn)定，因新合成的珠蛋白鏈分子疏水性增加，會(huì)被蛋白質(zhì)水解迅速破壞，除非它們被并入Hb四聚體中［11］。CD 30（-GAG）為致病性突變，臨床表型為α?或α0。本研究檢出1例Hb Westmead，這是由HBA2密碼子122（CAC＞CAG）突變引起的a鏈變體，是一種沉默的非缺失的a+-地貧，其a-珠蛋白鏈缺失程度比缺失型a+-地貧輕［12］。Hb Westmead在中國南方很常見。據(jù)報(bào)道，在廣西省，Hb Westmead的等位基因頻率為1.55%，其次是Hb CS（1.21%）和Hb QS（0.36%）［21］。然而，這種變體不如其他常見的非缺失型α-地貧如Hb-CS和Hb-QS那樣廣為人知，原因可能是Hb Westmead僅與輕度α-地中海表型相關(guān)，再則在常規(guī)電泳或高效液相色譜（HPLC）上無法檢測到這種變體，因而常常被忽略。

β-地貧是世界上最常見的單基因疾病之一，其特征是血紅蛋白的β-珠蛋白鏈合成減少或缺失，嚴(yán)重的β-地貧會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的貧血，需終生輸血。突變類型與臨床表現(xiàn)高度相關(guān)，在世界不同地區(qū)已經(jīng)描述了200多個(gè)導(dǎo)致β-地貧的突變［22］。盡管每個(gè)人群中發(fā)現(xiàn)的這些突變數(shù)量相對較少。在中國人群中，常見的幾種突變占所有病例的90%以上，而罕見突變對于受影響家庭的產(chǎn)前診斷也很重要，對于深入了解珠蛋白基因調(diào)控的潛在過程以及基因型-表型關(guān)系的研究也不可或缺。本研究檢出罕見β-地貧6例。

IVS I-129 A＞G突變（HBB：c.93-2A＞G）是β基因編碼區(qū)序列的271號堿基G突變?yōu)門，對應(yīng)的編碼氨基酸由谷氨酸改變?yōu)榻K止密碼子，為致病性突變，臨床表型為β0，在德國首次報(bào)道［23］。本研究發(fā)現(xiàn)2例該突變，且2例非親緣關(guān)系。CD56 GGC＞GAC突變，即Hb J-Bankok，由β-珠蛋白鏈56位的甘氨酸由天冬氨酸取代而定義，這種突變似乎產(chǎn)生了一種帶有額外負(fù)電荷的β亞單位變體，因?yàn)棣?6（D7）Asp鏈有更多機(jī)會(huì)與帶正電荷的α鏈結(jié)合，與正常β鏈競爭，從而允許在雜合子狀態(tài)下形成比正常Hb A更多的Hb J-Bankok，這種Hb變體顯示出快速的電泳遷移率［14］。Hb J-Bankok無臨床癥狀。本研究檢出1例，該突變者，血紅蛋白電泳檢出異常血紅蛋白所占比例高達(dá)51.3%。Terminal CD+32 A＞C突變在福建及廣東廣州均有報(bào)道為β基因3'端非編碼區(qū)域的32號堿基A突變?yōu)镃［16，24］。該突變使β珠蛋白基因型轉(zhuǎn)錄效率降低，mRNA穩(wěn)定性低于正常水平，影響正常的β珠蛋白鏈的合成，為致病性突變，臨床表型為β+，由于病例數(shù)的局限性，該突變的致病性有待獲取更多病例后再進(jìn)一步研究確認(rèn)。本研究中檢出的Terminal CD+32 A＞C突變患者同時(shí)檢出一種以往未見報(bào)道的突變類型，即HBB：c.165T＞C（CD54GTT＞GTC，Val＞Val）突變，該突變是β基因編碼區(qū)序列的165號堿基T突變?yōu)镃（圖1），對應(yīng)的54位編碼氨基酸為纈氨酸未發(fā)生改變，不影響β珠蛋白的合成，理論上不引起相關(guān)的臨床癥狀，該突變對人體是否有其他影響及其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

HBB：c.*113A＞G突變位于HBB基因轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)上游啟動(dòng)子區(qū)域，為β基因3'端非編碼區(qū)域的113號堿基A突變?yōu)镚，為致病性突變，臨床表型為β+［25］。本次檢測發(fā)現(xiàn)該突變攜帶者血常規(guī)紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)基本正常的，僅Hb電泳發(fā)現(xiàn)HbA2略高于正常（3.8%），無明顯的臨床癥狀，與陳揚(yáng)等［25］研究推測HBB：c.*113A＞G雜合突變致病類型為靜止型是相符的。本次檢出1例Vietnamese HPFH，它是一種與HPFH表型相關(guān)的30 kb珠蛋白基因簇缺失，越南GγAγ HPFH缺失在δ-珠蛋白基因下游有一個(gè)獨(dú)特的5’斷點(diǎn)3.5 kb，3'斷裂點(diǎn)位于HPFH-3斷裂點(diǎn)上游約8 kb處，位于HPFH-4的3'斷點(diǎn)區(qū)域內(nèi)［18］。進(jìn)一步的證據(jù)表明，3'斷點(diǎn)區(qū)域包含功能上重要的序列，這些序列與γ-珠蛋白基因并列是胎兒血紅蛋白水平升高的一個(gè)重要因素［26］。

地貧重在預(yù)防和控制，本研究主要是收集閩南地區(qū)部分可疑地貧但常規(guī)試劑盒檢測不出的樣本，應(yīng)用GAP-PCR和電泳、基因測序進(jìn)行分析，檢出了幾種罕見的地貧基因突變，并介紹了這些罕見地貧基因的基本情況，豐富了閩南地區(qū)地貧相關(guān)基因突變譜，為今后閩南地區(qū)可疑地貧患者的診斷提供檢測思路，不能局限于常規(guī)試劑盒的檢測，對于可疑樣本應(yīng)采用更全面的方法進(jìn)行檢測，以防漏診。本研究遺憾之處是未對各罕見地貧攜帶者進(jìn)行家族人群進(jìn)行地貧檢測確認(rèn)，對攜帶罕見地貧基因的人群進(jìn)行家族可疑人群地貧檢測追蹤，有望挖掘出更多罕見類型地貧，這也是我們今后工作需要加強(qiáng)的地方。罕見地貧基因型雖在人群中占比不高，但依然不能忽視針對罕見地貧突變的研究，相信未來隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，更多的突變類型將不斷被發(fā)現(xiàn)，而某些罕見類型也將成為不罕見。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突