黃 凱, 肖 娟, 李愛麗

( 1. 廣西肝臟損傷與修復(fù)分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院， 廣西 桂林 541001； 2. 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院， 廣西 桂林 541001 )

羅漢果 () 是我國廣西特有的傳統(tǒng)藥食同源植物，屬于葫蘆科家族成員。經(jīng)檢測(cè)，羅漢果內(nèi)富含蛋白質(zhì)、維生素、微量元素、多糖等營養(yǎng)成分，同時(shí)含有葫蘆烷三萜皂苷和黃酮等多種活性成分，其中葫蘆烷三萜化合物為羅漢果主要功能成分?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，羅漢果不僅具有止咳祛痰、抗氧化、抗炎等藥理作用，而且能顯著干預(yù)糖脂代謝異常。有研究發(fā)現(xiàn)，給患有糖尿病的小鼠服用羅漢果苷，可以預(yù)防和減少糖尿病并發(fā)癥 (Song et al., 2007；Suzuki et al., 2007；Qi et al.,2008)。羅漢果苷IIE既是一種苦味三萜皂苷，也是羅漢果苷V的前體，為未成熟羅漢果的主要成分。然而，羅漢果苷IIE在糖尿病治療當(dāng)中的作用，至今仍然未知。

有研究表明，巨噬細(xì)胞不僅在宿主防御機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且在促炎細(xì)胞因子和細(xì)菌LPS暴露下被激活 (Xie et al.,1993；Zhang & Ghosh, 2000)。被誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞大量產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6和NO、PGE2等。這些促炎因子在炎癥性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用 (Vane et al., 1994；Marks-Konczalik et al., 1998)。由于血漿中豐富的脂肪酸棕櫚酸(PA)的增加可導(dǎo)致II型糖尿病的血脂異常，表明PA是一種重要的參與糖尿病的脂肪酸。同時(shí)，臨床研究報(bào)道在肥胖患者血液循環(huán)中脂多糖(LPS)升高，進(jìn)而LPS可通過TLR4信號(hào)通路觸發(fā)炎癥反應(yīng)，激活組織炎癥因子。綜上認(rèn)為，糖尿病合并肥胖患者可能同時(shí)存在PA升高和LPS升高。 因此，本文采用LPS和PA聯(lián)合處理小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7構(gòu)建糖尿病炎癥模型，該模型的建立能客觀地模擬糖尿患者體內(nèi)因PA和LPS失調(diào)而引起的炎癥反應(yīng)，同時(shí)能簡(jiǎn)便、節(jié)約、快速、客觀地觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具有一定的創(chuàng)新性。隨后，我們?cè)谠撎悄虿∧Ｐ偷幕A(chǔ)上研究羅漢果苷IIE對(duì)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α mRNA的影響，旨在探索羅漢果苷IIE治療糖尿病的潛在可能性，為糖尿病治療新策略的提出提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

棕櫚酸(PA)、脂多糖(LPS)均購自Sigma公司；羅漢果苷IIE購自成都曼斯特生物科技有限公司(http://www.cdmust.com/)，并溶于甲醇配置成20 μmol·L溶液。

1.2 PA母液的配置

將一定量的PA加入含0.1 mol·LNaOH的70%乙醇中，用70 ℃水浴溶解 ，混勻后冷卻至室溫，待用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7購自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM(購自Gibco公司)完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)加藥后細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α mRNA表達(dá)水平的變化

收集各組加藥后24 h生長狀態(tài)良好的RAW 264.7細(xì)胞，采用Trizol 法提取細(xì)胞中總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，采用SYBR Green Gene Expression Assay試劑盒分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中TNF-α和內(nèi)參GAPDH mRNA的表達(dá)。本研究采用40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s 。擴(kuò)增結(jié)束后統(tǒng)計(jì)各組CT值，采用相對(duì)定量2計(jì)算各組RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)水平。TNF-α引物序列為F: 5′-CTT CAG GGA TAT GTG ATG GAC TC-3′，R: 5′-GGA GAC CTC TGG GGA GAT GT-3′；GAPDH的引物序列為F: 5′-GGTGCTGAGTATGTCGTG-3′，R: 5′-TTCAGCTCTGGGATGACC-3′。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS和PA誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7后細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α mRNA表達(dá)水平的變化

本研究的實(shí)驗(yàn)部分可以分為4個(gè)組，即未處理組(NC)、PA單獨(dú)誘導(dǎo)組、LPS單獨(dú)誘導(dǎo)組以及PA和LPS聯(lián)合誘導(dǎo)組。經(jīng)上述處理后，分別于0、1、3、6、12、24 h六個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，并采用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α mRNA表達(dá)水平的變化。由圖1可知，1 ng·μL的LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α mRNA表達(dá)水平在1、3、6、12 h時(shí)間點(diǎn)均顯著高于未處理組(NC)的，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)；100 μmol·L的PA誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥因子TNF-α mRNA表達(dá)水平在1、3、6、12、24 h時(shí)間點(diǎn)均與未處理組(NC)無顯著差異(>0.05)；經(jīng)LPS和PA聯(lián)合誘導(dǎo)后的細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α mRNA表達(dá)水平在1、6、24 h時(shí)間點(diǎn)均顯著高于LPS、PA的單獨(dú)誘導(dǎo)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)，且在24 h時(shí)間點(diǎn)差異最顯著，這說明1 ng·μL的LPS和100 μmol·L的PA聯(lián)合誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞在24 h時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生的協(xié)同作用最佳。因此，我們將24 h作為LPS和PA聯(lián)合處理的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

圖 1 LPS和PA誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞后各組細(xì)胞中炎癥因子TNF-α mRNA表達(dá)水平隨時(shí)間的變化情況Fig. 1 Changes of inflammatory factor TNF-α mRNA expression levels with time in each group mouse macrophages induced by LPS and PA

2.2 LPS和PA誘導(dǎo)24 h后小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7的變化

從圖2可以看出，小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7經(jīng)LPS和PA分別單獨(dú)誘導(dǎo)以及LPS和PA聯(lián)合誘導(dǎo)24 h后小鼠巨噬細(xì)胞發(fā)生變化。圖2結(jié)果顯示，LPS+PA聯(lián)合誘導(dǎo)組的細(xì)胞數(shù)最少且含有少量的死細(xì)胞，而LPS誘導(dǎo)組的細(xì)胞數(shù)最多，進(jìn)一步說明1 ng·μL的LPS和100 μmol·L的PA兩者共同處理小鼠巨噬細(xì)胞24 h后產(chǎn)生的炎癥協(xié)同作用最好。因此，選用24 h 為LPS和PA聯(lián)合誘導(dǎo)的最佳時(shí)間。

A. 未處理組; B. 棕櫚酸; C. 脂多糖; D. 棕櫚酸+脂多糖。圖中標(biāo)尺均為200 μm。A. Negative control; B. Palmitic acid; C. Lipopolysaccharide; D. Palmitic acid + Lipopolysaccharide. All scale bars are 200 μm.圖 2 LPS和PA誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞24 h后小鼠巨噬細(xì)胞的變化情況Fig. 2 Changes of mouse macrophages induced by LPS and PA for 24 h

2.3 羅漢果苷IIE可以有效抵制LPS和PA聯(lián)合誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥協(xié)同作用

應(yīng)用qRT-PCR分別檢測(cè)0、1、3、6、12、24 h六個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中炎癥因子TNF-α mRNA的表達(dá)水平(圖3)。圖3結(jié)果顯示，20 μmol·L的羅漢果苷 IIE處理12 h可以顯著降低LPS和PA聯(lián)合誘導(dǎo)生成的炎癥因子TNF-α mRNA表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)；對(duì)由LPS或PA單獨(dú)誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α mRNA表達(dá)水平無顯著差異(>0.05)。這說明羅漢果苷IIE可以抑制LPS(1 ng·μL)和PA(100 μmol·L)聯(lián)合誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而有效降低巨噬細(xì)胞的炎癥水平。

圖 3 羅漢果苷IIE處理經(jīng)PA和LPS單獨(dú)或聯(lián)合誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞12 h后各組細(xì)胞中炎癥因子TNF-α mRNA表達(dá)水平的變化Fig. 3 Changes of inflammatory factor TNF-α mRNA expression levels in mouse macrophages induced by PA and LPS alone or in combination with mogroside IIE for 12 h in each group

3 討論與結(jié)論

糖尿病炎癥的調(diào)控對(duì)糖尿病的治療至關(guān)重要。Guariguata等 (2014)研究表明，糖尿病是一種復(fù)雜的以高血糖為特征的代謝性疾病， 嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。Wellen等(2005)研究表明，該代謝性疾病與炎癥的異常產(chǎn)生和炎癥信號(hào)通路的激活密切相關(guān)。本研究用小鼠巨噬細(xì)胞來模擬糖尿病炎癥模型時(shí)的LPS和PA所選濃度與Xiao等(2020)所報(bào)道的一致，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示在該濃度下兩者共同作用可誘導(dǎo)炎癥協(xié)同效應(yīng)。同時(shí)，在糖尿病病人的體內(nèi)，炎癥反應(yīng)可以對(duì)人體細(xì)胞造成一定的傷害，說明所選濃度具有可行性。

本課題組肖娟博士2020年發(fā)表的文章結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20 μmol·L的羅漢果苷在細(xì)胞模型和小鼠中可通過下調(diào)IL-9/IL-9受體通路改善胰腺炎(Xiao et al., 2020)，并且由于本研究涉及的分組比較多，因此在采用羅漢果苷IIE處理小鼠巨噬細(xì)胞炎癥模型時(shí)，我們只檢測(cè)了不同時(shí)間點(diǎn)LPS和PA聯(lián)合誘導(dǎo)生成的炎癥因子TNF-α mRNA表達(dá)水平的變化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理12 h的效果最佳，用20 μmol·L的羅漢果苷IIE處理12 h能夠顯著降低細(xì)胞內(nèi)PA和LPS聯(lián)合誘導(dǎo)的協(xié)同炎癥反應(yīng)，而對(duì)PA或LPS單獨(dú)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)無顯著作用。但是，此具體作用機(jī)制目前還不甚清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

羅漢果苷IIE是從可食用的羅漢果果實(shí)中提取而來，且羅漢果中的糖類在人體內(nèi)升糖作用弱。基于這一點(diǎn)，羅漢果苷IIE可以成為糖尿病病人輔助治療的一個(gè)重要方向。因此，本研究結(jié)果將對(duì)開發(fā)有效的抗糖尿病炎癥藥物以及改善糖尿病患者的生活質(zhì)量具有重要的指導(dǎo)意義。另外，由于羅漢果苷IIE為未成熟羅漢果中含量最高的苷類，且每年豐收季節(jié)未成熟的羅漢果占有一定的比例，因此本研究結(jié)果既有助于提高未成熟羅漢果的利用價(jià)值，又有利于提升成熟羅漢果的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。