謝程國 馬勝利 張鏡偉

廣州市第一人民醫(yī)院泌尿外科(廣州 511458)

青藤堿(C19H23NO4)是一種生物堿單體，從青藤干燥的根和莖中提取[1]。多項研究發(fā)現(xiàn)青藤堿在細胞增殖、凋亡、轉移和血管生成等多種生物學過程中發(fā)揮著重要作用[2- 5]。而且，越來越多的研究表明青藤堿具有抗腫瘤作用，例如體外實驗表明青藤堿能抑制肺癌細胞NCI-H460和白血病細胞的的增殖，促進細胞凋亡，并增加腫瘤細胞對化療的敏感性[6- 7]，同時也有抗前列腺癌作用[8]。此外，青藤堿還能減少乳腺癌細胞的遷移和侵襲。這些結果闡明了青藤堿在不同腫瘤中的抗腫瘤作用。但是迄今為止，青藤堿在腎癌細胞中的作用還沒有報道。因此，在本文中我們擬探討青藤堿對人腎癌細胞786-O細胞增殖、細胞周期分部及凋亡的影響，以期為防治腎癌提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)擴增和反轉錄試劑盒均購買于日本Takara公司；四氮唑藍鹽(May-Thumer syndrome，MTS)細胞繁殖定量檢測試劑盒購置于美國Promega公司；主要使用的抗體包括c-myc(ab32072，Abcam，美國)， Bax(ab32503，Abcam，美國)，Caspase 3(ab32351，Abcam，美國)，GAPDH (ab8245，Abcam，美國)。青藤堿購于上海藍木化工有限公司(Selleck，S2359)，于DMSO中溶解使其終濃度分別達到100 μM、150 μM、200 μM、250 μM。

1.2 細胞培養(yǎng)

人腎癌細胞株786-O和正常腎小管細胞HK- 2購于中國科學院干細胞庫，HK- 2細胞在Keratinocyte Serum Free Medium (K-SFM)+1%青霉素和鏈霉素中培養(yǎng)；786-O在含有10%胎牛血清(Gbico)+1%青霉素和鏈霉素組合的RPMI1640 (Gbico)中培養(yǎng)。所有細胞在37 ℃標準細胞培養(yǎng)條件下(5% CO2, 95%濕度)生長。

1.3 實時熒光定量PCR

取對數(shù)生長期細胞，采用Trizol提取786-O細胞總RNA，通過核酸蛋白定量儀(NanoDrop 2000)測定所提取RNA的濃度及純度；然后，參照Takara公司的PrimescriptRTReagent Kit試劑盒說明書，將總RNA(1 μg)逆轉錄成cDNA；按照PrimeScriptTMRT Master Mix ( Perfect Real Time )試劑盒說明書，以反轉錄的cDNA為模版進行PCR反應，所需引物序列如表1所示：

表1 各基因引物序列

記錄各組CT值并采用公式2-ΔΔCT對數(shù)據(jù)進行處理分析，得到各個細胞株中基因的相對表達量。

1.4 蛋白免疫印跡(Western blot，WB)法

收集對數(shù)生長期786-O細胞，加入1×Cell Lysis Buffer裂解細胞，經(jīng)超聲、離心后去掉其他細胞成分，使用BCA蛋白定量分析試劑盒對提取的蛋白進行定量；加入5×SDS加樣緩沖液，煮沸10 min 以使蛋白變性；配液10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，然后轉膜，封閉，并在4 ℃與一抗孵育過夜；二抗室溫孵育2小時，采用化學發(fā)光法檢測目的蛋白表達，并進行灰度值分析。

1.5 MTS細胞增殖實驗

按照MTS細胞繁殖定量檢測試劑盒實驗步驟，將100 μL完全培養(yǎng)基中的2 000個細胞接種到96孔板中，在37 ℃和5% CO2下培養(yǎng)1～5天，然后每個時間點在培養(yǎng)基中加入10 μL MTS, 37 ℃下孵育4 h后, 490 nm波長下測定每孔吸光度，根據(jù)結果繪制細胞生長曲線。

1.6 流式細胞周期檢測

通過流式細胞術檢測不同濃度青藤堿對786-O細胞周期的分布。取對數(shù)生長期細胞，用PBS清洗3遍后加入不含血清FBS的1640培養(yǎng)基，然后使用預冷75%乙醇固定細胞，置于4 ℃過夜；第二日離心去除乙醇，經(jīng)PBS清洗后，加入100 μL RNase A，于37 ℃水浴箱中放置30 min；然后加PI染液于4 ℃冰箱密封避光反應1小時；最后上機檢測，根據(jù)細胞內各階段DNA的含量來確定細胞周期的分布。

1.7 流式細胞凋亡檢測

利用流式細胞儀檢測細胞周期，取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化，使用Annexin V凋亡檢測試劑盒APC (Cat: 88- 8007, ebiosicence)，按照實驗步驟雙染APC偶聯(lián)Annexin V (annexin V-APC)和碘化丙啶(PI)，使用FACSCalibur (BD Bioscience)對細胞進行分析。每個樣本共采集20000個細胞，使用BD CellQuest軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 不同濃度青藤堿對腎癌細胞786-O增殖能力的影響

為了探討青藤堿在腎癌細胞中的生物學作用，我們在786-O細胞培養(yǎng)基中加入不同濃度的青藤堿(培養(yǎng)基中青藤堿終濃度分別為100、150、200、250 μmol/L)。如圖1所示，與DMSO及空白組相比，不同濃度青藤堿均明顯抑制786-O細胞的增殖能力，且隨著濃度的增高，其抑制作用愈強，結果具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。

2.2 青藤堿誘導786-O細胞周期G1/S期阻滯

我們進一步探討青藤堿對細胞周期分布的影響。結果如圖2所示，空白組和DMSO組細胞G1期細胞百分比分別占48.46%、46.76%，S期細胞百分比分別占34.74%、40.61%，而加入不同濃度青藤堿后，G1期細胞分別增加到52.10%(100 μmol)，56.93%(150 μmol)，57.60%(200 μmol)，59.32%(250 μmol)，而S期細胞減少至41.86%(100 μmol)，37.04%(150 μmol)，30.15%(200 μmol)，30.04%(250 μmol)，說明青藤堿可以誘導786-O細胞周期G1/S期阻滯。

2.3 青藤堿誘導786-O細胞凋亡

空白組和DMSO組晚期凋亡細胞百分比分別為0.38%、0.86%，而加入不同濃度青藤堿后，凋亡細胞百分比分別增加到2.98%(100 μmol)，3.71%(150 μmol)，4.72%(200 μmol)，6.77%(250 μmol)，說明青藤堿可以誘導786-O細胞凋亡(P<0.05)。見圖3。

2.4 青藤堿對細胞周期及凋亡相關蛋白表達水平的影響

我們分別用DMSO、青藤堿(200 μmol)處理腎癌786-O細胞，qRT-PCR與WB分別檢測細胞周期及凋亡相關蛋白的表達水平。結果如圖4所示，青藤堿顯著下調c-myc蛋白及mRNA水平，而誘導凋亡蛋白Bax、Caspase- 3表達上調(P<0.05)。

3 討 論

近年來，腎細胞癌在全球的發(fā)病率逐年上升，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計，2017年美國腎細胞癌新發(fā)病例63 990例，死亡病例14 400例，發(fā)病率約占成人惡性腫瘤的5%[9]。腎小管癌起源于腎近端小管細胞，透明細胞癌是最常見的亞型，占轉移性腎小管癌的80%～85%[10]。在治療方面，腎細胞癌對放療和化療不敏感。雖然手術切除腫瘤是目前的最佳治療策略，但其術后復發(fā)率為20%～40%[11]。而且由于腎小細胞癌對放化療有抵抗性，因此缺乏有效的術后輔助治療[12]。此外，缺乏早期診斷腎細胞癌的生化標志物和隨訪資料，阻礙了腎細胞癌的及時診斷。近些年靶向藥物的應用為腎癌的治療提供了新的解決途徑。然而不幸的是，隨著靶向藥物應用時間的延長，患者均會對靶向藥物產(chǎn)生耐藥，加大靶向藥物的劑量則會產(chǎn)生嚴重的不良反應，嚴重影響了靶向藥物的臨床療效。因此，我們急需發(fā)現(xiàn)新的治療藥物和靶點，以期改善晚期腎癌患者的生存質量及生存時間。

目前，大量證據(jù)表明，許多中草藥提取物具有很強的抗癌能力，如穿心蓮內酯[13]、魔芋[14]等。青藤堿是從中草藥青藤中提煉出來的一種異喹啉類生物活性堿。青藤堿對類風濕性關節(jié)炎的臨床治療有顯著的療效已被廣泛報道[15- 16]。在癌癥治療中，青藤堿對腫瘤的抑制作用也已在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，它通過介導細胞增殖和凋亡來發(fā)揮作用[17]，如青藤堿抑制卵巢癌[18]細胞生長能力，降低c-myc和Cyclin D1蛋白水平。青藤堿有極小的毒副作用，因此近年來青藤堿在抗腫瘤中的應用越來越受到科研工作者們的重視。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，青藤堿可抑制786-O細胞增殖，誘導細胞周期G1/S期阻滯，促進細胞凋亡。青藤堿下調786-O細胞中c-myc的表達水平，而誘導凋亡相關蛋白Bax和Caspase 3表達上調。這些結果說明，青藤堿在腎癌細胞中發(fā)揮抗腫瘤作用。

到目前為止，已有許多文獻報道了青藤堿抗腫瘤的能力。研究表明，5-氟尿嘧啶與青藤堿具有顯著的協(xié)同作用，與5-氟尿嘧啶相比，可以抑制LoVo細胞的生長[19]。其他一些報告表明，青藤堿處理的A549與未處理的細胞相比，細胞數(shù)量減少。有研究者也指出青藤堿觸發(fā)時間依賴性的細胞毒性，導致NCIH460的顯著損失細胞生存能力[20]。我們的研究也得出了類似的結論，與對照組相比，青藤堿處理后786-O細胞的抑制率明顯降低，且抑制率隨青藤堿濃度的增加而增加。青藤堿顯著下調c-myc蛋白表達，而誘導凋亡蛋白Bax、Caspase- 3表達上調。以上結果表明，青藤堿通過誘導786-O細胞周期G1/S期阻滯，促進凋亡來提高對腎細胞癌的抑制作用。