趙燕青, 許文輝, 賈 瓊

(吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 吉林 長(zhǎng)春 130012)

蛋白質(zhì)的磷酸化和糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTMs)中最廣泛的共價(jià)修飾形式,它們對(duì)生物體的生命過(guò)程具有重要的調(diào)控作用。磷酸化是在蛋白激酶的催化下,將腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)或鳥(niǎo)嘌呤-5′-三磷酸(GTP)的γ位磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)的氨基酸殘基(常見(jiàn)的是絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)上的過(guò)程,而其逆向過(guò)程則是由蛋白質(zhì)磷酸酶去除相應(yīng)的磷酸基團(tuán)。磷酸化可調(diào)控細(xì)胞膜的功能、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、參與線粒體功能、細(xì)胞代謝和轉(zhuǎn)錄代謝等[1-4]。糖基化是在糖基轉(zhuǎn)移酶的控制下,蛋白質(zhì)或脂質(zhì)上的氨基酸殘基與糖類形成糖苷鍵的過(guò)程,通常發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。糖基化在細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞間的內(nèi)吞等過(guò)程中都發(fā)揮著重要的作用。蛋白質(zhì)的異常磷酸化和糖基化與一系列病理狀況密切相關(guān),例如神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、腫瘤等[5-8]。檢測(cè)蛋白質(zhì)磷酸化/糖基化的方法通常有以下3種:同位素放射性標(biāo)記法、蛋白免疫印跡、質(zhì)譜分析,其中質(zhì)譜分析方法由于具有高通量、省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn),已成為最主要的檢測(cè)手段[9-12]。磷酸化肽和糖肽的低化學(xué)計(jì)量、低電離效率以及大量的非磷酸化肽、非糖肽的干擾,使得直接采用質(zhì)譜手段進(jìn)行檢測(cè)存在很大的挑戰(zhàn),因此在質(zhì)譜檢測(cè)前對(duì)磷酸化肽和糖肽的富集成為關(guān)鍵步驟。

已有多種富集策略被用于磷酸化肽和糖肽的富集。對(duì)于磷酸化肽的富集策略主要包括固定化金屬親和色譜(IMAC)和金屬氧化物親和色譜(MOAC)等[13-16]。IMAC策略主要是利用帶正電的金屬離子和帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)相互吸引,達(dá)到對(duì)磷酸化肽富集的目的[17-19]。MOAC策略則是依靠金屬原子與磷酸基氧的螯合作用實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽的捕捉[20,21]。IMAC和MOAC策略依靠金屬和磷酸基團(tuán)之間的強(qiáng)相互作用,往往會(huì)導(dǎo)致洗脫難的問(wèn)題,即只有少部分結(jié)合的磷酸化肽會(huì)被洗脫下來(lái)。對(duì)于糖肽的富集策略主要是基于糖肽和非糖肽之間親水性的相互差異,利用親水相互作用色譜(HILIC)對(duì)糖肽進(jìn)行富集。此外,硼酸親和法[22]、凝集素法[23]、肼腙反應(yīng)法[24]等也被廣泛用于糖肽的分離富集。

目前,已有多種材料被報(bào)道用于磷酸化肽和糖肽的分離富集,如殼聚糖[25]、磁性二氧化鈦[26]、磁性石墨烯[27]等。近年來(lái),智能響應(yīng)材料由于優(yōu)異的響應(yīng)性和可逆性在很多領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注,將其用于磷酸化肽和糖肽分離富集的研究也已陸續(xù)被報(bào)道。智能響應(yīng)材料能夠以規(guī)定的方式對(duì)環(huán)境或外部刺激做出響應(yīng)[28-30],可以引起智能材料響應(yīng)的刺激信號(hào)包括光、溫度、超聲、電磁場(chǎng)、pH、酶、氧化還原等[31-33]。根據(jù)是否向反應(yīng)體系內(nèi)引入化學(xué)物質(zhì),可將這些刺激分為內(nèi)源性刺激(pH、酶、氧化還原等)和外源性刺激(光、溫度、超聲、電磁場(chǎng)等)[32]。與傳統(tǒng)材料相比,智能響應(yīng)材料可逆的“打開(kāi)”和“關(guān)閉”特性在化學(xué)反應(yīng)中具有更好的可控性。智能響應(yīng)材料表現(xiàn)出的這種獨(dú)特性質(zhì)是由材料中的響應(yīng)分子決定的。響應(yīng)分子在刺激條件下的可逆變化將導(dǎo)致材料宏觀性質(zhì)上的動(dòng)態(tài)變化,如帶電性質(zhì)、親疏水性等[32,34-37]。通過(guò)調(diào)節(jié)智能響應(yīng)材料與磷酸化肽或糖肽的相互作用(如氫鍵、靜電相互作用、親疏水相互作用等),可以實(shí)現(xiàn)磷酸化肽或糖肽的識(shí)別、捕獲和釋放。

智能響應(yīng)材料在藥物輸送[32,38-40]、抗癌氣體NO的釋放治療[41,42]、癌癥生物成像[43]等的相關(guān)綜述已有報(bào)道。Sun等[44]詳述了蛋白質(zhì)PTMs的種類、概念、作用、分離富集的研究現(xiàn)狀,進(jìn)而介紹了智能聚合物(smart polymers)修飾的IMAC、MOAC、分子印跡聚合物等材料在磷酸化肽富集中的應(yīng)用,以及智能聚合物修飾的硼酸基、酰肼化學(xué)、親水相互作用驅(qū)動(dòng)的兩性離子聚合物在糖肽富集中的應(yīng)用。由于引起智能材料響應(yīng)的刺激信號(hào)對(duì)其性能具有重要的影響,因此,本綜述首次從刺激種類的角度介紹了智能響應(yīng)材料在磷酸化肽和糖肽富集中的研究進(jìn)展。按照刺激信號(hào)種類,將智能響應(yīng)材料分為外源性響應(yīng)材料和內(nèi)源性響應(yīng)材料,總結(jié)了外源性響應(yīng)、內(nèi)源性響應(yīng)、內(nèi)外源共同響應(yīng)的智能材料在磷酸化肽和糖肽分離富集方面的研究現(xiàn)狀以及發(fā)展前景。

1 外源性響應(yīng)材料

外源性刺激包括溫度、光、超聲、電磁場(chǎng)、機(jī)械應(yīng)力等,可在特定的時(shí)間和空間下實(shí)施[45-47],其中溫度和光這兩類外源性響應(yīng)材料應(yīng)用最為廣泛。外源性響應(yīng)材料不依賴于反應(yīng)體系本身的變化,具有非侵入性,對(duì)生物體友好。另外,良好的時(shí)空可調(diào)性使得其對(duì)反應(yīng)體系的調(diào)控更加簡(jiǎn)單快速。

1.1 溫度響應(yīng)材料

溫度響應(yīng)材料的顯著特征之一是擁有臨界溶解溫度。根據(jù)其對(duì)溫度的不同響應(yīng)程度,可分為兩類:一類是在臨界溫度以上不發(fā)生相變的材料(如N-異丙基丙烯酰胺,NIPAm),此時(shí)的臨界溫度為低臨界溶解溫度(LCST);另一類與上述情況相反,材料在臨界溫度以下發(fā)生相變,例如聚丙烯酰胺(PAAm)、聚丙烯酸(PAA)等,擁有高臨界溶解溫度(UCST)。其中,NIPAm由于具有優(yōu)越的溫度響應(yīng)性能,應(yīng)用最為廣泛。NIPAm同時(shí)含有親水基團(tuán)(酰胺基團(tuán))和疏水基團(tuán)(異丙基基團(tuán)),溫度可以改變這些基團(tuán)與水之間的氫鍵作用和疏水作用,從而發(fā)生相轉(zhuǎn)變[40,48-50]。當(dāng)溫度低于LCST時(shí),親水酰胺基團(tuán)與水分子之間的氫鍵作用大于異丙基與水分子之間的疏水作用,聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAm)分子鏈呈現(xiàn)自由且舒展的無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象。反之,當(dāng)溫度高于LCST時(shí),PNIPAm分子鏈發(fā)生脫水聚集,呈現(xiàn)卷曲緊縮的小球構(gòu)象[51]。據(jù)此,可將NIPAm單體與磷酸化肽或糖肽的識(shí)別單體共聚,得到具有柔性聚合物網(wǎng)絡(luò)的溫度響應(yīng)型磷酸化肽或糖肽吸附劑[52]。

1.2 光響應(yīng)材料

光響應(yīng)材料由于具有光源波長(zhǎng)可調(diào)節(jié)、可遠(yuǎn)程操控等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。相對(duì)于溫度響應(yīng)材料,光響應(yīng)材料在實(shí)際操作中更為便捷。光響應(yīng)材料中最為關(guān)鍵的是光敏基團(tuán),在光(可見(jiàn)光、紫外光、紅外光)的作用下,光敏基團(tuán)接收光信號(hào),通過(guò)光化學(xué)反應(yīng)過(guò)程將光信號(hào)轉(zhuǎn)化成化學(xué)信號(hào)[53-57]。常見(jiàn)的光敏基團(tuán)大致包括3類:在紫外-可見(jiàn)光下發(fā)生順?lè)串悩?gòu)的偶氮苯類化合物;通過(guò)螺C-O鍵斷裂和閉合,造成分子內(nèi)電荷變化的螺吡喃類化合物;發(fā)生周環(huán)化反應(yīng)的二芳基乙烯類化合物。

1.2.1偶氮苯類化合物

偶氮苯類化合物(AZB)存在兩種光致異構(gòu)體,在不同的刺激條件下偶氮雙鍵周圍發(fā)生可逆的反-順異構(gòu)化。AZB的反式構(gòu)型通常是最穩(wěn)定的,順式構(gòu)型可通過(guò)紫外光(340～380 nm)照射獲得。在可見(jiàn)光照射的條件下,AZB發(fā)生從順勢(shì)構(gòu)型向反式構(gòu)型的異構(gòu)化[38,51,58-62]。對(duì)于大多數(shù)AZB來(lái)說(shuō),在室溫條件下順勢(shì)構(gòu)型通常是不穩(wěn)定的,會(huì)慢慢向反式構(gòu)型轉(zhuǎn)變。這種順?lè)串悩?gòu)的轉(zhuǎn)變不會(huì)引起化學(xué)鍵的斷裂,但是順式和反式構(gòu)型的理化性質(zhì)有所不同,如分子極性、空間位阻、分子尺寸等。依據(jù)這一特性,可以將偶氮苯與糖肽模型相連,賦予糖肽自主裝能力以及對(duì)光的響應(yīng)特性,有望將AZB用于糖肽的富集研究[63]。

1.2.2螺吡喃類化合物

螺吡喃類化合物(SP)的吲哚啉和吡喃環(huán)部分之間的螺C原子在紫外光照射(或近紅外光的雙光子激發(fā))下由sp3雜化向sp2結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化,發(fā)生開(kāi)環(huán)反應(yīng),形成更具共軛性的兩性離子部花菁(MC)結(jié)構(gòu)[64-66]。SP比較特殊,除了光刺激可以使其異構(gòu)化外,溫度、機(jī)械應(yīng)力以及pH、金屬離子等都可以使其發(fā)生異構(gòu)化。在SP的閉環(huán)異構(gòu)體中,兩個(gè)芳環(huán)相互垂直,π軌道相互不共軛,因此形成的是無(wú)色的閉環(huán)結(jié)構(gòu);MC開(kāi)環(huán)異構(gòu)體擁有共平面結(jié)構(gòu),兩個(gè)芳環(huán)產(chǎn)生了大的π共軛,從而形成有色結(jié)構(gòu)。MC還可以進(jìn)一步質(zhì)子化,得到帶有正電荷的MCH+。結(jié)構(gòu)上的差異使得兩者的化學(xué)、物理性質(zhì)存在明顯區(qū)別。利用SP異構(gòu)體之間帶電性質(zhì)以及顏色的區(qū)別,可以將其廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域,如響應(yīng)性水凝膠[67-69]、光響應(yīng)太陽(yáng)眼鏡[70]、信息防偽[71,72]等。由于MC或MCH+異構(gòu)體帶有電荷,因此,可以基于靜電相互作用對(duì)陰陽(yáng)離子(Cl-、F-/Na+)[64,73]或帶負(fù)電荷的磷酸化肽進(jìn)行富集[74]。

1.2.3二芳基乙烯類化合物

二芳基乙烯類化合物(DTE)在紫外光的照射下發(fā)生周環(huán)化反應(yīng),由無(wú)色具有熒光的開(kāi)環(huán)狀態(tài)異構(gòu)為有色無(wú)發(fā)射的閉環(huán)狀態(tài);在受到可見(jiàn)光的照射下,閉環(huán)狀態(tài)的異構(gòu)體又可以重新轉(zhuǎn)化為開(kāi)環(huán)異構(gòu)體[75-78]。這種劇烈的結(jié)構(gòu)和電子特性的改變,導(dǎo)致兩種異構(gòu)體吸收光和發(fā)射光能力的截然不同[79-81]。一般來(lái)說(shuō),DTE在開(kāi)環(huán)異構(gòu)體(紫外區(qū)的吸收帶,無(wú)色)到閉環(huán)異構(gòu)體(可見(jiàn)光區(qū)的吸收帶,有色)的光環(huán)化過(guò)程中表現(xiàn)出非常大的光譜位移。這是因?yàn)閮蓚€(gè)稠合噻吩環(huán)中的π電子離域作用以及取代基電子性質(zhì)的改變。在DTE的實(shí)際應(yīng)用中有兩種思路可供選擇:一是利用其本身閉環(huán)和開(kāi)環(huán)兩種異構(gòu)體的固有性質(zhì),即明顯的顏色變化設(shè)計(jì)光學(xué)開(kāi)關(guān);二是利用兩種異構(gòu)體的熒光特性,通過(guò)紫外-可見(jiàn)光刺激設(shè)計(jì)熒光開(kāi)關(guān)。例如,DTE可以作為非肽生色團(tuán)修飾在多肽骨架中,進(jìn)而可以通過(guò)紫外/可見(jiàn)光有效控制所得肽模擬物的生物活性[82]。

2 內(nèi)源性響應(yīng)材料

內(nèi)源性刺激包括pH、氧化還原、酶、溶液極性和離子強(qiáng)度等。其中,pH刺激應(yīng)用較為廣泛,酶刺激的特異性較強(qiáng)。與外源性響應(yīng)材料不同,內(nèi)源性響應(yīng)材料依賴于反應(yīng)體系本身的變化,并且有時(shí)調(diào)控過(guò)程需要向反應(yīng)體系引入其他化學(xué)物質(zhì),具有侵入性,對(duì)生物體可能有一定損傷[46]。

2.1 pH響應(yīng)材料

pH響應(yīng)的智能材料一般都含有對(duì)酸或堿敏感的物質(zhì),如環(huán)糊精囊泡、羧酸、硼酸、胺等[40,83,84]。隨著介質(zhì)pH值的改變,這些基團(tuán)發(fā)生電離,造成溶液內(nèi)離子濃度的改變,從而引起材料的形狀、親疏水性等理化性質(zhì)的改變。pH響應(yīng)材料的開(kāi)發(fā)研究已被用于腫瘤弱酸(pH 5.8～7.2)微環(huán)境中的藥物控釋[35,40,85]。富集糖肽常用的策略----硼酸親和法也是基于pH響應(yīng)。在pH調(diào)控下,硼酸基團(tuán)與糖肽上的順式鄰二醇可逆結(jié)合,實(shí)現(xiàn)糖肽的捕獲與釋放[86]。

2.2 酶響應(yīng)材料

酶響應(yīng)材料一般由肽及其衍生物組成,這是由于酶的作用底物是由特定的氨基酸序列組成的,研究中使用較多的酶有蛋白酶、磷脂酶、糖苷酶等。酶響應(yīng)材料的作用機(jī)理主要包括催化鍵的形成和斷裂、底物的氧化或還原等[87-89]。例如,甘露糖轉(zhuǎn)移酶可與O-乙酰氨基葡萄糖(O-GlcNAc)共價(jià)連接生成酮,生成的酮可與氨基生物素相連,然后通過(guò)陽(yáng)離子交換作用分離富集修飾后的O-GlcNAc肽段[90,91]。酶響應(yīng)材料的專一性較強(qiáng),但是酶的價(jià)格昂貴,并且有酶參與的反應(yīng)通常需要保持合適的環(huán)境條件來(lái)維持酶的活性,因此在磷酸化肽或糖肽的分離富集方面,此類材料并不是首選。

3 智能響應(yīng)材料在磷酸化肽和糖肽富集中的應(yīng)用

3.1 外源性響應(yīng)材料

3.1.1在磷酸化肽富集中的應(yīng)用

用于磷酸化肽富集的外源性響應(yīng)材料多為溫度響應(yīng)材料。在諸多用于磷酸化肽富集的溫度響應(yīng)材料中,以NIPAm類材料最為常用。Dai等[92]以NIPAm為溫度響應(yīng)分子,異丙烯膦酸(IPPA)作為Ti(Ⅳ)固定配體,兩者以可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(RAFT)反應(yīng)接枝在二氧化硅微球表面,進(jìn)而得到單重溫度響應(yīng)的色譜材料silica@p(NIPAm-co-IPPA)-Ti4+。通過(guò)獨(dú)特的聚(N-異丙基丙烯酰胺)的溫度響應(yīng)特性,捕獲的磷酸化肽可以通過(guò)改變溫度被釋放,而無(wú)需使用任何可能損壞磷酸化肽的洗脫液。該智能響應(yīng)材料表現(xiàn)出對(duì)磷酸化肽的有效捕獲以及快速釋放,具有很強(qiáng)的富集潛力。Xia等[93]以苯基磷酸作為模板,NIPAm為溫度響應(yīng)分子,制備了具有溫度響應(yīng)特性的分子印跡材料(TMIPs)。當(dāng)溫度為28 ℃時(shí),聚合物的空腔尺寸剛好能夠捕獲酪氨酸磷酸化肽;而當(dāng)溫度升高至28 ℃以上時(shí),聚合物空腔收縮,從而釋放捕獲到的磷酸化肽。該溫度響應(yīng)材料既有分子印跡材料對(duì)目標(biāo)生物分子優(yōu)異的靶向性,同時(shí)又具備對(duì)溫度的響應(yīng)性,這對(duì)開(kāi)發(fā)新的蛋白質(zhì)PTMs富集材料提供了新的思路。

3.1.2在糖肽富集中的應(yīng)用

外源性響應(yīng)材料對(duì)糖肽的富集也多是利用溫度響應(yīng)性質(zhì)。例如,Moon等[94]報(bào)告了一種串聯(lián)的溫度響應(yīng)性多孔聚合物膜反應(yīng)器(TPPMRs)。作者將溫度響應(yīng)性聚合物聚苯乙烯-馬來(lái)酸酐-聚異丙基丙烯酰胺(PS-MAn-PNIPAm)涂覆在尼龍薄片上制備溫度響應(yīng)性多孔聚合物膜(TPPM)。在TPPMRs中,一個(gè)TPPM用胰蛋白酶固定,對(duì)糖蛋白進(jìn)行水解;另一個(gè)則用凝集素固定,用于糖肽富集。PNIPAm在高溫下形成膠束腔,改變其形態(tài)可以導(dǎo)致酶或凝集素與流經(jīng)膜的蛋白質(zhì)或糖肽之間的相互作用增強(qiáng)。進(jìn)而,作者通過(guò)改變溫度條件,對(duì)TPPMRs富集糖肽的性能進(jìn)行了評(píng)估。在37 ℃時(shí),糖蛋白的水解和糖肽富集都非常有效。將該溫度響應(yīng)材料與納流液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜(nLC-ESI-MS/MS)方法聯(lián)用,可從1.5 μL人血漿樣品中鑒定出155種糖蛋白和262種N-糖肽。該溫度響應(yīng)材料可以有效地用于糖蛋白的癌癥特異性生物標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)。

目前,對(duì)磷酸化肽和糖肽富集的外源性響應(yīng)材料大多是基于NIPAm的溫度響應(yīng)材料。通過(guò)改變反應(yīng)體系的溫度,導(dǎo)致材料形貌的改變,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽或糖肽的可控捕獲與釋放。而其他類型的外源性響應(yīng)材料,例如光、電磁場(chǎng)等在磷酸化肽和糖肽富集方面應(yīng)用較少。另外,溫度響應(yīng)材料雖然不向反應(yīng)體系中引入其他化學(xué)物質(zhì),但是這類材料可能會(huì)引起局部過(guò)熱現(xiàn)象,從而導(dǎo)致生物體的損傷。

3.2 內(nèi)源性響應(yīng)材料

3.2.1在磷酸化肽富集中的應(yīng)用

相比于酶響應(yīng)材料,pH響應(yīng)材料在磷酸化肽的富集研究中更為常見(jiàn)。例如,Wu等[95]制備了一種智能納米探針,在磁性納米粒子表面引入聚酰胺樹(shù)狀大分子(PAMAM)接枝的聚(甲基丙烯酸)(PMAA)刷(Fe3O4@PDA@PMAA@PAMAM)。PAMAM具有豐富且交替有序的氨基,通過(guò)調(diào)節(jié)緩沖液和洗脫液的酸度,可以實(shí)現(xiàn)氨基與磷酸基團(tuán)之間靜電和氫鍵相互作用的可調(diào)控性。Fe3O4@PDA@PMAA@PAMAM對(duì)磷酸化肽表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性(β-酪蛋白∶牛血清白蛋白=1∶500(質(zhì)量比))和高靈敏度(1 fmol)。除了上述pH響應(yīng)材料外,還可以基于超分子化學(xué)中金屬-配體鍵的動(dòng)態(tài)性,實(shí)現(xiàn)磷酸化肽的可控捕獲與釋放,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽的富集。例如,Chen等[33]設(shè)計(jì)了一種二維(2D)金屬環(huán)芯超分子聚合物,超分子環(huán)中包含基于氫鍵(脲基)和靜電相互作用的(Pt基金屬環(huán))磷酸識(shí)別單元,對(duì)磷酸化肽具有強(qiáng)有力的和高度特異性的結(jié)合。該智能超分子聚合物材料響應(yīng)的機(jī)理為:當(dāng)向反應(yīng)體系中加入四丁基氯化銨(Bu4Cl)時(shí),在鹵化物的誘導(dǎo)下,2D聚合物分解,釋放出捕獲的磷酸化肽;當(dāng)添加三氟甲烷磺酸銀(AgOTf)時(shí),2D聚合物重組,用于磷酸化肽的捕獲。金屬-配體鍵的動(dòng)態(tài)性質(zhì),賦予了智能2D金屬環(huán)芯超分子聚合物與磷酸化肽之間相互作用的可調(diào)控性。

3.2.2在糖肽富集中的應(yīng)用

β-環(huán)糊精是一種典型的天然環(huán)狀低聚糖,具有疏水空腔和親水外表面,在納米材料、分子識(shí)別等方面應(yīng)用廣泛?；谥骺腕w作用合成的β-環(huán)糊精囊泡具有獨(dú)特的響應(yīng)特性,在熱、紫外光、pH或化學(xué)刺激下,可以在球狀囊泡和纖維束管狀兩種結(jié)構(gòu)之間可逆轉(zhuǎn)化。Jia等[24]將β-環(huán)糊精囊泡作為pH響應(yīng)分子,首次引入到聚合物整體柱材料中,當(dāng)pH為7.4時(shí),β-環(huán)糊精囊泡呈現(xiàn)親水性,可以捕獲糖肽;當(dāng)pH降低至5.0時(shí),β-環(huán)糊精囊泡轉(zhuǎn)化為纖維管狀結(jié)構(gòu),親水性降低,從而釋放糖肽(見(jiàn)圖1)。通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H,引起pH響應(yīng)整體柱材料的親疏水性的顯著變化,實(shí)現(xiàn)對(duì)糖肽的選擇性捕獲與釋放?；趐H響應(yīng)的糖肽富集材料還有很多種,例如,Qin等[96]制備了一種酰肼功能化的pH響應(yīng)性材料----聚(丙烯酸-co-丙烯酸甲酯)(P(AA-co-MA)),并將其用于糖蛋白/糖肽的富集。當(dāng)pH變化時(shí),發(fā)生可逆的自組裝和相分離,即在中性至弱酸性(pH=6.0)溶液中,聚合物在水溶液中溶解性良好;當(dāng)pH降為2.0時(shí),快速沉淀。這是由于當(dāng)pH降低時(shí),聚合物與目標(biāo)糖肽結(jié)合,發(fā)生大規(guī)模自組裝過(guò)程而產(chǎn)生沉淀。隨后,作者使用PNGase F(N-糖酰胺酶F)切割聚合物P(AA-co-MA)與N-糖肽之間的共價(jià)鍵,實(shí)現(xiàn)了糖肽的釋放。

圖 1 聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯-季戊四醇三丙烯酸酯-環(huán)糊精囊泡)(p(GMA-PETA-CDV))整體柱材料的合成[24]Fig. 1 Synthesis of the poly(glycidyl methacrylate-pentaerythritol triacrylate-cyclodextrin vesicles) (p(GMA-PETA-CDV)) monolith[24]

圖 2 MNP-SP的(a)合成方案和(b)選擇性捕獲磷酸化肽的過(guò)程[74]Fig. 2 (a) Synthesis scheme and (b) process of selective capture of phosphopeptides of spiropyran-modified magnetic nanoparticles (MNP-SP)[74]

Liang課題組在響應(yīng)性材料用于糖肽的富集方面做了大量工作。他們將阿洛糖單元整合到聚丙基丙烯酰(PAM)鏈中,得到糖類pH響應(yīng)共聚物材料[97]。阿洛糖是一類可對(duì)唾液酸糖肽(SGs)表現(xiàn)出特異性結(jié)合并且對(duì)pH敏感的單糖。阿洛糖對(duì)SGs的高特異性主要?dú)w因于其與碳水化合物之間的多重氫鍵相互作用,特異性的糖-糖相互作用成為富集和識(shí)別SGs的關(guān)鍵。通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的極性和pH,可以智能觸發(fā)SGs的捕獲與釋放。隨后,該課題組[98]制備了乳糖修飾的聚丙烯酰胺智能聚合物(PAM-g-乳糖0.11)。乳糖被作為糖肽識(shí)別單元,同樣基于碳水化合物-碳水化合物相互作用(CCIs),實(shí)現(xiàn)了N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac,一種典型的唾液酸)糖肽的富集。唾液酸分子通過(guò)CCIs與接枝乳糖單元的結(jié)合誘導(dǎo)聚合物鏈的構(gòu)象轉(zhuǎn)變,進(jìn)一步導(dǎo)致表面形貌、潤(rùn)濕性和剛度的顯著和可逆的轉(zhuǎn)換,實(shí)現(xiàn)了將微弱的CCIs信號(hào)轉(zhuǎn)化為聚合物表面宏觀性質(zhì)(即表面形貌、潤(rùn)濕性和剛度)的轉(zhuǎn)換。PAM-g-乳糖0.11憑借對(duì)唾液酸的出色識(shí)別和響應(yīng)能力,實(shí)現(xiàn)了在復(fù)雜樣品中SGs的高效富集。

內(nèi)源性響應(yīng)材料對(duì)磷酸化肽和糖肽的選擇性富集研究大多集中于pH響應(yīng)材料,而酶則通常在磷酸化肽和糖肽富集中用于切割富集完成后材料與肽段連接的共價(jià)鍵。在pH響應(yīng)過(guò)程中,通過(guò)調(diào)節(jié)溶液pH引起材料結(jié)構(gòu)的改變,進(jìn)而使得材料的理化性質(zhì)發(fā)生顯著變化,從而調(diào)節(jié)了內(nèi)源性響應(yīng)材料與磷酸化肽或糖肽之間的相互作用。

3.3 內(nèi)外源共同響應(yīng)材料

內(nèi)外源響應(yīng)材料的制備思路有兩種:一是可以將多種響應(yīng)分子整合,制備內(nèi)外源共同響應(yīng)材料;二是對(duì)于智能響應(yīng)材料中的響應(yīng)分子來(lái)講,有的響應(yīng)分子可以對(duì)多種刺激做出反應(yīng),從而得到內(nèi)外源共同響應(yīng)的材料。在實(shí)際應(yīng)用中,內(nèi)外源共同響應(yīng)材料的設(shè)計(jì)和制備可以靈敏的感知外界環(huán)境的變化并快速地產(chǎn)生動(dòng)態(tài)響應(yīng),獲得更有效的響應(yīng)效果。

3.3.1在磷酸化肽富集中的應(yīng)用

對(duì)磷酸化肽富集來(lái)說(shuō),由于外源性響應(yīng)材料大多是基于NIPAm的溫度響應(yīng)材料,因此,內(nèi)外源共同響應(yīng)材料通常是將一種內(nèi)源性響應(yīng)單體與NIPAm溫度響應(yīng)單體共聚,從而賦予材料多種刺激響應(yīng)。例如,Sun等[52]選取對(duì)羧基苯基硫脲(ATBA)與柔性的聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAm)網(wǎng)絡(luò)共聚,得到三重響應(yīng)的多磷酸化肽(MPPs)富集材料。PNIPAm具有智能氫鍵網(wǎng)絡(luò),將適當(dāng)?shù)纳镒R(shí)別單元(ATBA)整合在PNIPAm中,聚合物鏈的構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變,并影響目標(biāo)生物分子的捕獲與釋放?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)溶劑極性、pH、溫度來(lái)調(diào)節(jié)材料的多重氫鍵作用,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多磷酸化肽的可逆調(diào)控吸附與釋放。該智能響應(yīng)材料對(duì)MPPs具有高吸附容量(463 mg/g)和回收率(90%)。此外,作者還從Hela S3細(xì)胞裂解物中鑒定出大量多磷酸化位點(diǎn)。這種內(nèi)外源共同響應(yīng)材料對(duì)MPPs具有高富集選擇性,表明其在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的巨大潛力。

SP類化合物是一類可對(duì)多種內(nèi)源或外源刺激同時(shí)產(chǎn)生響應(yīng)的響應(yīng)分子。在不同刺激條件下,電中性的閉環(huán)態(tài)SP與帶電的MC或MCH+開(kāi)環(huán)態(tài)之間具有可逆的相互異構(gòu),這一獨(dú)特的性質(zhì)賦予了它廣泛的應(yīng)用。Jia等[74]通過(guò)簡(jiǎn)單的酯化反應(yīng)制備了螺吡喃修飾的磁性納米粒子(MNP-SP),并將其用于復(fù)雜生物環(huán)境中磷酸化肽的富集。該項(xiàng)工作同時(shí)引入了光和pH雙重刺激,在紫外光和酸的刺激下,MNP-SP異構(gòu)為帶正電的MNP-MCH+材料,基于靜電相互作用,實(shí)現(xiàn)了對(duì)磷酸化肽的選擇性捕獲(見(jiàn)圖2)。借助MALDI-TOF-MS分析技術(shù),作者對(duì)不同刺激條件下材料的富集能力進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果表明,與單一內(nèi)或外源刺激相比,紫外光和pH的內(nèi)外源共同刺激使得材料的富集能力顯著提高。該智能響應(yīng)材料MNP-SP對(duì)磷酸化肽的檢測(cè)具有高的靈敏度(檢出限為0.4 fmol)和良好的可重復(fù)使用性(6次循環(huán))。當(dāng)用于富集脫脂牛奶、人唾液和人血清樣品中的磷酸化肽時(shí),該材料被證明是富集復(fù)雜生物環(huán)境中低豐度磷酸化肽的理想吸附劑。

3.3.2在糖肽富集中的應(yīng)用

內(nèi)外源共同響應(yīng)材料對(duì)于糖肽的富集往往是基于NIPAm溫度響應(yīng)單體與其他pH響應(yīng)單體的結(jié)合。例如,Menzel等[99]合成了具有溫度響應(yīng)性和pH響應(yīng)性的兩親性嵌段共聚物聚(L-谷氨酸)-b-聚(N-異丙基丙烯酰胺)(pGA-b-pNIPAM)。聚-L-谷氨酸(pGA)不僅具有親水性,而且對(duì)pH較為敏感,即隨著pH值的降低,構(gòu)象從無(wú)規(guī)卷曲變?yōu)棣?螺旋結(jié)構(gòu)。作者研究了pGA-b-pNIPAM顆粒的形成,以及pGA糖冠與凝集素的相互作用。結(jié)果表明,該雙重響應(yīng)性pGA-b-pNIPAM材料溫度在LCST以上時(shí)形成了具有疏水核心和糖基化表面的顆粒,并且pGA糖冠與凝集素的這種相互作用使得pGA-b-pNIPAM顆粒有望用于糖蛋白的富集研究。

將NIPAm與糖肽的經(jīng)典富集策略----硼酸親和法結(jié)合,可以設(shè)計(jì)基于溫度和pH的內(nèi)外源共同響應(yīng)材料,并用于糖肽富集。Ye等[22]提出了將高密度的硼酸(APBA)配體固定在熱響應(yīng)性嵌段共聚物刷上,得到內(nèi)外源共同響應(yīng)材料p(NIPAm-b-pBA),通過(guò)固定的硼酸與糖肽的協(xié)同多重共價(jià)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了糖肽的選擇性富集。將p(NIPAm-b-pBA)修飾在二氧化硅微球表面,得到聚合物雜化材料Si@pNIPAm-b-pBA。該納米復(fù)合材料對(duì)糖肽的結(jié)合能力可通過(guò)控制pH和溫度來(lái)調(diào)節(jié),為開(kāi)發(fā)可同時(shí)用于生物分離和生物醫(yī)學(xué)的復(fù)合材料提供了新的機(jī)遇。

到目前為止,內(nèi)外源共同響應(yīng)材料在設(shè)計(jì)思路上大多是基于溫度和pH響應(yīng),而關(guān)于其他內(nèi)外源響應(yīng)材料的研究較少。內(nèi)外源共同響應(yīng)材料具有多樣化響應(yīng)特性,可以更好地適應(yīng)復(fù)雜生物環(huán)境的變化。相比于單一內(nèi)或外源響應(yīng)材料,內(nèi)外源共同響應(yīng)材料有望獲得更好的響應(yīng)效果。

4 結(jié)論與展望

智能響應(yīng)材料具有卓越的響應(yīng)性、可逆的構(gòu)象轉(zhuǎn)換以及優(yōu)異的可調(diào)控性等顯著優(yōu)勢(shì),在不同的內(nèi)/外源刺激條件下,材料的各種宏觀理化性質(zhì)會(huì)發(fā)生顯著變化,這是常規(guī)材料所不能實(shí)現(xiàn)的。將智能響應(yīng)材料應(yīng)用于磷酸化肽和糖肽的富集,主要是基于在該類材料中設(shè)計(jì)可以精確識(shí)別磷酸化肽和糖肽的識(shí)別單元。例如,對(duì)于磷酸化肽來(lái)講,可以尋找基于氫鍵(硫脲基、酰胺、胺類等)或攜帶正電荷基團(tuán)的識(shí)別單元;糖肽則可以選擇親疏水性質(zhì)有顯著變化的識(shí)別單元。但是,已研究的富集磷酸化肽或糖肽的智能響應(yīng)材料大多是基于溫度和pH響應(yīng),而對(duì)其他響應(yīng)類型研究較少,未來(lái)期待開(kāi)發(fā)更多響應(yīng)類型的富集磷酸化肽或糖肽的智能響應(yīng)材料。另外,針對(duì)磷酸化肽和糖肽富集的智能響應(yīng)材料設(shè)計(jì)思路可以擴(kuò)展到其他的蛋白質(zhì)PTMs,如乙酰化、泛素化和甲基化等。但是,目前對(duì)于其他PTMs肽或蛋白識(shí)別單元的設(shè)計(jì)還存在著較大的挑戰(zhàn)。相信隨著科技的發(fā)展,在未來(lái)的工作中智能響應(yīng)材料可以更加廣泛地應(yīng)用于多種PTMs的分離富集研究。