李娟，彭健瑋，孫雪梅*

(1.青海大學農(nóng)林科學院青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室,西寧 810016；2.滬青蔬菜種質資源創(chuàng)新與基因組學聯(lián)合實驗室，西寧 810016)

菊芋(HelianthustuberosusL.)，又名洋姜，是菊科植物，原產(chǎn)于北美洲[1]。菊芋塊莖是無污染的綠色食品[2]，其中豐富的碳水化合物、蛋白質、微量Mg2+等元素使得菊芋成為一種優(yōu)良的多汁飼料[3]。菊芋塊莖既可作為菊芋果干生食，也可腌制后食用[4]。菊芋的塊莖表皮有白、粉、紫、紅等不同顏色，其差異主要是由花青素組分及含量不同導致的[5]。有色塊莖菊芋表皮中含有較高的花色苷等酚類物質，目前可用于天然色素和抗氧化劑的生產(chǎn)，從而增大了菊芋的利用范圍[6]。目前，針對菊芋塊莖花青素提取工藝優(yōu)化的相關研究較少，且目前花青素的提取方法主要為超聲波輔助提取法[7]，因此本文以超聲法輔助提取菊芋塊莖花青素。

在菊芋超聲輔助提取花青素過程中，料液比、超聲時間等因素對花青素的提取都有一定影響, 為了獲得較為高效的提取工藝,必須對工藝參數(shù)進行優(yōu)化。響應面法已在植物花青素等物質提取工藝優(yōu)化方面得到廣泛的應用[8-9]。遺傳算法具有全局尋優(yōu)的特征[10]。為了探究適合超聲輔助提取菊芋花青素工藝的優(yōu)化方法，將兩者結合可以達到較好的預測和優(yōu)化效果，實現(xiàn)優(yōu)化工藝參數(shù)的目的，以期為菊芋花青素的提取工藝提供基礎，使菊芋得到更好的利用與發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊芋樣品(JA88 紫色)：由青海省農(nóng)林科學院提供；試驗試劑：國產(chǎn)AR。

1.2 儀器與設備

SPECORD 210 Plus紫外可見分光光度計;SB25-12DT超聲波清洗機;4-16KS離心機;101-2A鼓風干燥箱；Milli-Q IQ7000水純化系統(tǒng)；MS303S/01天平。

1.3 方法

1.3.1 菊芋塊莖表皮粉末的制備

將成熟收獲的菊芋塊莖用超純水洗凈，取其表皮烘干，粉碎，過篩。

1.3.2 菊芋表皮花青素的提取

準確稱取菊芋表皮粉末0.1 g，根據(jù)料液比添加乙醇和鹽酸的混合溶液，搖勻。在一定的溫度下，采用超聲法提取花青素，取出，離心10 min后，取得溶液上清液。

1.3.3 緩沖液的配制

pH 1.0的緩沖溶液：配制0.2 mol/L KCl與0.2 mol/L HCl溶液，借助pH計調pH至1.0±0.1。

pH 4.5的緩沖溶液：配制0.2 mol/L NaAc與0.2 mol/L HCl溶液，借助pH計調pH至4.5±0.1[11]。

1.3.4 最大吸收波長的選擇

將樣品分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液稀釋處理，測定樣品最佳吸光值[12]。

1.3.5 花青素含量的測定

取1 mL上清液，將其分別加入9 mL pH 1.0和pH 4.5的緩沖液中，搖勻，充分反應，在Max nm和700 nm波長條件下，用1 cm比色皿，測定吸光值,計算出花青素的含量(mg/g),由此作為計算菊芋表皮花青素含量的指標。每組進行3個重復樣本,每次試驗做取超純水進行試驗的空白對照。菊芋表皮花青素得率按下式計算[13]:

A=(AMax nm-A700 nm)pH 1.0-(AMax nm-A700 nm)pH 4.5。

式中:A為總吸光值；ε為26900 L/(mol·cm)；L為1 cm；MW為449.2 g/mol；DF為稀釋10倍；V為10 mL；Mt為0.1 g。

1.3.6 超聲法提取菊芋花青素單因素試驗

按1.3.2和1.3.5試驗。一次只變化一個選定因素，把該因素最優(yōu)取值選為考察另外因素的已知條件, 每個試驗重復3次，完成所有因素的最優(yōu)取值。

1.3.7 Plackett-Burman(PB)試驗設計

PB試驗采用較少的試驗次數(shù)，但卻可以從多個因素中尋找到對試驗目標起到顯著影響的一些因素[14]。根據(jù)之前單因素試驗結果，PB試驗選擇5個因素，以花青素含量為響應值。PB試驗設計見表1。

表1 PB試驗因素與水平

1.3.8 最陡爬坡試驗

在之前所做PB試驗結果的基礎上，進行最陡爬坡試驗，獲得最佳條件區(qū)間，同時可將結果設為響應面中心點進行試驗[15]。

1.3.9 響應面試驗設計

在之前試驗的基礎上，以Box-Behnken原理為依據(jù)，料液比(A)、超聲時間(B) 和乙醇體積分數(shù)(D)作為試驗因素，其余因素為超聲溫度40 ℃、鹽酸濃度0.3 mol/L，見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計因素與水平

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016、Origin 2021、SPSS 26.0、Design-Expert 13和Matlab 2016完成。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對花青素提取量的影響

由圖1可知，用95%乙醇提取菊芋塊莖表皮花青素，超聲溫度40 ℃、超聲時間40 min、鹽酸濃度0.1 mol/L，菊芋花青素的提取值在1∶30 (g/mL) 條件下達到最大，在更高料液比下，提取的花青素含量沒有差異顯著(P>0.05)。綜上，料液比選為1∶30 (g/mL)。

圖1 料液比對花青素提取量的影響

2.1.2 超聲時間對花青素提取量的影響

由圖2可知，選擇料液比1∶30 (g/mL)，95%乙醇、超聲溫度40 ℃、鹽酸濃度0.1 mol/L，超聲時間不斷變化，菊芋花青素的提取量也不斷變化，但其并沒有呈現(xiàn)顯著變化，且超聲時間為90 min時，提取的花青素含量最高。綜上，超聲時間90 min為最佳單因素。

圖2 超聲時間對花青素提取量的影響

2.1.3 超聲溫度對花青素提取量的影響

由圖3可知，選擇料液比1∶30 (g/mL)、95%乙醇、超聲時間90 min、鹽酸濃度0.1 mol/L，隨著超聲溫度不斷上升，提取的花青素含量先上升后下降，40 ℃時提取量達到最大值27.02 mg/g，且溫度上升至80 ℃時，含量大幅度降低，符合花青素遇高溫降解的特性[16]。因此，超聲溫度選擇40 ℃。

圖3 超聲溫度對花青素提取量的影響

2.1.4 乙醇體積分數(shù)對花青素提取量的影響

由圖4可知，選擇料液比1∶30 (g/mL)、超聲溫度40 ℃、超聲時間90 min、鹽酸濃度0.1 mol/L，隨著乙醇體積分數(shù)的增大, 提取量呈現(xiàn)“Z”形趨勢，在50%的條件下，提取量達到最大值17.63 mg/g，隨后降低再升高。綜上，選擇乙醇體積分數(shù)50%為最佳單因素。

圖4 乙醇體積分數(shù)對花青素提取量的影響

2.1.5 鹽酸濃度對花青素提取量的影響

圖5 鹽酸濃度對花青素提取量的影響

選擇料液比1∶30 (g/mL)、超聲溫度40 ℃、超聲時間90 min、乙醇濃度50%，不斷增加鹽酸濃度,菊芋花青素的提取量呈現(xiàn)升高的趨勢，在濃度為0.3 mol/L時獲得最大值27.79 mg/g，隨后降低再升高并且趨于穩(wěn)定。綜上，選擇鹽酸濃度0.3 mol/L為最佳單因素。

2.2 PB試驗設計及結果

根據(jù)試驗數(shù)據(jù)構建模型，其P值為0.0016<0.01，為非常顯著水平，說明設計的該模型符合標準，PB試驗設計與結果及效應分析見表3和表4。試驗因素對菊芋花青素提取量的影響程度是：乙醇體積分數(shù)>料液比>超聲時間>鹽酸濃度>超聲溫度，其中乙醇體積分數(shù)為極顯著水平(P<0.001)，對花青素含量的提取為正向影響；料液比為非常顯著水平(0.001>P>0.01)，對花青素含量的提取為負向影響；超聲時間為顯著水平(0.01>P>0.05)，對花青素含量的提取為正向影響，其余因素沒有顯著影響。BB試驗最少需要3個試驗因素[17]，因此，結合試驗結果，選取乙醇體積分數(shù)、料液比和超聲時間進行最陡爬坡試驗。

表3 PB試驗設計與結果

表4 PB試驗設計效應分析

2.3 最陡爬坡試驗結果

超聲時間和乙醇體積分數(shù)對花青素的提取為正向影響，料液比為負向影響(見表4)，所以增大超聲時間及乙醇體積分數(shù)，縮小料液比有助于花青素的提取，綜合以上3個因素，根據(jù)正負影響，設計步長和爬坡方向，與此同時更改因素區(qū)間，從而快速篩選出因素的最佳區(qū)域。由表5可知，組4為最合適的方案，故以此為響應面的中心設計。

表5 最陡爬坡試驗設計與結果

2.4 響應面試驗結果

2.4.1 Box-Behnken試驗設計結果及方差分析

根據(jù)之前的試驗結果，經(jīng)過BB試驗，得到數(shù)據(jù)結果，見表6和表7。同時獲得相關方程：花青素提取量(mg/g)=30.55-3.13A+2.3B+2.51C-1.67AB-6.26AC-0.4175BC-2.33A2-6.51B2-6.09C2。

表6 Box-Behnken試驗設計及結果

表7 響應面試驗方差分析

模型的P值為0.0027，極顯著，失擬項的P值為0.1501，大于0.05，不顯著，R2=0.9304，表明模型擬合度良好，同時表明模型可以反映對菊芋花青素提取的預測(見表7)。

2.4.2 響應面分析

對響應面得到的試驗結果進行分析，從而獲得各因素交互對菊芋花青素獲得提取值影響的響應面圖和等高線圖，見圖6。獲得的響應面圖都較為平緩，說明因素變化對響應值的影響不敏感。等高線圖d、e的橢圓形狀都較明顯，表明AB、AD之間交互作用顯著[18-20]，等高線圖f為圓形，說明BD交互作用不顯著。

圖6 因素交互對花青素提取量影響的響應面圖與等高線圖

綜合之前的結論,其回歸模型預測的最適合工藝條件為：超聲溫度40 ℃,乙醇體積分數(shù)70%，超聲時間112.79 min，料液比1∶15 (g/mL),鹽酸濃度0.3 mol/L，花青素理論提取值為35.019 mg/g。

2.5 基于遺傳算法的多目標優(yōu)化

根據(jù)上述響應面進行數(shù)學模型的參數(shù)優(yōu)化(見圖7)，根據(jù)遺傳算法來編程，從而找到最優(yōu)解。模型約束情況為：Lower=[-1，-1，-1]；Upper=[1,1,1]。相關參數(shù):種群數(shù)為180，最大代數(shù)為120，其他為系統(tǒng)的默認取值。

圖7 遺傳算法函數(shù)變化曲線

經(jīng)過算法計算，運行結果為: X={-1, 0.2768, 0.7105}，即料液比1∶15 (g/mL)、超聲時間112.76 min、乙醇體積分數(shù)71.05%，目標函數(shù)值為-35.0053。

考慮到實際操作的可行性, 將工藝條件改進為超聲溫度40 ℃，乙醇體積分數(shù)70%，超聲時間113 min，料液比1∶15 (g/mL)，鹽酸濃度0.3 mol/L。遺傳算法優(yōu)化的試驗結果與響應面結果大致相同，證明該提取工藝可行。

3 討論

通過響應面法分析，對設計變量進行探討：研究各因素對菊芋塊莖花青素提取量的影響，從而建立模型，進行相關分析，其模型顯著,說明該模型較為可信，可模擬不同因素情況下菊芋花青素的提取值。同時本研究發(fā)現(xiàn)，料液比為1∶15 (g/mL)、鹽酸濃度為0.3 mol/L，與張臘臘等[21]在紫薯花青素提取方面的研究結論基本相同；乙醇體積分數(shù)為70%，與熊穎等[22]對藍莓酒渣花青素提取的工藝優(yōu)化相同；超聲溫度為40 ℃，與蔡珊等[23]關于鳳仙花花青素的超聲輔助提取工藝的優(yōu)化因素大體一致；超聲時間為113 min，與許娟妮等[24]研究的紫馬鈴薯塊莖花青素的提取工藝相一致。

在單因素試驗分析中，超聲溫度40 ℃、乙醇體積分數(shù)50%、超聲時間90 min、料液比1∶15 (g/mL)、鹽酸濃度0.3 mol/L為菊芋花青素的最優(yōu)提取條件。綜上，提取菊芋花青素實際的最優(yōu)情況為：料液比1∶15 (g/mL)，超聲時間113 min，超聲溫度40 ℃，乙醇體積分數(shù)70%。菊芋花青素模型理論提取值為35 mg/g。經(jīng)過遺傳算法優(yōu)化，實際值為34.52 mg/g，與理論值基本相符，從而證明此模型合理可靠。

本試驗所優(yōu)化的菊芋塊莖花青素提取工藝較為可靠，可為菊芋塊莖表皮花青素的提取提供理論基礎和參考依據(jù)。