趙寧， 底婷婷， 王燕， 馮放， 齊聰， 胡雪晴， 王亞卓，朱昊玥， 楊丹陽， 張暇蔚， 李萍

健脾養(yǎng)血解毒方抑制咪喹莫特誘導的銀屑病樣皮損模型的炎癥細胞浸潤*

趙寧， 底婷婷， 王燕， 馮放， 齊聰， 胡雪晴， 王亞卓，朱昊玥， 楊丹陽， 張暇蔚， 李萍△

（首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京市中醫(yī)藥研究所，銀屑病中醫(yī)臨床基礎研究北京市重點實驗室，北京 100010）

觀察健脾養(yǎng)血解毒方對咪喹莫特（IMQ）誘導的銀屑病樣小鼠皮損模型的作用，并探討其機制。將BALB/c小鼠隨機分為正常對照組、模型組、甲氨蝶呤組及高、中、低劑量健脾養(yǎng)血解毒方組，采用背部涂抹IMQ的方法誘導小鼠銀屑病樣皮損模型。期間對皮損拍照并進行皮損嚴重程度指數(shù)（PASI）評分；HE染色觀察皮膚病理學改變；免疫熒光染色法檢測表皮Ki67的表達及Ly-6G+中性粒細胞的浸潤；免疫組化法檢測CD3+T淋巴細胞、CD11b+骨髓單核細胞和Ly-6C+巨噬細胞的浸潤；Western blot法檢測MAPK家族蛋白（p38 MAPK、ERK1/2、p-p38 MAPK和p-ERK1/2）的水平。與模型組相比，健脾養(yǎng)血解毒方可減輕IMQ誘導的小鼠銀屑病樣皮損，降低PASI評分和表皮層厚度，減少表皮層Ki67的異常表達及CD3+T淋巴細胞、Ly-6C+巨噬細胞和Ly-6G+中性粒細胞的浸潤，顯著降低皮損中p-p38 MAPK蛋白水平。健脾養(yǎng)血解毒方可能通過抑制CD3+T淋巴細胞、Ly-6G+中性粒細胞和Ly-6C+單核巨噬細胞在表皮中的浸潤，減少炎癥因子的大量釋放，降低角質(zhì)形成細胞過度增殖的誘導因素，從而減輕銀屑病樣增生肥厚的皮損。這表明健脾養(yǎng)血解毒方對炎癥細胞浸潤的抑制作用可能是其治療銀屑病的機制之一。

健脾養(yǎng)血解毒方；銀屑病；中性粒細胞；巨噬細胞

銀屑?。╬soriasis）是一種慢性炎癥性皮膚病，其組織學特征包括表皮角質(zhì)細胞過度增殖，角化過度伴角化不全，毛細血管新生，真皮中性粒細胞、樹突狀細胞、單核巨噬細胞、T淋巴細胞浸潤等。咪喹莫特（imiquimod， IMQ）是Toll樣受體7（Toll-like receptor 7， TLR7）和TLR8的激動劑，能夠激活樹突狀細胞等抗原提呈細胞，從而使T細胞活化和分化，分泌大量炎癥細胞因子，誘導小鼠皮膚出現(xiàn)表皮增殖、免疫細胞浸潤、鱗屑等類似銀屑病的病理變化。健脾養(yǎng)血解毒方（Jianpi-Yangxue-Jiedu decoction， JYJD）是臨床治療銀屑病的有效方劑。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，JYJD能夠顯著緩解小鼠銀屑病樣皮損表現(xiàn)，調(diào)節(jié)Treg/Th17軸免疫平衡［1］。本研究在此基礎上觀察了JYJD在銀屑病發(fā)病的固有免疫階段對中性粒細胞、單核巨噬細胞等炎癥細胞浸潤的作用，并揭示其可能的作用機制，作為臨床應用的理論依據(jù)。

材料和方法

1　動物

SPF級雄性BALB/c小鼠，體重18～20 g，6～8周齡，由北京華阜康生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證編號SCXK（京）2019-0008。實驗經(jīng)北京市中醫(yī)研究所實驗動物管理委員會批準，倫理審查號：2021020202。

2　藥物與試劑

甲氨蝶呤（methotrexate， MTX）片購自上海上藥信誼藥廠有限公司；IMQ乳膏為四川明欣藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)；JYJD（由茯苓、白術(shù)、柴胡、白芍、陳皮、當歸、生地黃、丹參、雞血藤、麥冬、玄參、土茯苓和白花蛇舌草組成）中藥材來源于首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房，以常規(guī)煎服法制備水煎劑，并按照成人（60 kg）劑量換算成小鼠灌胃用量，以臨床等藥量為中劑量，濃縮1倍為高劑量，稀釋1倍為低劑量。DAB顯色液和山羊血清工作液均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Ki67、Ly-6C、Ly-6G和CD11b抗體購自Cell Signaling Technology。

3　方法

3.1分組、造模及給藥參考van der Fits等［2］小鼠銀屑病樣模型制備方法造模。依據(jù)隨機數(shù)字表法，將小鼠隨機分為空白對照（control， Ctrl）組、模型組（IMQ組）、MTX組、高劑量JYJD（high-dose JYJD， JYJD-H）組、中劑量JYJD（middle-dose JYJD， JYJD-M）組和低劑量JYJD（low-dose JYJD， JYJD-L）組，每組6只。造模同時灌胃給藥，MTX組給予MTX溶液（1 mg/kg，生理鹽水溶解），JYJD各劑量組給予相應JYJD水煎劑，Ctrl和IMQ組給予生理鹽水，每天1次，每次0.2 mL。

3.2小鼠銀屑病樣皮損表現(xiàn)及嚴重程度評分每日對實驗小鼠皮損進行拍照，根據(jù)PASI評分標準，鱗屑、浸潤和紅斑按0～4分評價：0分=無；1分=輕微；2分=中度；3分=重度；4分=極嚴重。每日記錄統(tǒng)計分析各組小鼠鱗屑、浸潤和紅斑分值，將三者分值相加計算總分，繪制PASI評分趨勢圖，動態(tài)觀察小鼠皮損的變化情況。

3.3蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）染色觀察小鼠皮損組織形態(tài)學改變每組小鼠脫頸處死后，剪取相對應皮損處組織，固定于多聚甲醛中，經(jīng)石蠟包埋、切片、脫蠟水化、HE染色、脫水、封片，顯微鏡下觀察并拍照。每個標本選4張染色切片觀察組織病理學改變，并在20及40倍物鏡下拍照，對40倍物鏡下圖片采用ZEN圖像分析系統(tǒng)測量表皮厚度。

3.4免疫組化法檢測小鼠皮損組織CD3+、Ki67+、CD11b+、Ly-6C+和Ly-6G+細胞浸潤情況每組小鼠脫頸處死后，剪取相對應皮損處組織，固定于4%多聚甲醛中，經(jīng)石蠟切片，脫蠟水化，檸檬酸緩沖液高溫高壓進行抗原修復，封閉，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗孵育，DAB顯色，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并拍照，并計算陽性細胞數(shù)及平均吸光度。

3.5Western blot檢測小鼠皮損組織p38和ERK蛋白的表達采用常規(guī)方法提取皮膚樣本的總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)變性、電泳、電轉(zhuǎn)后，使用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，Ⅰ抗４℃孵育過夜，Ⅱ抗室溫搖床避光孵育1 h，掃膜獲得目的蛋白條帶并進行灰度分析。

4　統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0及GraphPad Prism 9.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK-檢驗。以<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1　JYJD改善銀屑病樣小鼠皮損表現(xiàn)

Ctrl組小鼠皮膚光滑，呈淡粉色；與Ctrl組相比，IMQ組小鼠在第4天背部皮膚出現(xiàn)紅斑、鱗屑、表皮增厚及基底潮紅，第7天皮損增厚明顯，出現(xiàn)褶皺，上覆鱗屑增多，出現(xiàn)片狀紅斑；JYJD各劑量組小鼠皮損出現(xiàn)時間略晚于IMQ組，且同IMQ組相比，紅斑面積減小，鱗屑變薄，浸潤減輕，與MTX組皮損相似，PASI評分也呈現(xiàn)上述趨勢，見圖1。

Figure 1.　Effect of Jianpiyangxue-Jiedu decoction （JYJD） on the skin lesions of psoriatic mice. Mean±SD. n=6.

2　JYJD減輕銀屑病小鼠模型表皮厚度

HE染色結(jié)果顯示，Ctrl組小鼠表皮層較薄，炎癥細胞浸潤少；IMQ組小鼠表皮明顯增厚（<0.01），角化不全及角化過度增加，大量淋巴細胞浸潤，出現(xiàn)類似銀屑病樣皮損改變；與IMQ組相比，JYJD各劑量組小鼠表皮變?。?0.01），角化過度及角化不全減少，炎癥細胞浸潤減輕，其中以JYJD-H組對表皮炎癥性增殖的抑制效果最好，見圖2。

Figure 2.　Pathological changes of skin lesions and measurement of epidermal thickness in mice （HE staining， scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=6. ##P<0.01 vs Ctrl group； **P<0.01 vs IMQ group.

3　JYJD抑制銀屑病小鼠模型角質(zhì)形成細胞的增殖

免疫熒光染色結(jié)果顯示，Ctrl組表皮層中存在少量Ki67+細胞；與Ctrl組相比，IMQ組Ki67+細胞數(shù)量顯著增加（<0.01），位于基底層棘層，呈多層分布；與IMQ組相比，JYJD各劑量組Ki67+細胞數(shù)量顯著減少（<0.01），且呈單層分布，同MTX對表皮增殖的抑制效果類似，其中以JYJD-H組效果最好，見圖3。

Figure 3.　Expression of Ki67 in mouse epidermis （immunofluorescence staining， scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=6. ##P<0.01 vs Ctrl group； **P<0.01 vs IMQ group.

4　JYJD抑制銀屑病小鼠模型皮損中CD3+細胞的浸潤

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，Ctrl組小鼠真皮層CD3+細胞數(shù)量較少；與Ctrl組相比，IMQ組小鼠CD3+細胞數(shù)量顯著增加（<0.01），真皮及表皮中均有分布；與IMQ組相比，MTX組及JYJD各劑量組真皮層CD3+細胞數(shù)量顯著減少（<0.01），見圖4。

Figure 4.　Expression of CD3 in skin lesions of mice （immunohistochemical staining， scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=6. ##P<0.01 vs Ctrl group； **P<0.01 vs IMQ group.

5　JYJD不抑制銀屑病小鼠模型皮損中CD11b+細胞的浸潤

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，CD11b在Ctrl組中幾乎不表達；與Ctrl組相比，IMQ組小鼠表皮中存在CD11b少量表達，真皮中主要表達在炎癥細胞浸潤處（<0.01）；MTX組和JYJD各劑量組較IMQ組表達量略有減少，但差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖5。

Figure 5.　Expression of CD11b in skin lesions of mice （immunohistochemical staining， scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=6. ##P<0.01 vs Ctrl group.

6　JYJD抑制銀屑病小鼠模型皮損中Ly-6C+和Ly-6G+細胞的浸潤

免疫熒光和免疫組織化學染色結(jié)果顯示，Ctrl組Ly-6G和Ly-6C幾乎不表達；與Ctrl組比較，IMQ組Ly-6G和Ly-6C表達量顯著增加（<0.01），Ly-6C主要分布在表皮基底層，在真皮中有少量分布，Ly-6G主要表達在真皮層；與IMQ組相比，JYJD各劑量組Ly-6G和Ly-6C的表達量顯著減少（<0.01），與MTX對中性粒細胞和巨噬細胞的抑制效果類似，其中JYJD-H組對Ly-6G+中性粒細胞的作用最為明顯，見圖6、7。

Figure 6.　Expression of LY-6C in skin lesions of mice （immunofluorescence staining， scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=6. ##P<0.01 vs Ctrl group； **P<0.01 vs IMQ group.

Figure 7.　Expression of LY-6G in skin lesions of mice （immunohistochemical staining， scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=6. ##P<0.01 vs Ctrl group； *P<0.05， **P<0.01 vs IMQ group.

7　JYJD抑制銀屑病小鼠模型皮損中p38和ERK蛋白磷酸化

Western blot結(jié)果顯示，與Ctrl組相比，IMQ組p38蛋白的磷酸化水平顯著升高（<0.01），ERK蛋白的磷酸化水平有升高趨勢，但差異未見統(tǒng)計學顯著性；與IMQ組相比，JYJD-H組p38蛋白的磷酸化水平顯著降低（<0.01），與MTX組接近，ERK蛋白的磷酸化水平有所降低，但差異未見統(tǒng)計學顯著性，見圖8。

Figure 8.　Expression of p38 and ERK pathway proteins in mouse skin lesions. Mean±SD. n=4. ##P<0.01 vs Ctrl group； **P<0.01 vs IMQ group.

討論

銀屑病是一種遺傳與環(huán)境共同作用誘發(fā)的由免疫介導的慢性、復發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病，典型臨床表現(xiàn)為鱗屑性紅斑或斑塊，無傳染性，治療困難，常罹患終身［3］?，F(xiàn)代醫(yī)學認為銀屑病是由Th17細胞為主的炎癥細胞及相關(guān)細胞因子與角質(zhì)形成細胞間相互作用誘導并維持的［4-5］。然而，中性粒細胞在真皮層大量浸潤，并進一步被趨化遷移到表皮形成Munro微膿瘍，是銀屑病早期的典型病理表現(xiàn)之一［6］。巨噬細胞作為一種關(guān)鍵的天然免疫細胞，在銀屑病皮損中大量活化及聚集，且激活后的巨噬細胞可獨立于T淋巴細胞誘導銀屑病樣皮損的產(chǎn)生，在銀屑病發(fā)病的過程中發(fā)揮著重要的作用［7］。

JYJD對脾虛型銀屑病患者的療效顯著，在前期研究中發(fā)現(xiàn)，脾虛-銀屑病樣小鼠模型外周血中單核細胞趨化蛋白1、單核細胞趨化蛋白3、巨噬細胞炎癥蛋白1α、巨噬細胞炎癥蛋白1β、RANTES、IP-10（即CXCL10）、生長相關(guān)癌基因α等多種趨化因子的含量增加，這些趨化因子能夠趨化單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、活化的T細胞等，促使銀屑病小鼠皮損加重［8-12］。JYJD能夠顯著抑制這些炎癥細胞趨化因子的表達，提示JYJD可能通過抑制單核巨噬細胞和中性粒細胞趨化因子的水平，抑制單核巨噬細胞和中性粒細胞向銀屑病皮損處的遷移和浸潤，減少炎癥細胞因子的釋放，降低T淋巴細胞的活化水平，起到治療銀屑病的作用。

本研究表明，JYJD能夠顯著減輕IMQ誘導的銀屑病樣小鼠的皮損表現(xiàn)，對角質(zhì)形成細胞的增殖及CD3+T細胞的浸潤具有明顯的抑制作用?；谛∈笸庵苎汹吇蜃铀降奶崾?，本實驗檢測了銀屑病小鼠皮損中單核巨噬細胞及中性粒細胞的浸潤情況。CD11b在骨髓系細胞中表達，通常用作骨髓系細胞的一個標志物，如中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞等［13］。JYJD不抑制CD11b+細胞在銀屑病皮損中的浸潤。Ly-6蛋白是造血細胞上被廣泛應用的標志物，在不同的發(fā)育階段表達于部分免疫細胞，如T細胞、B細胞、單核細胞、粒細胞和巨噬細胞［14］。Ly-6G是小鼠中性粒細胞的標志物，Ly-6C是小鼠巨噬細胞的標志物。本次實驗表明，IMQ組Ly-6C+巨噬細胞聚集在表皮下，數(shù)量增多明顯，JYJD能夠顯著抑制巨噬細胞在表皮下的聚集，對巨噬細胞在銀屑病皮損中的浸潤具有明顯的抑制作用。Ly-6G+中性粒細胞在IMQ組的表皮及真皮中大量存在，同時，在小鼠皮損鱗屑中也檢測到了中性粒細胞標志物的表達。JYJD能夠抑制中性粒細胞在真皮中的浸潤，同時，小鼠表皮層中中性粒細胞浸潤減少，表明JYJD對中性粒細胞向表皮的遷移可能具有抑制作用。絲裂原活化蛋白激酶信號通路（mitogen-activated protein kinase， MAPK）參與細胞分化、增殖、凋亡和免疫調(diào)節(jié)，p38 MAPK和ERK1/2是MAPK的兩條亞通路［15］。在銀屑病中p38介導T細胞向Th1、Th2方向分化，ERK有助于角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生趨化因子，吸引炎癥細胞聚集，放大炎癥反應。JYJD能夠有效抑制p38蛋白的磷酸化，達到治療銀屑病的目的。

綜上所述，JYJD對中性粒細胞和巨噬細胞在皮損中的聚集具有顯著的抑制作用，該作用可能與抑制p38通路有關(guān)，這可能是JYJD減輕銀屑病皮損的有效機制。

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Jianpi-Yangxue-Jiedu decoction inhibits inflammatory infiltration in the model of psoriasis induced by imiquimod

ZHAO Ning， DI Ting-ting， WANG Yan， FENG Fang， QI Cong， HU Xue-qing， WANG Ya-zhuo， ZHU Hao-yue， YANG Dan-yang， ZHANG Xia-wei， LI Ping△

（，，，，100010，）

To observe the effect of Jianpi-Yangxue-Jiedu decoction on the mouse model of psoriasis induced by imiquimod （IMQ）， and to explore its mechanism.BALB/c mice were randomly divided into control group， model group （IMQ group）， methotrexate group， and high-， middle- and low-dose Jianpi-Yangxue-Jiedu decoction groups. The mouse model of psoriasis-like lesion was induced by smearing IMQ on the back. Skin lesions were monitored daily using psoriasis area and severity index （PASI）， and the dermatopathological changes were observed by HE staining. The expression of Ki67 in epidermis and the infiltration of Ly-6G+neutrophils were detected by immunofluorescence staining， and the infiltration of CD3+T lymphocytes， CD11b+bone marrow mononuclear cells and Ly-6C+macrophages was detected by immunohistochemistry. The levels of MAPK family proteins （p38 MAPK， ERK1/2， p-p38 MAPK and p-ERK1/2） were detected by Western blot.Compared with model group， Jianpi-Yangxue-Jiedu decoction attenuated the psoriasis-like lesions induced by IMQ， reduced the PASI score and the thickness of epidermis， and decreased the abnormal expression of Ki67 in epidermis and the infiltration of CD3+T lymphocytes， Ly-6C+macrophages and Ly-6G+neutrophils. Jianpi-Yangxue-Jiedu decoction also decreased the protein level of p-p38 MAPK in the lesions.Jianpi-Yangxue-Jiedu decoction attenuates the skin lesions of psoriasis-like hypertrophy in mice by inhibiting the infiltration of inflammatory cells.

Jianpi-Yangxue-Jiedu decoction； Psoriasis； Neutrophils； Macrophages

1000-4718（2022）09-1618-07

2022-04-07

2022-06-06

010-52176679； E-mail： liping411@126.com

R275； R751； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.09.011

［基金項目］北京市自然科學基金面上項目（No. 7212165）；國家自然科學基金青年項目（No. 81904199）

（責任編輯：林白霜，羅森）