鄧欣， 孟達， 吳靜宜， 姜丙通， 張雅瓊， 趙毅， 車彥云

余甘子總酚對動脈粥樣硬化-/-小鼠肝臟保護作用機制的研究*

鄧欣， 孟達， 吳靜宜， 姜丙通， 張雅瓊， 趙毅， 車彥云△

（云南省高校藥食同源養(yǎng)生產品工程研究中心，云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500）

研究余甘子總酚對載脂蛋白E基因敲除（-/-）動脈粥樣硬化模型小鼠的肝臟保護作用，初步探討其作用機制。建立高脂飲食誘導的-/-小鼠動脈粥樣硬化模型，給予余甘子總酚灌胃8周后，酶聯免疫法檢測小鼠血清中天冬氨酸轉氨酶（AST）和丙氨酸轉氨酶（ALT）水平；觀察小鼠肝臟病理模型切片；酶聯免疫法檢測小鼠肝臟組織勻漿中的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、白細胞介素6（IL-6）、IL-1β和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平；Western blot法檢測小鼠肝臟組織相關蛋白的表達。余甘子總酚干預可降低-/-小鼠血清中AST和ALT水平（0.05），減緩小鼠肝臟脂肪性病變及炎癥細胞浸潤現象；同時，余甘子總酚可顯著降低肝臟組織勻漿中TC、TG和LDL-C水平，提高HDL-C水平（0.05），顯著降低炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α含量（0.05）；此外，余甘子總酚還可顯著升高模型小鼠肝臟組織ATP結合盒轉運體A1（ABCA1）蛋白水平（0.05），降低小鼠肝臟組織清道夫受體CD36和類固醇受體RNA激活物1（SRA1），以及Toll樣受體4（TLR4）和核因子κB（NF-κB） P65蛋白表達水平（0.05）。余甘子總酚可減少肝臟內膽固醇蓄積和炎癥因子的釋放，從而減輕動脈粥樣硬化小鼠肝臟脂肪性病變和炎癥反應。

余甘子總酚；動脈粥樣硬化；肝；脂質代謝；炎癥

動脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）是一種發(fā)病機制復雜的慢性疾病，可誘發(fā)一系列心腦血管疾病，嚴重威脅人類生命安全［1-4］。研究發(fā)現AS發(fā)病機制與脂質代謝紊亂和炎癥反應密切相關［5-11］。肝臟在脂質代謝及炎癥反應中發(fā)揮重要作用，肝臟作為體內脂質代謝的重要場所之一，過多的脂質累積在肝臟，將引起肝臟細胞對脂質過度攝取及合成，當脂肪的合成速度大于其轉運速度及氧化消耗后，會使肝臟產生脂肪性病變。同時，肝臟內堆積的大量游離脂肪酸及其他脂類代謝中間產物，將會進一步嚴重損傷肝臟細胞的正常功能，從而誘發(fā)一系列炎癥反應、肝臟纖維化，病程加重后會致使肝臟細胞的壞死和凋亡。肝臟損傷后，體內缺乏正常脂質代謝，將會加速AS病變進程［12-14］。

余甘子為大戟科葉下珠屬植物余甘子（L.）成熟干燥的果實，具有清熱涼血，消食健胃，生津止咳的功效［15］。余甘子作為藥食同源的中藥材之一，在我國資源豐富且民間應用歷史悠久，常用于治療血熱血瘀，消化不良，腹脹，咳嗽，喉痛，口干等［16-17］。現代藥理研究發(fā)現，余甘子提取物具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤、抗炎和保肝等生物活性［18-21］。臨床研究表明，余甘子提取物具有明顯的抗AS作用［22-23］。其中，余甘子總酚（total phenol fromL.， PE）中的鞣質類成分對肝臟有較好的保護作用，可減緩非酒精性脂肪肝組織損傷及其誘發(fā)的炎癥［24-30］。本實驗擬觀察PE對高脂飲食誘導的載脂蛋白E（apolipoprotein E，）基因敲除（-/-）小鼠AS模型肝臟脂肪性病變和炎癥反應的作用，并初步探討其機制。

材料和方法

1　材料與試劑

SPF級-/-雄性小鼠58只（體重18～22 g），SPF級C57小鼠18只（體重18～22 g），均由昆明楚商科技有限公司提供，生產許可證號為SCXK（湘）2019-0004。

余甘子（2020年購于云南省楚雄州），由云南中醫(yī)藥大學中藥學院饒高雄教授鑒定為大戟科葉下珠屬植物余甘子成熟干燥果實，其憑證標本保存于云南省高校藥食同源養(yǎng)生產品工程研究中心；高脂飼料購于昆明楚商科技有限公司（其含有脂肪21%，膽固醇0.15%）；阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司）。色譜級乙腈和甲醇（Fisher）；單體對照品沒食子酸（gallic acid）、鞣花酸（ellagic acid）、柯里拉京（corilagin）、老鸛草素（geraniin）、紫云英苷（astragalin）、沒食子酸甲酯（methyl gallate）、金絲桃苷（hyperoside）和沒食子酸乙酯（ethyl gallate）均購自國藥集團化學試劑有限公司（純度≥98.0%）；D-101大孔樹脂（青島海洋化工廠）；純水為Milli-Q系統(tǒng)純化水；其他試劑均為分析純。

天冬氨酸轉氨酶（asprtate transaminase， AST）、丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、總膽固醇（total cholesterol， TC）、甘油三酯（triglyceride， TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol， LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol， HDL-C）試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供；小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α） ELISA試劑盒、小鼠白細胞介素6（interleukin-6， IL-6） ELISA試劑盒和小鼠IL-1β ELISA試劑盒均由聯科生物技術股份有限公司提供；CD36抗體、P65抗體、GAPDH抗體和山羊抗兔IgG抗體均購自武漢三鷹生物技術有限公司；ATP結合盒轉運體A1（ATP binding cassette transporter A1， ABCA1）抗體購自Cell Signaling Technology；Toll樣受體4（Toll-like receptor 4， TLR4）和類固醇受體RNA激活物1（steroid receptor RNA activator 1， SRA1）抗體購自Proteintech；β-actin抗體購自北京中杉金橋公司。

2　儀器

色譜柱：Shim-Pack GIST C18（2.1 mm × 50 mm，2 μm）；超高效液相色譜三重四極桿串聯質譜儀，型號為LCMS-8050 （SHIMADZU）。

3　實驗方法

3.1PE的制備及其含量測定

3.1.1PE的制備新鮮余甘子切片，采用真空冷凍干燥器于-40 ℃下預冷15 min，然后于-25 ℃、50 Pa下凍干，得到含水量8%的干燥品；將干燥品全部投料于低溫超微粉碎機中，設置-10 ℃條件下進行超微粉碎，收集粉末進行400目過篩，后得到了黃綠色的余甘子粉末。所得余甘子粉末，加入5倍量的50%乙醇超聲提取3次，收集上清液合并，經減壓回收乙醇后得粗提物，再烘干。烘干后的粗提物應用D-101型大孔樹脂洗脫，收集70%乙醇洗脫物，經MCI純化后，得PE提取物。供試品和對照品的制備：供試品和對照品用甲醇充分溶解，稀釋至50 mg/L，過0.22 μm有機微孔濾膜即得，采用超高效液相色譜-高分辨飛行時間質譜聯用技術（UPLC-Q-TOF-MS/MS）分析。

3.1.2UPLC-Q-TOF-MS/MS分析色譜柱：Shim-Pack GIST C18（2.1 mm × 50 mm，2 μm）；柱溫40 ℃；流動相A為超純水，流動相B為色譜級甲醇溶液；洗脫程序：0～1 min：20% B； 1～5 min： 20%～80% B； 5～8 min： 80% B；進樣量10 μL；流速0.3 mL/min。電噴霧離子源；掃描方式：負離子模式；正離子模式；MRM模式；離子源溫度150 ℃；毛細管電壓2.1 kV；錐孔電壓40 V；脫溶劑氣流速（N2） 800 L/h；脫溶劑氣溫度400 ℃；錐孔反吹氣流速（N2） 150 L/h；碰撞氬氣流速（Ar）0.13 mL/min；質量掃描范圍m/z 100～1 200。

3.2高脂飲食誘導-/-小鼠AS模型建立飼養(yǎng)環(huán)境：室內溫度（24±2） ℃，室內相對濕度（45±3）%，保持光照每天12 h。

雄性健康的-/-小鼠8只，雄性健康的C57小鼠8只，經專業(yè)人員體檢后飼養(yǎng)于實驗專用鼠籠，喂食標準飼料，正常飲水。適應環(huán)境喂養(yǎng)一周后，稱重記錄，C57小鼠作為正常組，-/-小鼠作為模型組，正常組繼續(xù)用正常鼠料飼養(yǎng)，模型組給予特制的高脂飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)8周后處死小鼠，完整分離受試的整根胸主動脈，進行油紅O染色和Movat染色觀察病理情況。

3.3PE對-/-小鼠AS模型的肝保護作用

3.3.1實驗分組雄性健康的-/-小鼠50只，雄性健康的C57小鼠10只，經專業(yè)人員體檢后于合格飼養(yǎng)環(huán)境及條件下適應性飼養(yǎng)1周，后利用隨機數字表法將50只-/-小鼠分為AS模型組，陽性藥物阿托伐他汀鈣片（atorvastatin）組及低劑量PE（low-dose of PE，L-PE）、中劑量PE（medium-dose of PE，M-PE）、高劑量PE（high-dose of PE，H-PE）組等5個組（每組10只），另設10只C57小鼠作為正常對照（control）組。正常組和AS模型組分別給予0.02 mL/g體積的生理鹽水，陽性藥物（10 mg·kg-1·d-1）和低、中、高劑量（75，150，300 mg·kg-1·d-1）PE組連續(xù)按劑量給藥8周（均為灌胃給藥）。給藥期間，正常組投喂定量的標準鼠料，其余5組均投喂定量的高脂飼料。

3.3.2待測樣的制備及肝指標的測定6組小鼠均在第8周周末（最后一次給藥）后，開始禁食（但不禁水），12 h后，小鼠眼球取血，分離血清，檢測小鼠血清中AST和ALT水平；處死小鼠，無菌環(huán)境下打開胸腔，分離受試肝臟，左部整片肝葉用4%多聚甲醛固定，供組織病理學檢查，右部肝葉部分制備成10%肝組織勻漿，用于測定相應生化指標（血脂四項以及炎癥因子），其剩余部分制備肝臟總蛋白，用于相關蛋白含量的檢測。

4　統(tǒng)計學處理

本實驗數據均采用均數±標準差（mean±SD）來表示，采用IBM SPSS Statistics 26.0軟件進行數據分析處理后采用GraPhPad Prism 8.0軟件作圖。分析時，多組間比較利用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組間采用LSD檢驗或者Tukey檢驗進行比較。以0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1　PE的含量測定

在負離子掃描模式下PE的總離子流圖中，共檢測到8種與對照品峰形和出峰時間十分相近的化合物，見圖1及表1。各化合物的含量分別是37.853 8 mg/g（柯里拉京）、25.531 3 mg/g（老鸛草素）、19.127 3 mg/g（沒食子酸）、1.510 5 mg/g（沒食子酸甲酯）、0.000 4 mg/g（沒食子酸乙酯）、0.247 7 mg/g（紫云英苷）、0.264 9 mg/g（金絲桃苷）和0.002 7 mg/g（鞣花酸）。

Figure 1.　Total ion flow diagram of 8 chemical components.

表1　8種化學成分監(jiān)測離子對及質譜參數

2　ApoE-/-小鼠AS模型建立

在大體油紅O染色中：正常組主動脈血管上未觀察到明顯脂質沉積，模型組主動脈血管上可見脂質沉積；Movat染色中：正常組主動脈竇未見泡沫細胞堆積，模型組主動脈竇有大量的泡沫細胞堆積，說明-/-小鼠AS病理模型建立成功，見圖2。

Figure 2.　Histopathological changes of arteries in mice. Total aortic oil red O staining and Movat staining of aortic sinus were shown.

3　PE對ASApoE-/-小鼠的肝保護作用

3.1小鼠血清生化指標影響模型組小鼠血清中的AST和ALT含量較正常組顯著升高（0.01），給予陽性藥物干預后的小鼠血清AST和ALT含量較模型組顯著降低（0.01），給予中、高劑量PE干預后的小鼠血清AST和ALT含量水平也顯著降低（0.05），見表2。

表2　PE對小鼠血清中AST和ALT水平的影響

##<0.01control group；**<0.01AS group.

3.2小鼠肝臟病理情況模型組高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠，其肝細胞排列紊亂、體積增大，細胞內有空泡出現，部分核空泡和胞漿內空泡融合，變成了大的脂肪空泡，表明高脂飲食可使小鼠肝臟產生脂肪性病變，肝臟組織匯管區(qū)及膽管周圍出現了明顯的炎癥細胞浸潤現象，表明高脂飲食可能致使小鼠肝臟炎癥現象發(fā)生。給予陽性藥物或中、高劑量PE治療組，小鼠肝臟脂肪性病變和損傷性炎癥現象減輕，見圖3。

Figure 3.　Effect of PE on pathological changes of the liver in ApoE-/- mice （×200）.

3.3小鼠肝臟勻漿中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠，其肝臟中TC、TG和LDL-C含量較正常飼料飼養(yǎng)組顯著升高（0.05），而HDL-C含量較正常飼料飼養(yǎng)組顯著降低（0.01）。給予陽性藥物干預后的小鼠肝臟勻漿中TC、TG和LDL-C含量顯著降低（0.01），HDL-C含量極其顯著提高（0.01），給予中、高劑量PE干預后的小鼠肝臟勻漿中TC、TG和LDL-C含量也顯著降低（0.05），HDL-C的含量顯著提高（0.05），見圖4。

Figure 4.　Effect of PE on TC， TG， LDL-C and HDL-C levels in the liver of ApoE-/- mice. Mean±SD. n=10. #P<0.05， ##P<0.01 vs control group； *P<0.05， **P<0.01 vs AS group.

3.4小鼠肝臟勻漿中IL-6、IL-1β和TNF-α含量高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟勻漿中IL-6、IL-1β和TNF-α含量水平較正常飼料飼養(yǎng)組顯著升高（0.05）。給予陽性藥物干預后的小鼠肝臟勻漿中IL-6、IL-1β和TNF-α含量水平顯著降低（0.01），給予中、高劑量PE干預后的小鼠肝臟勻漿中IL-6、IL-1β和TNF-α含量水平也顯著降低（0.05），見圖5。

Figure 5.　Effect of PE on the levels of IL-6， IL-1β and TNF-α in the liver of ApoE-/- mice. Mean±SD. n=10. #P<0.05， ##P<0.01 vs control group； *P<0.05， **P<0.01 vs AS group.

3.5小鼠肝臟組織中相關蛋白表達水平

3.5.1小鼠肝臟組織中脂質代謝相關蛋白表達水平模型組小鼠肝臟組織ABCA1蛋白表達水平顯著降低（0.01），而CD36和SRA1蛋白表達水平顯著升高（0.01）；陽性藥物以及PE干預均顯著升高小鼠肝臟組織ABCA1蛋白表達水平（0.05），顯著降低小鼠肝臟組織CD36和SRA1蛋白表達水平（0.05），且呈劑量依賴性，見圖6。

Figure 6.　Effect of PE on lipid metabolism-related protein expression in the liver of ApoE-/- mice. Mean±SD. n=10. #P<0.05， ##P<0.01 vs control group； *P<0.05， **P<0.01 vs AS group.

3.5.2小鼠肝臟組織中炎癥相關蛋白表達水平模型組小鼠肝臟組織TLR4和NF-κB P65蛋白表達水平顯著升高（0.01）；而陽性藥物以及PE干預組小鼠肝臟組織TLR4和NF-κBP65蛋白表達水平均顯著降低（0.05），且成劑量依賴性，見圖7。

Figure 7.　Effect of PE on inflammation-related protein expression in the liver of ApoE-/- mice. Mean±SD. n=10. #P<0.05， ##P<0.01 vs control group； *P<0.05， **P<0.01 vs AS group.

討論

ApoE是一種多功能蛋白，且具有顯著的基因多態(tài)性，因其可直接影響脂蛋白的功能，故對人體脂質代謝有重要意義。近年來學者們常以ApoE小鼠模型作為研究預防或治療AS、糖尿病、神經退化性疾病等的病理模型［31-32］。本實驗通過高脂飼料喂養(yǎng)ApoE小鼠8周，成功獲得了ApoE小鼠AS模型，為研究的開展提供了前提條件。血清中ALT和AST含量水平的變化，常用來反映肝臟損傷的程度，AST活性增高，提示肝細胞線粒體受損傷；ALT活性增高，提示肝細胞膜破壞和細胞膜通透性增加［33-34］。本實驗結果顯示，PE中、高劑量組小鼠血清ALT和AST水平顯著低于模型組，且具有劑量依賴性，提示PE具有保護肝臟組織的作用。應用HE染色和測定肝臟組織勻漿TC、TG、LDL-C、HDL-C、IL-6、IL-1β和TNF-α含量水平進一步驗證，結果顯示，PE中、高劑量組小鼠肝臟脂肪性病變以及炎癥情況明顯減輕，肝臟組織勻漿中TC、TG和LDL-C含量顯著降低，HDL-C的含量顯著提高，同時，肝臟組織勻漿中炎癥因子指標IL-6、IL-1β和TNF-α含量水平也顯著降低，提示PE既改善了-/-小鼠肝臟脂質代謝，又抑制了肝損過程中的炎癥反應。本實驗模型組肝臟組織僅出現了脂肪病變以及炎癥反應，暫無壞死的情況發(fā)生，對于肝臟組織的進一步病理形態(tài)變化的研究，還需增加實驗時長進行觀察。

肝臟是膽固醇代謝的中心器官，研究發(fā)現［35-38］，膽固醇代謝紊亂可引起肝臟脂肪病變以及AS發(fā)生，而CD36、SRA1和ABCA1蛋白與膽固醇代謝密切相關，清道夫受體CD36和SRA1蛋白可調控巨噬細胞對膽固醇的吸收，ABCA1可促進細胞內游離膽固醇的外流。本實驗對CD36、SRA1和ABCA1蛋白水平分別進行檢測，發(fā)現PE可顯著降低小鼠肝臟組織CD36和SRA1蛋白表達水平，同時，還可顯著升高小鼠肝臟組織ABCA1蛋白表達水平，提示PE既可以抑制膽固醇吸收，又可以促進膽固醇進行逆向運轉排出。SRA1蛋白作為A族清道夫受體之一，是一個多功能受體，可以促進巨噬細胞對脂質的攝取。現代藥理研究發(fā)現［39-40］，SRA可誘導MyD88依賴的toll樣受體4信號通路的激活，并抑制TLR4依賴的IRF3激活。當TLR4信號通路被激活后，會誘導NF-κB通路的激活，NF-κB作為炎癥最重要的調節(jié)因子之一，被激活后，會導致炎癥的發(fā)生，加重AS進程［41-43］。本實驗中，僅檢測了NF-κB通路中的兩個代表性蛋白表達水平，其通路上下游的蛋白表達情況，有待進一步的實驗研究。

綜上所述，PE通過抑制膽固醇吸收和促進膽固醇進行逆向運轉排出，來緩解小鼠肝臟脂質代謝異常。同時，PE還可以通過下調TLR4和NF-κB P65蛋白水平，抑制肝臟的炎癥反應，提示余甘子對預防AS所致的肝臟損傷有一定的作用。

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Total phenols fromL. alleviate fatty deposition and inflammation in liver of atherosclerotic-/-mice

DENG Xin， MENG Da， WU Jing-yi， JIANG Bing-tong， ZHANG Ya-qiong， ZHAO Yi， CHE Yan-yun△

（，，650500，）

To study the liver protective effect and mechanism of total phenols fromL. （PE）in-/-atherosclerosis mice.The atherosclerosis-/-mice were induced by a high-fat diet for 8 weeks. The levels of aspartate transaminase （AST） and alanine aminotransferase （ALT） in serum of mice were detected by ELISA. Meanwhile， the pathological sections of liver of mice were observed. The levels of total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C）， high-density lipoprotein cholesterol （HDL-C）， interleukin-6 （IL-6）， IL-1β， and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in mouse liver tissue homogenate were measured by enzyme-linked immunoassay. The expression of related proteins in liver tissues of mice was detected by Western blot.Serum AST and ALT levels in-/-mice were decreased by PE intervention （0.05）.Lipid deposition and inflammatory factors were alleviated. The contents of TC， TG and LDL-C in liver homogenate were significantly decreased （0.05）， while the content of HDL-C was increased （0.05）. Meanwhile， the levels of IL-6， IL-1β and TNF-α were obviously suppressed by PE （0.05）. In addition， the protein level of ATP binding cassette transporter A1 （ABCA1） in liver tissue of mice was significantly increased （0.05）， while the levels of CD36 and steroid receptor RNA activator 1 （SRA1） in liver tissues were reduced. Moreover， the protein expression of Toll-like receptor 4 （TLR4） and nuclear factor-κB （NF-κB） P65 were decreased （0.05）.Treatment with PE reduces the accumulation of cholesterol and the release of inflammatory factors in the liver， thus attenuating the fatty deposition and inflammation in the liver of atherosclerotic mice.

Total phenols fromL.； Atherosclerosis； Liver； Lipid metabolism； Inflammation

1000-4718（2022）09-1608-10

2022-04-27

2022-07-13

18213538189； E-mail： checpu@163.com

R543.5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.09.010

［基金項目］云南省科技廳-云南中醫(yī)藥大學應用基礎聯合研究專項項目重點項目（No. 2019FF002-012）；云南省科技廳-云南中醫(yī)藥大學應用基礎聯合研究專項項目面上項目（No. 202101AZ070001-212）

（責任編輯：宋延君，余小慧）