施文標(biāo)， 金曉燕， 龐文洋， 王遠(yuǎn)帆， 汪正一， 張強(qiáng)

干擾lncRNA H19通過調(diào)控Notch信號(hào)通路增強(qiáng)耐順鉑乳腺癌細(xì)胞的藥物敏感性*

施文標(biāo)， 金曉燕， 龐文洋， 王遠(yuǎn)帆， 汪正一， 張強(qiáng)△

（臺(tái)州市立醫(yī)院乳腺外科，浙江 臺(tái)州 318000）

探究長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA， lncRNA） H19對(duì)乳腺癌細(xì)胞順鉑（cisplatin/cis-diamminodichloroplatinum， DDP）耐藥性的作用及其分子機(jī)制。構(gòu)建耐DDP人乳腺癌細(xì)胞株MCF7-Re；采用RT-qPCR檢測(cè)lncRNA H19在人正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF10A及人乳腺癌細(xì)胞株MCF7和MCF7-Re中的表達(dá)水平。構(gòu)建lncRNA H19干擾質(zhì)粒；采用CCK-8法檢測(cè)DDP處理后MCF7-Re細(xì)胞的活力；采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、ATP結(jié)合盒蛋白B亞家族成員1（ATP-binding cassette protein subfamily B member 1， ABCB1）、Notch1和發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1（hairy and enhancer of split 1， Hes1）的表達(dá)；構(gòu)建Notch1過表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證lncRNA H19的作用機(jī)制。lncRNA H19在MCF7-Re細(xì)胞中表達(dá)顯著增加。干擾H19在DDP處理后進(jìn)一步降低MCF7-Re細(xì)胞活力（<0.01），耐藥蛋白ABCB1表達(dá)顯著降低（<0.01），細(xì)胞凋亡率顯著升高（<0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少（<0.01），Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加（<0.01），并且Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白（Notch1和Hes1）的表達(dá)減少（<0.01）。轉(zhuǎn)染Notch1過表達(dá)質(zhì)粒后，干擾lncRNA H19表達(dá)的MCF7-Re細(xì)胞活力得到一定程度的上升（<0.01），耐藥蛋白ABCB1表達(dá)顯著增加（<0.01），細(xì)胞凋亡率顯著降低（<0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加（<0.01），Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著減少（<0.01）。干擾lncRNA H19通過抑制Notch信號(hào)通路抑制耐DDP乳腺癌細(xì)胞的增殖，并增強(qiáng)該細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19；乳腺癌；順鉑；耐藥性；Notch信號(hào)通路

乳腺癌是最常見的威脅生命的癌癥，也是女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因［1］。近數(shù)十年間，隨著對(duì)乳腺癌生物學(xué)的深入了解及現(xiàn)代醫(yī)療科技的進(jìn)步，通過手術(shù)、放射和藥物治療可緩解乳腺癌癥狀和延長(zhǎng)生存期［2］。然而，目前臨床治療中腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)的耐藥性大大降低了藥效并導(dǎo)致藥物治療失?。?-4］。順鉑（cisplatin/cis-diamminodichloroplatinum， DDP）是一種廣譜抗腫瘤藥物，是晚期乳腺癌患者常用的化療藥物之一，對(duì)包含乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥具有短期治療效果［5］，但是由于大多數(shù)乳腺癌對(duì)DDP存在的原發(fā)性耐藥或獲得性耐藥限制了其在臨床的運(yùn)用［6］。因此，研究提高DDP化療敏感性的機(jī)制對(duì)乳腺癌的治療非常重要。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA， lncRNA）在癌癥［7］、免疫［8］、炎癥［9］等許多生物學(xué)過程中具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的DDP耐藥和遷移［10］。lncRNA H19表達(dá)在耐多柔比星的乳腺癌細(xì)胞中顯著上調(diào)［11］。但目前l(fā)ncRNA H19對(duì)乳腺癌DDP耐藥性的影響未見報(bào)道。據(jù)報(bào)道，在大鼠脊髓損傷模型中，電針通過下調(diào)H19/EZH2軸抑制Notch信號(hào)通路，從而促進(jìn)大鼠恢復(fù)［12］。沉默人乳腺癌MCF7細(xì)胞可促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］。沉默通過Notch/Snail通路可部分恢復(fù)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株LoVo/5-FU對(duì)化療藥物的敏感性［14］。

因此，本研究通過構(gòu)建耐DDP的人乳腺癌細(xì)胞株MCF7-Re，初步探討lncRNA H19對(duì)乳腺癌DDP敏感性的影響及其分子機(jī)制，以期為進(jìn)一步研究對(duì)抗乳腺癌DDP耐藥性的治療手段提供理論參考。

材料和方法

1　主要儀器與試劑

人正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A（武漢普諾賽生命科技有限公司）；人乳腺癌細(xì)胞株MCF7（武漢普諾賽生命科技有限公司）；DDP（上海源葉生物科技有限公司；批號(hào)：S31072）；TUNEL染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司；批號(hào)：C1086）；CCK-8試劑盒（Biosharp；批號(hào)：BS350A）；TRIzol試劑和Lipofectamine? 2000（Invitrogen）；cDNA合成試劑盒（TaKaRa）；引物序列及siRNA-H19和siRNA-NC質(zhì)粒（上海吉康生物科技有限公司）；Bcl-2兔多克隆抗體（批號(hào)：ab196495）、Bax兔單克隆抗體（批號(hào)：ab32503）、cleaved caspase-3兔多克隆抗體（批號(hào)：ab32042）、Notch1兔單克隆抗體（批號(hào)：ab52627）、發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1（hairy and enhancer of split 1， Hes1）兔多克隆抗體（批號(hào)：ab71559）、β-actin兔多克隆抗體（批號(hào)：ab8227）和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG Ⅱ抗（批號(hào)：ab6721）均購自Abcam；ATP結(jié)合盒蛋白B亞家族成員1（ATP-binding cassette protein subfamily B member 1， ABCB1）兔單克隆抗體（Cell Signaling Technology；批號(hào)：13342）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）及轉(zhuǎn)移裝置（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司）；LAS400凝膠成像系統(tǒng)（GE）。

2　細(xì)胞培養(yǎng)、耐藥細(xì)胞構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MCF-10A和MCF7細(xì)胞。通過使用DDP干預(yù)構(gòu)建耐DDP的MCF7細(xì)胞（MCF7-Re細(xì)胞）。使用含1 μmol/L DDP的培養(yǎng)液來維持DDP抗性，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L。取10 mL細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h直至貼壁，首先加入0.5 μmol/L DDP孵育48 h，然后更換培養(yǎng)液。消化后，加入2.5 μmol/L DDP培養(yǎng)48 h。后續(xù)逐漸增加DDP濃度至5和10 μmol/L，得到耐受10 μmol/L DDP的MCF7-Re細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，使用Lipofectamine? 2000將siRNA-H19、siRNA-NC、Ov-NC或Ov-Notch1轉(zhuǎn)染至MCF7-Re細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)質(zhì)粒干擾水平。

3　主要方法

3.1RT-qPCR使用TRIzol試劑從各實(shí)驗(yàn)組MCF7-Re細(xì)胞中提取總RNA，使用cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用MiniOpticon real-time PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行PCR，以GAPDH為內(nèi)參照，檢測(cè)Notch1和lncRNA H19表達(dá)水平。Notch1的正向引物序列為5'-AGGCTCTGCCGACATCA-3'，反向引物序列為5'-AGGAAGGGGTGCTCTGG-3'；lncRNA H19的正向引物序列為5′-ATCGGTGCCTCAGCGTTCGG-3′，反向引物序列為5′-CTGTCCTCGCCGTCACACCG-3′；內(nèi)參照GAPDH的正向引物序列為5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，反向引物序列為5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'。

3.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF7及MCF7-Re細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔1.0×104個(gè)。細(xì)胞貼壁后，以不同劑量（0、2.5、5、10和20 μmol/L）的DDP處理24 h后加入10% CCK-8試劑，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。同時(shí)，在使用siRNA-H19或siRNA-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7-Re細(xì)胞后，以不同劑量（0、2.5、5、10和20 μmol/L）的DDP處理24 h，加入10% CCK-8試劑，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力。根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用20 μmol/L的DDP用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)

3.3TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF7-Re細(xì)胞，分為對(duì)照組、siRNA-NC組、siRNA-H19組、DDP組、DDP+siRNA-NC組和DDP+siRNA-H19組，取各組細(xì)胞進(jìn)行切片，使用二甲苯透明、梯度乙醇脫蠟，將各組細(xì)胞切片用蛋白酶處理20 min，之后用TUNEL反應(yīng)混合液于37 ℃避光孵育1 h，凋亡細(xì)胞會(huì)被染成綠色，在熒光顯微鏡下觀察（×400）。凋亡率（%）=陽性染色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%

3.4Western blot取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF7-Re細(xì)胞，分為對(duì)照組、siRNA-NC組、siRNA-H19組、DDP組、DDP+siRNA-NC組和DDP+siRNA-H19組。將接種細(xì)胞的6孔板置于冰上，PBS漂洗后加入裂解液提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。煮沸變性蛋白樣品，以每孔50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，70 V電壓下跑至分界面時(shí)，變換電壓為110 V，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h，5%牛血清白蛋白封閉2 h，加入Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、ABCB1、Notch1、Hes1和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜后加入Ⅱ抗，室溫孵育1 h，取出條帶，加入ECL顯影液上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果用ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值定量分析。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8.1軟件處理數(shù)據(jù)。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及LSD-檢驗(yàn)。以<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　lncRNA H19在耐藥的乳腺癌細(xì)胞株中表達(dá)增加

圖1A顯示不同劑量的DDP處理MCF7及MCF7-Re細(xì)胞后細(xì)胞活力的變化。隨著DDP劑量的增加，MCF7及MCF7-Re細(xì)胞活力逐漸降低，MCF7細(xì)胞較MCF7-Re細(xì)胞活力下降更明顯（<0.01），說明耐DDP乳腺癌細(xì)胞株MCF7-Re構(gòu)建成功。圖1B顯示，與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A相比，乳腺癌細(xì)胞MCF7中l(wèi)ncRNA H19表達(dá)水平顯著上調(diào)（<0.01），表明lncRNA H19在乳腺癌中的可能發(fā)揮促癌作用；與MCF-10A和MCF7細(xì)胞相比，lncRNA H19的表達(dá)水平在MCF7-Re細(xì)胞中顯著增加（<0.01），說明lncRNA H19可能在乳腺癌耐藥過程中發(fā)揮作用。

Figure 1. Expression of lncRNA H19 in cisplatin （DDP）-resistant breast cancer cells. A： the viability of MCF7 and MCF7-Re cells after DDP treatment was detected by CCK-8 assay； B： the expression of lncRNA H19 in MCF-10A， MCF7 and MCF7-Re cells was detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs MCF7； ##P<0.01 vs MCF10A.

2　干擾lncRNA H19可增強(qiáng)MCF7-Re細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性

圖2A顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-H19組MCF7-Re細(xì)胞中H19的表達(dá)水平顯著降低（<0.01），說明干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖2B顯示，不同劑量的DDP處理后，與siRNA-NC組相比，siRNA-H19組細(xì)胞活力進(jìn)一步降低（<0.01）。圖2C～E顯示，與siRNA-NC相比，siRNA-H19組細(xì)胞凋亡率顯著提高（<0.01），Bax和cleaved caspase-3表達(dá)顯著增加，Bcl-2和ABCB1表達(dá)顯著減少（<0.01）；與DDP+siRNA-NC組相比，DDP+siRNA-H19組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.001），Bax和cleaved caspase-3表達(dá)顯著增加，Bcl-2和ABCB1表達(dá)顯著減少（<0.01）。上述結(jié)果表明，干擾lncRNA H19可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。

Figure 2. Effect of lncRNA H19 knockdown on the sensitivity of breast cancer cells to cisplatin （DDP）. A： the knockdown effect of siRNA-H19 in MCF7-Re cells was detected by RT-qPCR； B： the viability of MCF7-Re cells after DDP treatment was detected by CCK-8 assay； C： TUNEL staining was used to detect cell apoptosis； D： apoptosis-related proteins were detected by Western blot； E： drug resistance protein ABCB1 was detected by Western blot. The concentration of DDP in C， D and E was 20 μmol/L. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs siRNA-NC group； ##P<0.01 vs DDP+siRNA-NC group.

3　干擾lncRNA H19可抑制MCF7-Re細(xì)胞中的Notch信號(hào)通路

圖3顯示，與siRNA-NC相比，siRNA-H19組MCF7-Re細(xì)胞中Notch1和Hes1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（<0.01），說明干擾H19抑制了Notch信號(hào)通路。

Figure 3. The expression levels of Notch signaling pathway-related proteins in breast cancer cells after lncRNA H19 knockdown were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs siRNA-NC group.

4　干擾lncRNA H19通過抑制Notch信號(hào)通路增強(qiáng)MCF7-Re細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性

圖4A、B顯示，與Ov-NC組相比，Ov-Notch1組的Notch1表達(dá)增加，說明Notch1的過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖4C顯示，以不同劑量的DDP處理MCF7-Re細(xì)胞后，與siRNA-H19+Ov-NC相比，siRNA-H19+Ov-Notch1組細(xì)胞活力降低趨勢(shì)減緩（<0.01）。圖4D～F顯示，以20 μmol/L DDP處理MCF7-Re細(xì)胞后，與DDP+siRNA-H19+Ov-NC相比，DDP+siRNA-H19+Ov-Notch1組細(xì)胞凋亡率顯著降低（<0.01），Bax和cleaved caspase-3表達(dá)顯著減少，Bcl-2和ABCB1表達(dá)顯著增加（<0.01）。上述結(jié)果表明，干擾lncRNA H19可通過抑制Notch信號(hào)通路增強(qiáng)乳腺癌對(duì)DDP的敏感性。

Figure 4. Knockdown of lncRNA H19 enhanced the sensitivity of breast cancer cells to cisplatin （DDP） by inhibiting Notch signaling pathway. A and B： RT-qPCR and Western blot were used to detect the overexpression of Notch1； C： the viability of MCF7-Re cells after DDP treatment was detected by CCK-8 assay； D： TUNEL staining was used to detect cell apoptosis； E： apoptosis-related proteins were detected by Western blot； F： drug resistance protein ABCB1 was detected by Western blot. The concentration of DDP in D， E and F was 20 μmol/L. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs control or Ov-NC group； ##P<0.01 vs siRNA-H19+Ov-NC group； ▲▲P<0.01 vs DDP group； △△P<0.01 vs DDP+siRNA-H19+Ov-NC group.

討論

乳腺癌作為對(duì)女性健康危害嚴(yán)重的疾病之一，目前化療仍是治療乳腺癌的最有效方法，但臨床上經(jīng)常發(fā)生腫瘤多藥耐藥［15］。DDP耐藥是一個(gè)多因素的過程，乳腺癌患者的化療耐藥嚴(yán)重限制了治療效果，因此研究耐藥產(chǎn)生機(jī)制對(duì)乳腺癌的治療具有深遠(yuǎn)意義［16］。lncRNA是一類長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA。lncRNA H19被認(rèn)為是一種癌胚轉(zhuǎn)錄物，在幾種腫瘤中表達(dá)失調(diào)，導(dǎo)致惡性組織中l(wèi)ncRNA H19異常上調(diào)［17］。研究發(fā)現(xiàn)，敲減lncRNA H19通過調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞中的miR-130a-3p/SATB1抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［18］。

在本研究中，我們首先構(gòu)建了MCF7-Re耐藥細(xì)胞株，RT-qPCR結(jié)果表明lncRNA H19在MCF7-Re細(xì)胞中表達(dá)增加。接著構(gòu)建了lncRNA H19干擾質(zhì)粒siRNA-H19，干擾H19表達(dá)可加速DDP處理后的MCF7-Re細(xì)胞活力的降低，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。已知Bcl-2/Bax/cleaved caspase-3是凋亡相關(guān)蛋白，下調(diào)caspase-3和Bax以及上調(diào)Bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡［19］。Western blot結(jié)果表明，siRNA-H19降低了DDP處理后MCF7-Re細(xì)胞中Bcl-2蛋白水平并提高了Bax和cleaved caspase-3蛋白水平，說明敲減H19可抑制DDP處理后的MCF7-Re細(xì)胞凋亡。ABCB1是一種經(jīng)典的多藥耐藥蛋白，circRNA_103615沉默顯著降低了DDP對(duì)A549細(xì)胞的IC50，并降低了ABCB1的表達(dá)水平［20］。本研究中，siRNA-H19降低了MCF7-Re細(xì)胞中耐藥蛋白ABCB1的表達(dá)水平，表明敲減H19減輕了MCF7-Re細(xì)胞的DDP耐藥性，提高了細(xì)胞對(duì)DDP的化療敏感性。

Notch通路是一種高度保守的信號(hào)通路，在胚胎發(fā)育、器官成熟及腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［21］。研究表明，Notch1的抑制顯著下調(diào)MCAM表達(dá)，導(dǎo)致TNBC細(xì)胞對(duì)順鉑的化學(xué)耐藥性的逆轉(zhuǎn)［22］。Zhang等［23］報(bào)道，在乳腺癌細(xì)胞株MCF7中上調(diào)Notch1表達(dá)可誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞侵襲和遷移。因此我們推測(cè)抑制Notch1信號(hào)可能會(huì)降低乳腺癌細(xì)胞的DDP耐藥性。有研究表明，H19能夠激活Notch信號(hào)蛋白的表達(dá)［12］。本研究中，Western blot結(jié)果表明，siRNA-H19降低了MCF7-Re細(xì)胞中Notch1和Hes1蛋白的表達(dá)，說明干擾H19抑制Notch1信號(hào)通路。同時(shí)，構(gòu)建Notch1過表達(dá)質(zhì)粒激活Notch1信號(hào)，減緩了DDP處理后MCF7-Re細(xì)胞活力降低的趨勢(shì)，抑制了細(xì)胞凋亡，并且上調(diào)了耐藥蛋白ABCB1的表達(dá)。這表明過表達(dá)Notch1逆轉(zhuǎn)了干擾lncRNA H19對(duì)乳腺癌細(xì)胞耐藥的抑制作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)干擾lncRNA H19通過抑制Notch1信號(hào)通路進(jìn)一步降低DDP處理后的MCF7-Re細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減少耐藥蛋白ABCB1表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。目前本研究只局限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，而機(jī)體內(nèi)作用機(jī)制復(fù)雜，往往能反映真實(shí)情況，后續(xù)將繼續(xù)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。

［1］ Bray F， Ferlay J， Soerjomataram I， et al. Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries［J］. CA Cancer J Clin， 2018， 68（6）：394-424.

［2］ W?rmann B. Breast cancer： basics， screening， diagnostics and treatment［J］. Med Monatsschr Pharm， 2017， 40（2）：55-64.

［3］ Radecka B， Litwiniuk M. Breast cancer in young women［J］. Ginekol Pol， 2016， 87（9）：659-663.

［4］ Maruthanila VL， Elancheran R， Kunnumakkara AB， et al. Recent development of targeted approaches for the treatment of breast cancer［J］. Breast Cancer， 2017， 24（2）：191-219.

［5］ Makovec T. Cisplatin and beyond： molecular mechanisms of action and drug resistance development in cancer chemotherapy［J］. Radiol Oncol， 2019， 53（2）：148-158.

［6］ Chen X， Lu P， Wu Y， et al. MiRNAs-mediated cisplatin resistance in breast cancer ［J］. Tumour Biol， 2016， 37（10）：12905-12913.

［7］ Li J， Meng H， Bai Y， et al. Regulation of lncRNA and its role in cancer metastasis［J］. Oncol Res， 2016， 23（5）：205-217.

［8］ Robinson EK， Covarrubias S， Carpenter S. The how and why of lncRNA function： an innate immune perspective［J］. Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech， 2020， 1863（4）：194419.

［9］ Liao K， Xu J， Yang W， et al. The research progress of LncRNA involved in the regulation of inflammatory diseases［J］. Mol Immunol， 2018， 101：182-188.

［10］ Wu Y， Zhou Y， He J， et al. Long non-coding RNA H19 mediates ovarian cancer cell cisplatin-resistance and migration during EMT［J］. Int J Clin Exp Pathol， 2019， 12（7）：2506-2515.

［11］ Wang Y， Zhou P， Li P， et al. Long non-coding RNA H19 regulates proliferation and doxorubicin resistance in MCF-7 cells by targeting PARP1［J］. Bioengineered， 2020， 11（1）：536-546.

［12］ Geng X， Zou Y， Li S， et al. Electroacupuncture promotes the recovery of rats with spinal cord injury by suppressing the Notch signaling pathway via the H19/EZH2 axis［J］. Ann Transl Med， 2021， 9（10）：844.

［13］ 袁磊， 陳旭東， 范文娟， 等. 沉默基因促進(jìn)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞JNK1和p53磷酸化［J］. 中國(guó)病理生理雜志， 2013， 29（6）：1014-1019.

Yuan L， Chen XD， Fan WJ， et al. Silencinggene promotes phosphorylation of JNK1 and p53 in human breast cancer MCF-7 cells［J］. Chin J Pathophysiol， 2013， 29（6）：1014-1019.

［14］ 李霞， 馬超， 孔令偉， 等. EphA2調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥的初步研究［J］. 中國(guó)病理生理雜志， 2017， 33（12）：2188-2194.

Li X， Ma C， Kong LW， et al. A preliminary study on the regulation of drug resistance in colorectal cancer cells by EphA2［J］. Chin J Pathophysiol， 2017， 33（12）：2188-2194.

［15］ 黃果， 王佑權(quán)， 陳娟. miRNA-138-5p靶向抑制HIF-1α表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞順鉑耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制［J］. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2021， 47（2）：360-368.

Huang G， Wang YQ， Chen J. miRNA-138-5p targeted inhibition of HIF-1α expression reverses cisplatin resistance in breast cancer MCF-7 cells and its mechanism［J］. J Jilin Univ （Med Ed）， 2021， 47（2）：360-368.

［16］ Mi H， Wang X， Wang F， et al. SNHG15 contributes to cisplatin resistance in breast cancer through sponging miR-381［J］. Onco Targets Ther， 2020， 13：657-666.

［17］ Ghafouri-Fard S， Esmaeili M， Taheri M. H19 lncRNA： roles in tumorigenesis［J］. Biomed Pharmacother， 2020， 123：109774.

［18］ Zhong G， Lin Y， Wang X， et al. H19 knockdown suppresses proliferation and induces apoptosis by regulating miR-130a-3p/SATB1 in breast cancer cells［J］. Onco Targets Ther， 2020， 13：12501-12513.

［19］ Zheng Z， Xiao Z， He YL， et al. Heptapeptide isolated fromexhibited anti-photoaging potential via MAPK/AP-1/MMP pathway and anti-apoptosis in UVB-irradiated HaCaT cells［J］. Mar Drugs， 2021， 19（11）：626.

［20］ Liang H， Lin Z， Lin H， et al. circRNA_103615 contributes to tumor progression and cisplatin resistance in NSCLC by regulating ABCB1［J］. Exp Ther Med， 2021， 22（3）：934.

［21］ Krishna BM， Jana S， Singhal J， et al. Notch signaling in breast cancer： from pathway analysis to therapy［J］. Cancer Lett， 2019， 461：123-131.

［22］ Zeng D， Liang YK， Xiao YS， et al. Inhibition of Notch1 reverses EMT and chemoresistance to cisplatin via direct downregulation of MCAM in triple-negative breast cancer cells［J］. Int J Cancer， 2020， 147（2）：490-504.

［23］ Zhang X， Zhao X， Shao S， et al. Notch1 induces epithelial-mesenchymal transition and the cancer stem cell phenotype in breast cancer cells and STAT3 plays a key role［J］. Int J Oncol， 2015， 46（3）：1141-1148.

Knockdown of lncRNA H19 enhances drug sensitivity of cisplatin-resistant breast cancer cells through Notch signaling pathway

SHI Wen-biao， JIN Xiao-yan， PANG Wen-yang， WANG Yuan-fan， WANG Zheng-yi， ZHANG Qiang△

（，，318000，）

To investigate the effect of long non-coding RNA （lncRNA） H19 on cisplatin/cis-diamminodichloroplatinum （DDP） resistance in breast cancer cells and its molecular mechanism.A DDP-resistant human breast cancer cell line MCF7-Re was constructed. RT-qPCR was used to detect the expression levels of lncRNA H19 in human normal breast epithelial cell line MCF10A， and human breast cancer cell lines MCF7 and MCF7-Re. The lncRNA H19 interference plasmid was constructed， and CCK-8 assay was used to detect the viability of MCF7-Re cells after DDP treatment. The cell apoptosis was detected by TUNEL. The protein levels of Bcl-2， Bax， cleaved caspase-3， ATP-binding cassette protein subfamily B member 1 （ABCB1）， Notch1， and hairy and enhancer of split 1 （Hes1） were detected by Western blot. The Notch1 overexpression plasmid was constructed， and then was used in reversal experiments.The expression of lncRNA H19 was increased in MCF7-Re cells （<0.01）. Knockdown of H19 further reduced the cell viability and the ABCB1 expression， but increased the apoptosis rate of MCF7-Re cells after treated with DDP （<0.01）. The expression of Bax and cleaved caspase-3 was increased （<0.01）， while the expression of Bcl-2 and Notch signaling pathway-related proteins （Notch1 and Hes1） was inhibited （<0.01）. Overexpression of Notch1 increased the cell viability and the ABCB1 expression， but decreased the apoptosis rate of MCF7-Re cells after knockdown of lncRNA H19 （<0.01）. The protein expression of Bcl-2 was increased （<0.01）， while the protein expression of Bax and cleaved caspase-3 was decreased （<0.01）.Knockdown of lncRNA H19 inhibits the proliferation of DDP-resistant breast cancer cells and enhances their sensitivity to DDP by inhibiting Notch signaling pathway.

Long non-coding RNA H19； Breast cancer； Cisplatin； Drug resistance； Notch signaling pathway

1000-4718（2022）09-1585-07

2022-04-26

2022-07-14

15824092996； E-mail： zhangqq1975@163.com

R737.9； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.09.007

［基金項(xiàng)目］2021年臺(tái)州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No. 21ywa37）

（責(zé)任編輯：林白霜，羅森）