于婧文， 郭敏芳， 李蘇垚， 孟濤， 張海飛， 楊德斌，宋麗娟，3， 馬存根，△， 尉杰忠，，4△

黃芪甲苷通過(guò)調(diào)控線粒體功能抑制H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡*

于婧文1， 郭敏芳1， 李蘇垚2， 孟濤1， 張海飛1， 楊德斌1，宋麗娟2，3， 馬存根1，2△， 尉杰忠1，2，4△

（1山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所/附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，山西 大同 037009；2山西中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點(diǎn)研究室/神經(jīng)生物學(xué)研究中心，山西 晉中 030619；3山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，山西 太原 030001；4山西大同市第四人民醫(yī)院，山西 大同 037009）

探討黃芪甲苷（astragaloside IV， AST IV）對(duì)由氧化應(yīng)激損傷引起的線粒體功能障礙以及細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。體外培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，用過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide， H2O2）誘導(dǎo)建立氧化應(yīng)激模型，分為PBS組、模型組（H2O2組）和H2O2+AST IV組。應(yīng)用ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP水平；用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒JC-1檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位變化；應(yīng)用Western blot法檢測(cè)線粒體呼吸鏈上的complex I～V，分別為NADH：泛醌氧化還原酶亞基B8（NADH：ubiquinone oxidoreductase subunit B8， NDUFB8； complex I）、琥珀酸脫氫酶B（succinate dehydrogenase B， SDHB； complex II）、泛醇-細(xì)胞色素C還原酶核心蛋白2（ubiquinol-cytochrome C reductase core protein 2， UQCRC2； complex III）、細(xì)胞色素C氧化酶I（mitochondrially encoded cytochrome C oxidase I， MTCO1； complex IV）和ATP合酶F1亞基α（ATP synthase F1 subunit alpha， ATP5A； complex V），檢測(cè)線粒體動(dòng)力學(xué)分裂蛋白——磷酸化發(fā)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白1（phosporylated dynamin-related protein 1， p-Drp1）和線粒體分裂蛋白1（mitochondrial fission protein 1， Fis1），以及融合蛋白——線粒體融合蛋白1（mitofusin 1， Mfn1）、Mfn2和視神經(jīng)萎縮癥蛋白1（optic atrophy protein 1， OPA1），檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3；采用免疫熒光染色法檢測(cè)NDUFB8和MTCO1表達(dá)；采用TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。在200 μmol/L H2O2誘導(dǎo)的SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中，線粒體膜電位（<0.01）和ATP水平（<0.05）顯著下調(diào)，呼吸鏈氧化磷酸化過(guò)程中NDUFB8、SDHB、ATP5A和MTCO1的表達(dá)均顯著減少（<0.05或<0.01），線粒體分裂蛋白Fis1（<0.05）和p-Drp1（<0.01）蛋白水平顯著升高，融合蛋白Mfn1、Mfn2和OPA1表達(dá)則顯著降低（<0.05或<0.01），促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高（<0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著降低（<0.01）。AST IV能夠顯著提高細(xì)胞線粒體膜電位（<0.01）和ATP水平（<0.01），顯著促進(jìn)呼吸鏈氧化磷酸化過(guò)程中NDUFB8、SDHB、MTCO1、ATP5A及UQCRC2的表達(dá)（<0.05或<0.01），顯著降低p-Drp1和Fis1蛋白水平（<0.01），顯著增加OPA1、Mfn1和Mfn2的表達(dá)（<0.05或<0.01），顯著增加Bcl-2表達(dá)（<0.05），顯著降低Bax和cleaved caspase-3蛋白水平（<0.01）。AST IV能夠保護(hù)神經(jīng)元，其可能的機(jī)制是通過(guò)改善線粒體功能，調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)分裂/融合平衡，從而減輕氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡。

黃芪甲苷；氧化應(yīng)激；線粒體；SH-SY5Y細(xì)胞

線粒體是一個(gè)動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，不斷進(jìn)行分裂融合維持自身的形態(tài)、功能以及整個(gè)細(xì)胞的功能，分裂和融合的異常是導(dǎo)致線粒體功能障礙的重要因素。細(xì)胞氧化損傷和活性氧（reactive oxygen species， ROS）的增加，使線粒體成為容易被攻擊的靶點(diǎn)［1］。線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能變化與內(nèi)源性的神經(jīng)元凋亡有密切的關(guān)系［2-4］。在神經(jīng)元受損時(shí)，線粒體形態(tài)由管狀變?yōu)轭w粒狀， 線粒體外膜通透性發(fā)生改變，同時(shí)釋放凋亡因子，激活凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［2］，而在凋亡過(guò)程中會(huì)發(fā)生過(guò)度的線粒體分裂。在帕金森?。≒arkinson disease， PD）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer dissease， AD）、肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotraphic lateral sclerosis， ALS）及亨廷頓?。℉untington disease， HD）等疾病的早期，會(huì)發(fā)生線粒體功能障礙［3-6］。通過(guò)各種細(xì)胞系中線粒體分裂和融合、氧化磷酸化和能量代謝的研究證實(shí)，線粒體動(dòng)力學(xué)會(huì)影響神經(jīng)的可塑性，線粒體動(dòng)力學(xué)基因改變，能量代謝異?？赡苁茿D和PD發(fā)病的病理機(jī)制［3-4］。如果能在疾病早期發(fā)現(xiàn)并改善線粒體功能障礙，則可以為治療提供時(shí)間窗，以推遲或逆轉(zhuǎn)癥狀［2］。

在祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，黃芪有“十方八芪”之美稱。黃芪甲苷（astragaloside IV， AST IV）是黃芪的主要活性成分之一，具有較強(qiáng)的抗氧化作用。研究表明，其可以有效減輕妊娠期糖尿病小鼠胎盤氧化應(yīng)激［7］和子癇前期大鼠氧化應(yīng)激［8］，改善氧化應(yīng)激介導(dǎo)的心血管疾病內(nèi)皮功能障礙［9］和氨誘導(dǎo)的牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激［10］等。我們的前期研究也證實(shí)，AST IV可以通過(guò)抑制炎性小膠質(zhì)細(xì)胞極化抑制其介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，但其是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體功能、線粒體動(dòng)力學(xué)與氧化磷酸化來(lái)改善氧化應(yīng)激造成的神經(jīng)元損傷尚不清楚。

本研究應(yīng)用過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide， H2O2）誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞作為神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，研究AST IV對(duì)線粒體功能、代謝及動(dòng)力學(xué)的影響，探討其保護(hù)神經(jīng)元的作用機(jī)制，為AST IV保護(hù)線粒體提供參考資料。

材料和方法

1　材料

SH-SY5Y細(xì)胞株購(gòu)自國(guó)家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫(kù)。AST IV（純度>98%）和羧甲纖維素鈉購(gòu)自上海阿拉丁生化公司；細(xì)胞蛋白提取試劑盒、ATP檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒JC-1、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗磷酸化發(fā)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白1（phosporylated dynamin-related protein 1， p-Drp1）、線粒體分裂蛋白1（mitochondrial fission protein 1， Fis1）、線粒體融合蛋白1（mitofusin 1， Mfn1）、Mfn2和視神經(jīng)萎縮癥蛋白1（optic atrophy protein 1， OPA1）單克隆抗體，以及小鼠抗NADH：泛醌氧化還原酶亞基B8（NADH：ubiquinone oxidoreductase subunit B8， NDUFB8； complex I）、琥珀酸脫氫酶B（succinate dehydrogenase B， SDHB； complex II）、泛醇-細(xì)胞色素C還原酶核心蛋白2（ubiquinol-cytochrome C reductase core protein 2， UQCRC2； complex III）、細(xì)胞色素C氧化酶I（mitochondrially encoded cytochrome C oxidase I， MTCO1； complex IV）和ATP合酶F1亞基α（ATP synthase F1 subunit alpha， ATP5A； complex V）單克隆抗體均購(gòu)自Abcam；兔抗Bcl-2單克隆抗體、兔抗Bax單克隆抗體、兔抗cleaved caspase-3和兔抗GAPDH單克隆抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology；辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和DyLight?594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG均購(gòu)自ArthOx；高糖DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）購(gòu)自Gibco；青霉素、鏈霉素和谷氨酰胺均購(gòu)自HyClone；脫脂奶粉和牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）購(gòu)自Thermo。

2　方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)將SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于8 cm培養(yǎng)皿中，用含10% FBS、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和10 g/L谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)條件參照細(xì)胞資源庫(kù)培養(yǎng)說(shuō)明。隔天換液1次，細(xì)胞匯合度至約80%，用0.125%的胰蛋白酶消化并傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)胞分組及給藥實(shí)驗(yàn)分為PBS組、模型組（H2O2組）和H2O2+AST IV組。H2O2組加入200 μmol/L H2O2刺激24 h［11-12］，建立氧化應(yīng)激損傷模型，H2O2+AST IV組在加入H2O2之前2 h加入25 μmol/L AST IV共孵育24 h。

2.3線粒體膜電位檢測(cè)6孔板細(xì)胞加藥培養(yǎng)24 h后，吸除培養(yǎng)液，按照線粒體膜電位檢測(cè)產(chǎn)品說(shuō)明書（C2006），加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，再加入1 mL提前配制好的JC-1染色工作液，充分混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2次。加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。檢測(cè)JC-1單體時(shí)，把激發(fā)光設(shè)置為488 nm；檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)，把激發(fā)光設(shè)置為594 nm。出現(xiàn)綠色熒光說(shuō)明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說(shuō)明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。常用紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體去極化的比例。

2.4細(xì)胞內(nèi)ATP水平的測(cè)定6孔板細(xì)胞加藥培養(yǎng)24 h后，吸除培養(yǎng)液，加入RIPA裂解液，使細(xì)胞充分裂解，4 ℃、12 000×離心5 min，取上清，用于ATP的測(cè)定。按試劑盒說(shuō)明書（S2006）配置ATP檢測(cè)工作液，同時(shí)用ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。先在檢測(cè)孔內(nèi)加100 μL ATP檢測(cè)工作液，室溫放置3～5 min，消除本底影響。再分別加適量樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，混勻，用化學(xué)發(fā)光儀測(cè)相對(duì)光單位RLU值。

2.5Western blot法檢測(cè)呼吸鏈氧化磷酸化復(fù)合體蛋白、線粒體分裂融合蛋白和細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)6孔板細(xì)胞加藥培養(yǎng)24 h后，吸除培養(yǎng)液，加入RIPA裂解液，使細(xì)胞充分裂解，4 ℃、12 000×離心5 min，取上清液，用Nanodrop測(cè)定蛋白質(zhì)含量，并調(diào)整蛋白濃度。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，上樣蛋白量為30 μg，電泳分離蛋白質(zhì)后，濕式轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜。5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，分別加入1∶1 000稀釋的兔抗p-Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn2、OPA1、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3單克隆抗體，以及小鼠抗NDUFB8、SDHB、UQCRC2、MTCO1和ATP5A單克隆抗體，并選取兔抗GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體（1∶5 000），4 ℃孵育過(guò)夜；洗滌后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG或HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶10 000），室溫孵育2 h。洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用凝膠成像分析儀檢測(cè)條帶，用目的蛋白條帶吸光度與內(nèi)參照GAPDH吸光度的比值表示蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量。

2.6免疫熒光細(xì)胞染色法檢測(cè)呼吸鏈氧化磷酸化復(fù)合體蛋白NDUFB8和MTCO1的表達(dá)將SH-SY5Y細(xì)胞接種于放有爬片的24孔板，加藥培養(yǎng)24 h后，棄上清液，用冷的PBS洗細(xì)胞3次，每次5 min；用4%的多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，用含0.3% Triton X-100的PBS室溫孵育10 min。用0.1% BSA封閉30 min，分別加小鼠抗NDUFB8單克隆抗體（1∶1 000）和小鼠抗MTCO1單克隆抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜；PBS洗3次，加DyLight?594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶500），室溫避光孵育2 h；PBS洗3次，用Hoechst 33342染料的抗熒光淬滅封片液封片。顯微鏡下觀察NDUFB8和MTCO1的表達(dá)。

2.7TUNEL法檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡將SH-SY5Y細(xì)胞接種于放有細(xì)胞爬片的24孔板，加藥處理24 h 后，操作同2.6。含0.3% Triton X-100的PBS室溫孵育完成后，按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書（C1089）配制TUNEL檢測(cè)工作液，每孔加入適量TUNEL工作液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗3次并用含Hoechst 33342染料的抗熒光淬滅封片液封片。在熒光顯微鏡下觀察，Cy3的激發(fā)波長(zhǎng)為550 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為570 nm。統(tǒng)計(jì)視野下陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量（紅色熒光）和細(xì)胞總數(shù)量（藍(lán)色熒光），計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率（%）=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，組間兩兩比較用LSD-檢驗(yàn)。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　AST IV抑制H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位降低

由圖1可見，三組中H2O2組綠色熒光最強(qiáng)，說(shuō)明細(xì)胞處于細(xì)胞凋亡早期，線粒體膜電位下降；H2O2+AST IV組與H2O2組相比，綠色熒光減少而紅色熒光增加，說(shuō)明線粒體膜電上升。進(jìn)一步用線粒體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，H2O2組的線粒體膜電位顯著低于PBS組（<0.01）；H2O2+AST IV組與H2O2組相比，線粒體膜電位顯著升高（<0.01）。

Figure 1.　Astragaloside IV （AST IV） inhibited H2O2-induced decrease in mitochondrial membrane potential in SH-SY5Y cells. The SH-SY5Y cells were stained with JC-1 probe， and the staining was observed by confocal laser microscopy （scale bar=40 μm）. Average single red/green fluorescence intensity was shown as normal/decreased mitochondrial membrane potential. The ratio of green fluorescence to red fluorescence was used to measure the degree of mitochondrial depolarization. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs PBS group； ##P<0.01 vs H2O2 group.

2　AST IV通過(guò)促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞呼吸鏈氧化磷酸化恢復(fù)ATP水平

圖2A結(jié)果顯示，H2O2組的ATP水平與PBS組相比顯著降低（<0.05），而H2O2+AST IV組與H2O2組相比ATP水平顯著增加（<0.01）。因此，我們進(jìn)一步采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞線粒體呼吸鏈氧化磷酸化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，H2O2組NDUFB8（complex I）、SDHB（complex II）、MTCO1（complex IV）與ATP5A（complex V）蛋白水平較PBS組顯著降低（<0.05或<0.01），UQCRC2（complex III）與PBS組相比無(wú)顯著差異；H2O2+AST IV組與H2O2組相比，上述蛋白的表達(dá)均顯著增加（<0.01或<0.05），見圖2B。免疫熒光染色法檢測(cè)了NDUFB8和MTCO1，結(jié)果顯示：H2O2組NDUFB8和MTCO1的熒光強(qiáng)度與PBS組相比減弱，而H2O2+AST IV組NDUFB8和MTCO1熒光強(qiáng)度增加（圖2C）。

Figure 2.　Astragaloside IV （AST IV） restored ATP levels by promoting oxidative phosphorylation of the respiratory chain in H2O2-induced SH-SY5Y cells. A： ATP level was detected by ATP assay kit （n=5）； B： the expression of respiratory chain oxidative phosphorylation complex I～V proteins was detected by Western blot （n=3）； C： the expression of NDUFB8 and MTCO1 （red） was detected by immunofluorescence staining （scale bar=200 μm）. Mean±SD. *P<0.05， **P<0.01 vs PBS group； #P<0.05， ##P<0.01 vs H2O2 group.

3　AST IV抑制H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞線粒體分裂而促進(jìn)融合

為進(jìn)一步明確細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)機(jī)制，通過(guò)Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞線粒體分裂蛋白Fis1和p-DRP1，以及線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2和OPA1的表達(dá)水平。如圖3所示，與PBS組相比，H2O2組Fis1和p-Drp1蛋白水平均顯著升高（<0.05或<0.01），而Mfn1、Mfn2和OPA1表達(dá)水平均顯著降低（<0.05或<0.01）；與H2O2組相比，H2O2+AST IV組Fis1和p-Drp1蛋白水平均顯著降低（<0.05或<0.01），而Mfn1、Mfn2和OPA1表達(dá)水平均顯著升高（<0.05或<0.01）。

Figure 3.　Astragaloside IV （AST IV） inhibited mitochondrial fission and promoted fusion in H2O2-induced SH-SY5Y cells. The protein levels of p-Drp1， Fis1， OPA1， Mfn1 and Mfn2 were detected by Western blot （normalized to GAPDH）. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs PBS group； #P<0.05， ##P<0.01 vs H2O2 group.

4　AST IV促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞Bcl-2表達(dá)，抑制Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)

Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，圖4A顯示：與PBS組相比，H2O2組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（<0.01），而Bax和cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高（<0.01）；與H2O2處理組相比，H2O2+AST IV組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（<0.05），Bax和cleaved caspase-3蛋白水平顯著降低（<0.01）。

TUNEL法對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：H2O2組細(xì)胞凋亡率顯著高于PBS組（<0.01），而H2O2+AST IV組細(xì)胞凋亡率則顯著低于H2O2組（<0.01），見圖4B。

Figure 4.　Astragaloside IV （AST IV） inhibited apoptosis of H2O2-induced SH-SY5Y cells. A： the expression of apoptosis-related proteins Bcl-2， Bax and cleaved caspase-3 was detected by Western blot （n=3）； B： the apoptosis of SH-SY5Y cells was detected by TUNEL （scale bar=40 μm； n=5）. Positive cells （red） were observed by fluorescence microscope. The number of positive cells （red fluorescence） and total number of cells （blue fluorescence） were counted. Mean±SD. *P<0.05， **P<0.01 vs PBS group； #P<0.05， ##P<0.01 vs H2O2 group.

討論

AD、PD和ALS的病理均涉及神經(jīng)組織的氧化損傷［13-15］。H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞是構(gòu)建神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷體外模型的常用方法［11-12］。本文探討了AST IV對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中線粒體相關(guān)功能的調(diào)控作用和機(jī)制，結(jié)果顯示，AST IV干預(yù)能顯著提高ATP水平，增加線粒體膜電位。已有研究表明，AST IV不僅可以調(diào)控線粒體動(dòng)態(tài)穩(wěn)定，保護(hù)缺氧復(fù)氧損傷大鼠的心肌細(xì)胞［16］，而且可以改善腎血管性高血壓大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮線粒體損傷［17］。以上結(jié)論說(shuō)明，AST IV可以保護(hù)線粒體，與本文研究結(jié)果一致。

大部分ATP是通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生的。研究表明，線粒體功能下降，線粒體DNA（mtDNA）點(diǎn)突變和缺失增加，會(huì)損傷氧化磷酸化復(fù)合物，增加ROS，導(dǎo)致進(jìn)一步破壞線粒體蛋白、脂質(zhì)和mtDNA的惡性循環(huán)［18］。在缺氧大鼠模型中，氧化苦參堿和人參皂苷均能提高氧化磷酸化效率，增加線粒體膜電位［19］。AST IV與人參皂苷均屬于四環(huán)三萜皂苷元，我們的研究結(jié)果表明，AST IV可以通過(guò)增加呼吸鏈氧化磷酸化過(guò)程中相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)增加ATP的產(chǎn)生，從而逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激造成的能量不足。TrkB1受體激動(dòng)劑R13可促進(jìn)線粒體氧化磷酸化，增加complex I、complex II、complex III和complex IV，增強(qiáng)線粒體的生物發(fā)生和代謝而用于治療AD［20］。依替福辛通過(guò)恢復(fù)腦外傷氧化磷酸化能力，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，改善行為和認(rèn)知［21］。因此，恢復(fù)線粒體氧化磷酸化能力，維護(hù)線粒體功能正常，對(duì)防治神經(jīng)退行性疾病具有重要意義。

線粒體分裂/融合失衡是神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵誘因［22］。研究表明，在AD患者的腦皮質(zhì)樣本研究中，線粒體分裂蛋白Drp1和Fis1的mRNA水平升高，融合蛋白Opa1、Mfn1和Mfn2的mRNA水平降低［23］。用Aβ25-35處理后的SH-SY5Y細(xì)胞，線粒體融合基因表達(dá)水平下調(diào)，而分裂基因表達(dá)水平上調(diào)［24］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，氧化應(yīng)激損傷后線粒體分裂蛋白p-Drp1和Fis1蛋白水平顯著升高，融合蛋白Mfn1、Mfn2和OPA1表達(dá)顯著減少；而AST IV處理抑制了線粒體分裂的同時(shí)促進(jìn)了融合，表明AST IV可以調(diào)節(jié)線粒體動(dòng)力學(xué)，修復(fù)氧化應(yīng)激損傷后的線粒體功能。

線粒體分裂/融合可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。研究表明，F(xiàn)is1過(guò)表達(dá)化引起細(xì)胞色素C的釋放和細(xì)胞凋亡［25］。Mfn1和Mfn2融合蛋白的過(guò)表達(dá)，可以促進(jìn)線粒體之間的交流，延遲細(xì)胞色素C的釋放和凋亡通路中Bax和Bak的激活［26-27］。敲除、或的線粒體對(duì)凋亡刺激的敏感性增加［27-28］。本研究也證實(shí)，AST IV可以通過(guò)調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)，抑制凋亡信號(hào)通路Bax/cleaved caspase-3的激活，從而減少神經(jīng)元的凋亡。

綜上所述，AST IV可以保護(hù)神經(jīng)元，其可能的機(jī)制是通過(guò)修復(fù)線粒體功能，調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)來(lái)減輕氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡。

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Astragaloside IV inhibits H2O2-induced apoptosis of SH-SY5Y cells by regulating mitochondrial function

YU Jing-wen1， GUO Min-fang1， LI Su-yao2， MENG Tao1， ZHANG Hai-fei1， YANG De-bin1， SONG Li-juan2，3， MA Cun-gen1，2△， YU Jie-zhong1，2，4△

（1，，037009，；2，，，030619，；3，，030001，；4，037009，）

To investigate the effects of astragaloside IV （AST IV） on mitochondrial damage and cell apoptosis in human neuroblastoma SH-SY5Y cells induced by hydrogen peroxide （H2O2）.The SH-SY5Y cells were treated with PBS， H2O2or H2O2+AST IV. Intracellular ATP level was measured by ATP detection kit. Mitochondrial membrane potential was measured by mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1. Mitochondrial respiratory chain-related proteins NADH：ubiquinone oxidoreductase subunit B8 （NDUFB8； complex I）， succinate dehydrogenase B （SDHB； complex II）， ubiquinol-cytochrome C reductase core protein 2 （UQCRC2； complex III）， mitochondrially encoded cytochrome C oxidase I （MTCO1； complex IV） and ATP synthase F1 subunit alpha （ATP5A； complex V）， mitochondrial dynamic fission proteins phosphorylated dynamin-related protein 1 （p-Drp1） and mitochondrial fission protein 1 （Fis1）， fusion proteins mitofusin 1 （Mfn1）， Mfn2 and optic atrophy protein 1 （OPA1）， and apoptosis-related proteins cleaved caspase-3， Bcl-2 and Bax were detected by Western blot. The expression of NDUFB8 and MTCO1 was detected by immunofluorescence staining. TUNEL staining was applied to observe SH-SY5Y cell apoptosis.The SH-SY5Y cells were treated with H2O2at the dose of 200 μmol/L to establish the oxidative stress cell model. In oxidative stress model， mitochondrial membrane potential （<0.01） and ATP level （<0.05） were down-regulated significantly， and the expression of NDUFB8， SDHB， ATP5A and MTCO1 were significantly decreased （<0.05 or<0.01）. Mitochondrial fission proteins Fis1 （<0.05） and p-Drp1 （<0.01） were significantly increased， fusion proteins Mfn1， Mfn2 and OPA1 were significantly decreased， the expression levels of pro-apoptotic proteins Bax and cleaved caspase-3 were significantly increased （<0.01）， and Bcl-2 was significantly decreased （<0.01） after treatment with H2O2. Treatment with AST IV significantly increased mitochondrial membrane potential （<0.01） and ATP level （<0.01）， significantly up-regulated the complex proteins NDUFB8， SDHB， MTCO1， ATP5A and UQCRC2 （<0.05 or<0.01）， significantly down-regulated the expression of mitochondrial fission proteins p-DRP1 and Fis1 （<0.01）， and remarkably up-regulated the expression of mitochondrial fusion proteins OPA1， Mfn1 and Mfn2 （<0.05 or<0.01）. Meanwhile， AST IV significantly increased the expression of Bcl-2 （<0.05）， significantly decreased the expression of Bax and cleaved caspase-3 （<0.01）， and inhibited SH-SY5Y cell apoptosis.Astragaloside IV attenuates the apoptosis of SH-SY5Y cells induced by H2O2through regulating mitochondrial function.

Astragaloside IV； Oxidative stress； Mitochondria； SH-SY5Y cells

1000-4718（2022）09-1553-08

2022-04-01

2022-07-07

馬存根 Tel： 18203515288； E-mail： macungen@sxtcm.edu.cn； 尉杰忠 Tel： 13834129435； E-mail： sxdtyjz@qq.com

R338.2； R741.02

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.09.003

［基金項(xiàng)目］山西省基礎(chǔ)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目（No. 20210302123337）； 大同市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目資助（No. 2020145）； 國(guó)家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點(diǎn)研究室開放課題（No. 2021-KF-08T）； 山西省教育廳高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目（No. 2019L0734）； 神經(jīng)炎癥和變性疾病基礎(chǔ)與應(yīng)用研究山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（No. KF-2019002）

（責(zé)任編輯：李淑媛，羅森）