蔣兆榮 段海霞 陳 冰 王班偉

[珠海市第二人民醫(yī)院(珠海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)眼科，廣東省珠海市 519000]

青光眼是一種復雜的慢性神經(jīng)退行性疾病，可損害視神經(jīng)，嚴重時可導致永久性失明，目前仍缺乏有效的治療方法。枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide，LBP)是我國傳統(tǒng)中藥枸杞的提取物，不但具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖、提高免疫力等多種功效，而且還可防治視網(wǎng)膜病變、白內(nèi)障、青光眼等眼部慢性疾病[1]。研究表明，LBP可以改善小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)，延緩視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell，RGC)功能衰退而導致的光感受器退化[1]，并可挽救急性高眼壓大鼠神經(jīng)退行性變，改善視網(wǎng)膜功能[2]，還能維持血-視網(wǎng)膜屏障，提高RGC的存活率[3]。

氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強可引起青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變和缺血性視神經(jīng)病變等[4]，LBP可通過改善大鼠視網(wǎng)膜的氧化應(yīng)激狀態(tài)抑制氯化鈣誘導的RGC凋亡[4]。Ras同源基因家族成員A(Ras homolog family member A，RHOA)屬于小分子三磷酸鳥苷結(jié)合蛋白Rho家族成員之一，而Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶1(Rho associated coiled-coil containing protein kinase 1，ROCK1)是RHOA/ROCK1信號通路下游的主要靶效應(yīng)因子，也是Caspase-3的直接底物，而抑制ROCK1和Caspase-3的活化可減輕甲基汞誘導的細胞凋亡[5]。但是LBP是否可通過RHOA/ROCK1通路減輕慢性青光眼大鼠的RGC損傷，目前鮮有報告。本研究采用上鞏膜靜脈烙閉法建立慢性青光眼大鼠模型，使用LBP和RHOA激動劑水仙環(huán)素進行干預，旨在從RHOA/ROCK1通路探討LBP減輕慢性青光眼大鼠RGC損傷的作用機制，為在臨床上應(yīng)用LBP治療慢性青光眼提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級健康SD大鼠(120只，雄性，7～8周齡，體重180～220 g)購自重慶醫(yī)科大學動物實驗中心[許可證號：SCXK(渝)2018-0003]，相關(guān)干預處理符合國家實驗室動物倫理保護標準及相關(guān)法律規(guī)定。按照3R原則給予實驗動物人道的關(guān)懷照顧。飼養(yǎng)條件為溫度22 ℃，濕度55%，12 h光暗循環(huán)。

1.1.2 實驗藥物：LBP(含量>32%)購自寧夏潤德枸杞產(chǎn)業(yè)有限公司(批號：100407-201801)。RHOA激動劑水仙環(huán)素(純度為99.74%，目錄號為HY-16563)購自美國MCE公司(批號：29477-83-6)。

1.1.3 主要試劑和儀器：大鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛、一氧化氮ELISA試劑盒(批號分別為ml063052、ml093018、ml093036)均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，TUNEL凋亡檢測試劑盒(批號：T2190)購自上海碧云天生物科技有限公司，SDS和鼠抗β-actin(批號：A5441)均購自美國Sigma公司，蛋白提取試劑盒、ECL顯色試劑盒和二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(批號分別為ZLI-9018、36208ES60、K812)均購自北京中山金橋生物科技有限公司；RHOA、ROCK1、Caspase-3、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、磷酸化PI3K(phosphorylated PI3K，p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、磷酸化AKT(phosphorylated AKT，p-AKT)和缺氧誘導因子1ɑ(hypoxia-inducible factor 1ɑ，HIF-1ɑ)一抗，以及辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG二抗(批號分別為ab54835、ab97592、ab179517、ab32089、ab278545、ab38449、ab8805、ab51608、ab205719、ab6721)均購自美國Abcam公司。TONO-PEN AVIA?型筆式眼壓計購自美國Mentor公司，Stat Fax-2100酶標儀購自美國Awareness公司，尼康SMZ745光學顯微鏡購自上海普赫生物科技有限公司，XSP-63B型熒光顯微鏡購自上海光學儀器廠，ChemiDoc MP全能型蛋白凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司，WZY型脫水機、ABM-6型包埋機、HS-3315型石蠟切片機和XK-1型染色機均購自湖北惠達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 慢性青光眼大鼠模型的建立及分組：(1)采用上鞏膜靜脈烙閉法建立慢性青光眼大鼠模型[6]。通過腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)全身麻醉100只大鼠，用0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液進行右眼角結(jié)膜表面麻醉，在顳上、顳下和鼻上位置沿角膜邊緣剪開相應(yīng)的球結(jié)膜并慢慢分開眼肌和筋膜，暴露出3支上鞏膜靜脈，以眼科手術(shù)止血器進行烙閉，即可見近端靜脈充血怒張，遠端靜脈發(fā)白，整復球結(jié)膜，用紅霉素眼膏涂眼，待大鼠蘇醒后放回籠中，每天涂紅霉素眼膏，2次/d，連續(xù)6 d。在手術(shù)10 d后大鼠平均眼壓維持在22 mmHg(1 mmHg=0.133 KPa)以上即為造模成功，本實驗100只大鼠中有80只造模成功。(2)使用隨機數(shù)字表法，將造模成功的80只大鼠分為模型組、LBP組、水仙環(huán)素組和LBP+水仙環(huán)素組，每組20只，另取20只大鼠作為假手術(shù)組，按上述方法麻醉大鼠后進行手術(shù)，但術(shù)中僅暴露上鞏膜靜脈，不進行烙閉。造模成功后，給予模型組和假手術(shù)組大鼠灌胃蒸餾水，給予LBP組大鼠灌胃 LBP(200 mg/kg)[7]，給予水仙環(huán)素組1 mg/kg 水仙環(huán)素灌胃，給予LBP+水仙環(huán)素組200 mg/kg LBP和1 mg/kg 水仙環(huán)素同時灌胃，均于每天同一時間灌胃1次，灌胃體積為10 mL/kg，連續(xù)灌胃8周。干預結(jié)束并進行右眼眼壓測量后，采用隨機數(shù)字表法，每組取10只大鼠的右眼視網(wǎng)膜用于觀察形態(tài)及檢測RGC凋亡情況，取5只大鼠的右眼視網(wǎng)膜用于檢測SOD活性、丙二醛和一氧化氮水平；取剩余5只大鼠的右眼視網(wǎng)膜用于檢測RHOA、ROCK1、Caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和HIF-1ɑ蛋白表達水平。均通過注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)對大鼠進行麻醉，而后實施安樂死，摘除眼球后在顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜組織。

1.2.2 眼壓測量：用TONO-PEN AVIA?筆式眼壓計分別于造模前、給藥前及給藥8周后測量各組大鼠眼壓。為避免誤差，每次測量每只大鼠右眼3次，計算3次測量的平均值，測完后用稀釋過的慶大霉素沖眼以免感染。

1.2.3 觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)：分別取各組10只大鼠的右眼視網(wǎng)膜組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制作4 μm厚切片，HE染色后，光學顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)。

1.2.4 檢測視網(wǎng)膜組織中SOD活性、丙二醛和一氧化氮水平：分別取各組5只大鼠右眼視網(wǎng)膜組織，加入預冷的生理鹽水，4 ℃條件下，3 000 r/min離心20 min，取上清，嚴格按SOD、丙二醛、一氧化氮 ELISA試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀測定各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、丙二醛、一氧化氮的光密度值，依據(jù)各自標準曲線，計算視網(wǎng)膜組織中SOD活性、丙二醛、一氧化氮水平，每組設(shè)置3個復孔。

1.2.5 檢測RGC凋亡情況：取上述1.2.3各組大鼠視網(wǎng)膜組織切片，常規(guī)脫蠟至水，嚴格按照TUNEL凋亡試劑盒檢測說明書進行操作，置于熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)波長450～500 nm，發(fā)射波長515～565 nm)，每組樣品隨機選取5個400倍視野，在距視盤邊緣100 μm范圍內(nèi)計數(shù)凋亡細胞，其中綠色熒光細胞為凋亡細胞。

1.2.6 檢測視網(wǎng)膜組織中相關(guān)蛋白的表達水平：取各組剩余5只大鼠，剝離右眼視網(wǎng)膜，使用蛋白提取試劑盒提取視網(wǎng)膜組織總蛋白。使用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，然后進行SDS-PAGE、濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜(400 mA，4 h)、5%脫脂奶粉封閉膜1 h，分別使用按1 ∶2 000濃度稀釋后的RHOA、ROCK1、Caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和HIF-1ɑ一抗，以及按1:1000濃度稀釋后的β-actin一抗于4 ℃下孵育過夜；孵育結(jié)束后使用PBS洗膜3次，5 min/次，使用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠或羊抗兔IgG二抗(1 ∶5 000)在室溫下孵育2 h，用ECL顯色試劑盒顯色，凝膠成像儀拍照，分析灰度值，以β-actin為參照計算目的蛋白相對表達量。每組設(shè)置3個復孔。

1.3 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以(x±s)表示， 采用單因素方差分析進行多組間比較，采用LSD-t檢驗進行兩兩比較。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時間點各組大鼠眼壓的比較 造模前，各組大鼠的眼壓差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。給藥前，與假手術(shù)組相比，其余各組大鼠眼壓升高(P<0.05)。給藥8周后，與模型組相比，LBP組大鼠眼壓降低，水仙環(huán)素組大鼠眼壓升高(均P<0.05)；與LBP組相比，LBP+水仙環(huán)素組大鼠眼壓升高(P<0.05)；與水仙環(huán)素組相比，LBP+水仙環(huán)素組大鼠眼壓降低(P<0.05)。見表1。

表1 不同時間點各組大鼠眼壓的比較(x±s，mmHg)

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)的比較 假手術(shù)組大鼠視網(wǎng)膜組織厚，結(jié)構(gòu)完整，各層細胞排列緊密。模型組大鼠視網(wǎng)膜組織較薄，細胞排列稀疏，膜盤間隙有空泡，RGC數(shù)量較少。與模型組相比，LBP組大鼠視網(wǎng)膜組織增厚，細胞排列整齊，RGC數(shù)量增多；水仙環(huán)素組大鼠視網(wǎng)膜組織變薄，結(jié)構(gòu)紊亂，細胞排列疏松、膜盤間隙空泡增多，RGC數(shù)量減少。與LBP組相比，LBP+水仙環(huán)素組視網(wǎng)膜較薄，細胞排列稀疏，RGC數(shù)量減少；但與水仙環(huán)素組相比，LBP+水仙環(huán)素組視網(wǎng)膜增厚，結(jié)構(gòu)清晰，細胞排列更密。見圖1。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)(HE染色，×400)

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性、丙二醛和一氧化氮水平的比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性降低，丙二醛和一氧化氮水平升高(均P<0.05)。與模型組相比，LBP組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性升高，丙二醛和一氧化氮水平降低(均P<0.05)，而水仙環(huán)素組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性降低，丙二醛和一氧化氮水平升高(均P<0.05)。與LBP組相比，LBP+水仙環(huán)素組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性降低，丙二醛和一氧化氮水平升高(均P<0.05)；但與水仙環(huán)素組相比，LBP+水仙環(huán)素組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性升高，丙二醛和一氧化氮水平降低(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性、丙二醛和一氧化氮水平的比較(x±s)

2.4 各組大鼠RGC凋亡情況的比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠RGC凋亡數(shù)量增多(P<0.05)。與模型組相比，LBP組大鼠RGC凋亡數(shù)量減少，水仙環(huán)素組大鼠RGC凋亡數(shù)量增多(均P<0.05)。與LBP組相比，LBP+水仙環(huán)素組大鼠RGC凋亡數(shù)量增多(P<0.05)；但與水仙環(huán)素組相比，LBP+水仙環(huán)素組大鼠RGC凋亡數(shù)量減少(P<0.05)。見圖2和表3。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織RGC凋亡檢測結(jié)果(TUNEL染色，×400)

表3 各組大鼠RGC凋亡數(shù)量的比較(x±s，個/100 μm)

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中RHOA、ROCK1和Caspase-3蛋白表達水平的比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中RHOA、ROCK1和Caspase-3蛋白表達水平均升高(均P<0.05)。與模型組相比，LBP組大鼠視網(wǎng)膜組織中RHOA、ROCK1和Caspase-3蛋白表達水平均降低，水仙環(huán)素組大鼠視網(wǎng)膜組織中RHOA、ROCK1和Caspase-3蛋白表達水平均升高(均P<0.05)。與LBP組相比，LBP+水仙環(huán)素組大鼠視網(wǎng)膜組織中RHOA、ROCK1和Caspase-3蛋白表達水平均升高(均P<0.05)；而與水仙環(huán)素組相比，LBP+水仙環(huán)素組大鼠視網(wǎng)膜組織中RHOA、ROCK1和Caspase-3蛋白表達水平均降低(均P<0.05)。見圖3和表4。

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織RHOA、ROCK1和Caspase-3蛋白的電泳圖

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織RHOA、ROCK1和Caspase-3蛋白相對表達水平的比較(x±s)

2.6 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中PI3K/AKT信號通路及相關(guān)因子HIF-1ɑ蛋白表達水平的比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中p-PI3K/PI3K比值、p-AKT/AKT比值和HIF-1ɑ蛋白表達水平均升高(均P<0.05)。與模型組相比，LBP組大鼠視網(wǎng)膜組織中p-PI3K/PI3K比值、p-AKT/AKT比值和HIF-1ɑ蛋白表達水平均降低(均P<0.05)，水仙環(huán)素組大鼠視網(wǎng)膜組織中p-PI3K/PI3K比值、p-AKT/AKT比值和HIF-1ɑ蛋白表達水平升高(均P<0.05)。與LBP組相比，LBP+水仙環(huán)素組大鼠視網(wǎng)膜組織中p-PI3K/PI3K比值、p-AKT/AKT比值和HIF-1ɑ蛋白表達水平均升高(均P<0.05)；而與水仙環(huán)素組相比，LBP+水仙環(huán)素組大鼠視網(wǎng)膜組織中p-PI3K/PI3K比值、p-AKT/AKT比值和HIF-1ɑ蛋白表達水平均降低(均P<0.05)。見圖4和表5。

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、HIF-1ɑ蛋白的電泳圖

表5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織p-PI3K/PI3K比值、p-AKT/AKT比值和HIF-1ɑ蛋白相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

青光眼已成為繼白內(nèi)障之后全球第二致盲性眼病，可引起眼內(nèi)壓力升高，造成不可逆致盲。但目前青光眼的確切病因尚未完全清楚，其可能是由多種不同因素共同作用而引起的一種集合癥候群。西醫(yī)治療在一定程度上能夠降低眼壓，但尚不能從根本上保護青光眼患者RGC免受損傷，因此，近年來中藥在治療青光眼中的作用越來越受重視。枸杞是我國藥食兩用的傳統(tǒng)中藥材，用于治療血虛痿黃、目昏不明等病癥已有2 500多年的歷史，其提取物LBP含有多種活性成分，不但可以抵抗各種類型的癌細胞，而且能夠保護青光眼模型大鼠的RGC免受損傷[8]，對慢性高眼壓模型大鼠也具有神經(jīng)保護作用[9]，并能提高大鼠視神經(jīng)部分折斷后的RGC存活率[10]。因此，深入研究其中的作用機制，可為LBP用于防治青光眼提供更多的科學依據(jù)。

已有研究表明，LBP能改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的氧化應(yīng)激狀態(tài)，對RGC具有一定的保護作用[11]，同時可顯著提升人小梁網(wǎng)細胞活力，調(diào)節(jié)眼壓，并能緩解小梁網(wǎng)細胞因抗氧化反應(yīng)而引起的損傷[12]。青光眼患者的丙二醛水平顯著升高，SOD活性顯著降低[13]，而視網(wǎng)膜組織中較高水平的丙二醛和一氧化氮能抑制血管調(diào)節(jié)因子，促進假性青光眼的發(fā)展[14]；降低丙二醛水平并增加SOD活性，可保護青光眼動物模型的神經(jīng)[15]。本研究結(jié)果表明，LBP能降低慢性青光眼大鼠眼壓、視網(wǎng)膜組織中的丙二醛和一氧化氮水平，減少RGC凋亡，提高視網(wǎng)膜組織中的SOD活性，并促使視網(wǎng)膜組織增厚，使其結(jié)構(gòu)完整清晰，使細胞排列緊密，提示LBP可減輕慢性青光眼大鼠視網(wǎng)膜組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解視網(wǎng)膜損傷，對慢性青光眼具有一定的治療作用。

RHOA信號介導了由小梁網(wǎng)細胞變化引起的眼壓升高[16]。Liu等[17]的研究表明ROCK1活性上調(diào)不僅依賴于RHOA的表達，還依賴于Caspase-3的表達。ROCK1是Caspase-3的直接底物，在缺血再灌注時ROCK1的表達增加可提高Caspase-3的表達水平，兩者的級聯(lián)反應(yīng)形成惡性循環(huán)，加重缺血再灌注損傷[18]。另有研究顯示，RHOA/ROCK是PI3K/AKT的上游信號通路[19]。HIF-1ɑ是機體對缺氧適應(yīng)性調(diào)節(jié)的重要調(diào)控蛋白，有研究顯示，下調(diào)HIF-1ɑ表達，可減少小鼠RAW264.7巨噬細胞的凋亡[20]。而PI3K/AKT信號通路與細胞凋亡密切相關(guān)，AKT磷酸化可促進Caspase-3的激活，調(diào)控HIF-1ɑ活性，進而誘導細胞凋亡[21]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型大鼠視網(wǎng)膜組織中RHOA、ROCK1、Caspase-3和HIF-1ɑ蛋白水平，以及p-PI3K/PI3K比值、p-AKT/AKT比值均增高，提示慢性青光眼大鼠中RHOA/ROCK1通路及其下游PI3K/AKT信號通路處于激活狀態(tài)。已有研究表明，LBP不僅可通過調(diào)節(jié)Rho/ROCK信號通路保護大鼠視網(wǎng)膜-血屏障[22]，還能通過下調(diào)視網(wǎng)膜神經(jīng)中內(nèi)皮素表達及其相關(guān)的信號通路，從而保護視神經(jīng)[23]。本研究中，給予LBP處理后，慢性青光眼大鼠RGC凋亡數(shù)量減少，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變清晰，細胞排列變緊密，RHOA、ROCK1、Caspase-3和HIF-1ɑ蛋白表達水平下調(diào)，p-PI3K/PI3K比值、p-AKT/AKT比值降低，表明LBP可通過抑制RHOA/ROCK1通路，以抑制其下游PI3K/AKT通路及HIF-1ɑ蛋白表達，從而減少RGC凋亡，緩解慢性青光眼大鼠RGC損傷。

此外，我們發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用LBP和RHOA激活劑水仙環(huán)素聯(lián)合處理后，慢性青光眼大鼠眼壓升高、視網(wǎng)膜組織損傷和RGC凋亡等情況均較LBP單獨處理時加重，但較水仙環(huán)素單獨處理時減輕；同時視網(wǎng)膜組織中丙二醛和一氧化氮水平、Caspase-3和HIF-1ɑ蛋白表達水平、PI3K/AKT通路活化程度較LBP單獨處理時升高，但較水仙環(huán)素單獨處理時降低，SOD活性較LBP單獨處理時降低，但較水仙環(huán)素單獨處理時升高。以上結(jié)果表明，LBP對RGC的保護效果可被RHOA激活劑水仙環(huán)素逆轉(zhuǎn)，進一步揭示了LBP對慢性青光眼大鼠RGC的保護作用可能與抑制RHOA/ROCK1通路進而降低其下游PI3K/AKT通路活性有關(guān)。

綜上所述，LBP可能通過抑制RHOA/ROCK1通路，以抑制下游PI3K/AKT通路和調(diào)控HIF-1ɑ水平，從而緩解視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少RGC凋亡、減輕RGC損傷，并降低慢性青光眼大鼠眼壓，這或可為在臨床上應(yīng)用LBP治療慢性青光眼提供了理論依據(jù)。但是LBP治療慢性青光眼的作用機制十分復雜，可能還涉及其他信號通路及相關(guān)因子，尚需后續(xù)深入研究。