李媛媛，馬星衛(wèi)，韓媛媛，黃盛文

1.貴州省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州貴陽 550002；2.貴州省人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，貴州貴陽 550002；3.貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽 550025

脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy,SMA）是一種神經(jīng)肌肉疾病，屬于常染色體隱性單基因遺傳病[1]。2018年5月，脊髓性肌萎縮癥被列入國家衛(wèi)生健康委員會(huì)等部門聯(lián)合制定的《第一批罕見病目錄》[2]。嬰幼兒期起病的患兒，很大概率無法活到2歲。因此，SMA也被稱為2歲以下嬰幼兒的頭號(hào)致死性遺傳病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，SMA在活產(chǎn)嬰兒的發(fā)病率為1/10 000～1/6 000[3]，SMA缺陷基因的人群攜帶率為1/40～1/50[4]。雖然SMA可防可治，但鑒于SMA患者病情嚴(yán)重、人群攜帶率高、危害性大以及昂貴的治療費(fèi)用，現(xiàn)階段攜帶者篩查、產(chǎn)前診斷仍然是主要的預(yù)防手段，攜帶相同致病基因的父母通過產(chǎn)前診斷或第三代試管嬰兒的方法就可以阻斷患兒的出生。因此，美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)（ACMG）、美國婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)（ACOG）在先后發(fā)布了多個(gè)攜帶者篩查的指南，強(qiáng)烈建議每一位計(jì)劃懷孕或已懷孕女性篩查SMA[5-8]。本研究于2018年1月—2019年12月對(duì)貴陽地區(qū)貴州省人民醫(yī)院1 163例孕婦人群進(jìn)行了首次大樣本量SMA攜帶者篩查。其篩查流程和經(jīng)驗(yàn)或?qū)⒂兄赟MA遺傳咨詢和產(chǎn)前基因診斷在貴陽地區(qū)的推廣，對(duì)于優(yōu)生優(yōu)育、有效預(yù)防SMA胎兒的出生具有重要的臨床意義。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

對(duì)常規(guī)產(chǎn)檢的13 478例孕婦進(jìn)行SMA攜帶者篩查宣教，其中1 163例表型正常的孕婦自愿接受篩查，接受率約為8.62%。回顧性分析孕婦臨床資料，年齡17～44歲，平均（29.74±2.1）歲；孕周10～24周，平均（17.8±2.3）周。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：表型正常、無SMA家族史、自愿接受篩查的孕期女性。排除標(biāo)準(zhǔn)：使用肝素抗凝的全血樣本。

1.3 方法

①樣本釆集受檢者外周靜脈血2 mL，枸櫞酸鈉或EDTA抗凝，置于2～8℃冷藏條件下保存，并在1周內(nèi)完成檢測(cè)。

②DNA提取采用核酸提取試劑提取外周血基因組DNA，NanoDrop Lite分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，要求純度（A260/A280）為1.7～2.0，濃度為2.0～180 ng/μl。-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

③基因檢測(cè)運(yùn)用多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)（自建方法），對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因（survival motor neuron 1,SMN1）拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增條件為：UNG酶50℃反應(yīng)1 min；95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 sec，60℃延伸35 sec，共40個(gè)循環(huán)；報(bào)告基團(tuán)VIC、CY5。

④結(jié)果判斷根據(jù)比較Ct法進(jìn)行SMN1基因拷貝數(shù)的定量分析，純合缺失型、雜合缺失型和正常型對(duì)應(yīng)的SMN1基因拷貝數(shù)分別為：0、1和2。計(jì)算公式如下：待測(cè)樣本（或?qū)φ諛颖荆┠康幕颉鰿t=Ct_目的基因-Ct_參比基因；待測(cè)樣本目的基因△△Ct=△Ct_待測(cè)樣本-△Ct_對(duì)照樣本；待測(cè)樣本目的基因RQ值（Expression值）=2-△△Ct。

⑤產(chǎn)前診斷若孕婦檢測(cè)為SMA攜帶者，則對(duì)其配偶進(jìn)行攜帶者篩查；若夫婦雙方均為SMA攜帶者，經(jīng)知情同意后于孕16～22周，在B超引導(dǎo)下經(jīng)腹壁行羊膜腔穿刺術(shù)，用一次性無菌注射器緩慢抽取羊水10 mL，按上述方法和DNA測(cè)序法同時(shí)對(duì)胎兒的SMN1基因進(jìn)行檢測(cè)。分娩后提取胎兒組織基因組DNA，檢測(cè)SMN1基因以進(jìn)一步證實(shí)產(chǎn)前診斷的結(jié)果。

⑥隨機(jī)抽取經(jīng)自建方法檢測(cè)為純合缺失型、雜合缺失型和正常型的樣本各5例，送第三方實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligationdependent probe amplification,MLPA）檢測(cè)，比較兩種方法結(jié)果的一致性。

1.4 觀察指標(biāo)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用四格表進(jìn)行處理，計(jì)算陽性符合率、陰性符合率、總符合率。陽性符合率=100%[a/(a+c)]，陰性符合率=100%[d/(b+d)]，總符合率：是評(píng)估檢測(cè)結(jié)果和明確診斷結(jié)果總一致程度的指標(biāo)，它是所有檢測(cè)結(jié)果中真正的陽性結(jié)果和真正的陰性結(jié)果所占的百分比?？偡下?100%[(a+d)/n]。見表1。

表1 比較兩種方法結(jié)果的一致性

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用Excel 16.64分析數(shù)據(jù)。配對(duì)卡方（χ2）檢驗(yàn)：說明的是檢出率或陽性率的高低是否相同。Kappa檢驗(yàn)：說明的是被考核試劑與對(duì)比試劑/對(duì)比方法檢測(cè)結(jié)果的一致性程度。

2 結(jié)果

2.1 樣本SMN1基因檢測(cè)結(jié)果

所有樣本均檢測(cè)成功，通過對(duì)SMN1基因外顯子7的定量檢測(cè)，可檢出SMN1基因純合缺失型、雜合缺失型和正常型，對(duì)應(yīng)的SMN1基因拷貝數(shù)分別為0、1和2。見圖1。

圖1 SMN1基因PCR檢測(cè)結(jié)果

續(xù)圖1

2.2 1 163例產(chǎn)檢孕婦SMA攜帶 率

對(duì)13 478例孕婦進(jìn)行SMA攜帶者篩查宣教，僅有1 163例孕婦自愿接受篩查，接受率為8.62%。在接受篩查的1 163例產(chǎn)檢孕婦中，檢出26例為SMA攜帶者，攜帶率為1/45(檢出率2.24%)。經(jīng)遺傳咨詢，12例攜帶者的配偶自愿接受SMA篩查，接受率為46.15%。最終檢測(cè)出同為SMA攜帶者的夫婦2對(duì)。

2.3 SMA產(chǎn)前診斷

對(duì)2例高風(fēng)險(xiǎn)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，孕18周時(shí)行羊水穿刺，胎兒SMN1基因產(chǎn)前診斷結(jié)果：其中1例為純合缺失，基因拷貝數(shù)為0，確診為SMA胎兒，根據(jù)孕婦夫婦意愿選擇終止妊娠；另外1例為雜合缺失，基因拷貝數(shù)為1，確診為攜帶者，出生后隨訪1年發(fā)育未見異常。

2.4 MLPA驗(yàn)證SMN1

基因純合缺失型、雜合缺失型和正常型全部檢出，兩種方法的一致性為100%。見圖2。

圖2 SMN1基 因MLPA結(jié)果

3 討論

由于中國人口基數(shù)龐大，罕見病在我國并不“罕見”，而SMA又屬于罕見病中的常見病。中國目前已有SMA患者近3萬例，根據(jù)每年大約1 600萬的新生兒出生計(jì)算，每年新增SMA患兒1 700～2 800例。近年來，隨著更多基因治療藥物的普及，為SMA患者和家庭帶來了新的選擇，國家對(duì)SMA的關(guān)注也逐漸提高，先后出臺(tái)多個(gè)專家共識(shí)和指南對(duì)SMA的篩查、診斷及治療作出了明確指導(dǎo)[9-11]。

本研究對(duì)13 478例孕婦進(jìn)行SMA篩查的宣教，有1 163例自愿接受篩查，接受率為8.62%。這是貴陽地區(qū)首次大樣本量的SMA攜帶者篩查，但接受率低于國內(nèi)大部分地區(qū)，2021年江蘇地區(qū)的接受率為34.90%，10年前臺(tái)灣地區(qū)報(bào)道的接受率為10.60%[12-13]，究其原因可能是本地區(qū)人群對(duì)遺傳性疾病認(rèn)識(shí)程度較低，缺乏疾病相關(guān)知識(shí)的科普，未能引起人們的普遍重視。在接受篩查的孕婦中檢出26例SMA攜帶者，攜帶率為1/45，與其他研究結(jié)果一致[14]。經(jīng)遺傳咨詢，12例攜帶者的配偶自愿接受SMA篩查，接受率為46.15%，由此可見，加強(qiáng)SMA攜帶者篩查和遺傳咨詢有利于提高人群接受程度。目前，貴陽地區(qū)在SMA的研究方面僅有少數(shù)醫(yī)院為已懷孕婦女提供SMA的攜帶者篩查，較少有基因診斷方面的研究。因此，為有效控制貴陽地區(qū)SMA患兒的出生，提高人口素質(zhì)，減輕家庭及社會(huì)的負(fù)擔(dān)，有必要在貴陽地區(qū)建立完善的基因診斷方法，健全產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷流程，為全面開展SMA的防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

在中南大學(xué)的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，“2+0”“1+1D”和“2+1D”3種基因型攜帶者占SMA攜帶者的7.5%，另外還有1.7%的新發(fā)突變[15]。因此，進(jìn)行完善的遺傳咨詢、全面的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及建立有效的基因檢測(cè)體系十分關(guān)鍵。①通過宣教使備孕或已孕女性了解SMA的臨床表現(xiàn)和嚴(yán)重程度，提高篩查接受度；②簽署知情同意書，告知檢測(cè)目的、方法及局限性，自愿接受篩查；③根據(jù)篩查結(jié)果，對(duì)攜帶者的配偶進(jìn)行SMA篩查；④為高風(fēng)險(xiǎn)夫婦提供產(chǎn)前基因診斷和生育指導(dǎo)，并對(duì)篩查結(jié)果為陰性的受檢者進(jìn)行殘余風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估；⑤開展新生兒篩查，促進(jìn)SMA的早期診斷和治療，爭(zhēng)取更好的臨床結(jié)局。