楊 滴

（大連市檢驗檢測認證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧大連 116600）

單核細胞增生李斯特氏菌屬李斯特氏菌屬，是人類常見的食源性致病菌，該菌廣泛存在于自然界，很容易污染食品。其中，肉制品、奶與奶制品、水產(chǎn)品、蔬菜等更容易受單核細胞增生李斯特氏菌污染[1]。單核細胞增生李斯特氏菌具有較強的致病性、抗逆襲性，即使在較低的冷藏溫度下仍可以繁殖，極易感染孕婦、嬰兒、老年人及免疫力低下者，感染后可引起敗血癥、腸胃炎、腦膜炎、孕婦流產(chǎn)等[2-6]。食品安全國家標準對其限量進行了嚴格的規(guī)定[7]，同時食品檢驗機構(gòu)的單核細胞增生李斯特菌的檢出能力也是評價其技術(shù)能力的重要指標。

能力驗證是評價實驗室檢測能力的重要手段，參加能力驗證活動既可加強各實驗室間的技術(shù)交流，又可提高其檢測能力和水平[8-9]。為驗證本實驗室食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測能力保持情況，參加中國食品藥品檢定研究院組織的食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢測能力驗證，同時使用常規(guī)培養(yǎng)法、全自動酶聯(lián)免疫熒光分析儀法和實時熒光PCR法3種方法對樣品進行檢測分析，現(xiàn)將本次能力驗證的過程、結(jié)果以及其中采用的操作進行總結(jié)分析，以期能夠更好地指導(dǎo)今后的檢驗工作。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

中國食品藥品檢定研究院組織實施食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢測能力驗證，組織方提供兩個待測樣品，編號分別為CODE034和CODE164，每個樣品由真空包裝于西林瓶的白色菌球和25 g奶粉組成。

李氏增菌肉湯（LB1、LB2）、PALCAM瓊脂、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、木糖發(fā)酵管和鼠李糖發(fā)酵管等相關(guān)配套試劑為北京陸橋技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；VIDAS單核細胞增生李斯特氏菌酶聯(lián)免疫試劑盒、VITEK 2 COMPACT革蘭氏陽性細菌鑒定卡、Half-FRASER肉湯和FRASER肉湯為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品；單核細胞增生李斯特氏菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）和細菌基因組DNA快速提取試劑盒為廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器

LRH-250型生化培養(yǎng)箱；VITEK 2 COMPACT全自動微生物鑒定儀；VIDAS 30全自動熒光免疫分析儀；QS7 Flex實時熒光定量PCR儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 常規(guī)培養(yǎng)法

根據(jù)食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢測能力驗證參試指導(dǎo)書要求，開啟西林瓶，將白色菌球和25 g奶粉加入到225 mL李氏增菌肉湯LB1中。增菌、分離、鑒定步驟依據(jù)《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》（GB 4789.30—2016）第一法[10]。LB1肉湯于30 ℃培養(yǎng)24 h后，取0.1 mL LB1增菌液轉(zhuǎn)種于10 mL LB2肉湯中，于30 ℃培養(yǎng)24 h。取LB2增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板上，36 ℃培養(yǎng)18 h。典型單核細胞增生李斯特氏菌菌落在李斯特氏菌顯色平板上的典型菌落特征為藍綠色菌落、周圍有白色暈圈；在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈；在PALCAM瓊脂平板和李斯特氏菌顯色平板上分別挑取5個典型菌落，將其分別接種于木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于36 ℃培養(yǎng)24 h，同時在TSA-YE平板上劃線，于36 ℃培養(yǎng)24 h，然后選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進行鑒定。疑似菌株采用VITEK 2 COMPACT全自動微生物鑒定儀進行鑒定。

1.3.2 全自動酶聯(lián)免疫熒光分析儀法

按照《食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細胞增生李斯特氏菌的快速篩選檢驗 酶聯(lián)免疫法》（GB/T 22429—2008）[11]規(guī)定的步驟及試劑盒說明進行實驗，取1.3.1中LB1增菌液25 mL，加入225 mL Half-FRASER肉湯增菌液中，30 ℃培養(yǎng)24 h，移取1 mL增菌液轉(zhuǎn)種于10 mL FRASER肉湯中，30 ℃培養(yǎng)24 h。取1 mL FRASER肉湯中增菌液到滅菌小試管中，于沸水中加熱15 min，取0.5 mL熱處理后的增菌液加入到酶聯(lián)免疫試劑盒的測試孔中，進行酶聯(lián)免疫反應(yīng)后，通過VIDAS 30全自動熒光免疫分析儀檢測樣本反應(yīng)值，同時與陽性標準品反應(yīng)值比較，判定檢測結(jié)果。

1.3.3 實時熒光PCR檢測法

取1.3.1中LB1增菌液1 mL于1.5 mL離心管中，12 000 r·min-1離心5 min，棄上清；向沉淀中加入100 μL細菌基因組DNA快速提取試劑盒中的裂解液，漩渦振蕩10 s，沸水浴5 min，12 000 r·min-1離心5 min，吸取上清，獲得樣品DNA。

按照單核細胞增生李斯特氏菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）中說明書要求，取試劑盒中A-LM-P預(yù)混液20 μL，加入5 μL DNA模板，構(gòu)建25 μL實時熒光PCR反應(yīng)體系。實時熒光PCR反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性3 min，然后進入循環(huán)反應(yīng)，即94 ℃變性5 s、60 ℃退火和延伸40 s，共40個循環(huán)。熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇TAMRA。實時熒光PCR反應(yīng)同時設(shè)置陽性對照和陰性對照，收集熒光信號，根據(jù)樣品PCR反應(yīng)的Ct值及擴增曲線分析實驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)培養(yǎng)法檢測結(jié)果

CODE034、CODE164兩個樣品在LB1和LB2增菌液中培養(yǎng)后，培養(yǎng)物呈渾濁狀態(tài)，表明樣品中的微生物在培養(yǎng)基中有生長。LB2增菌液劃線分離后，CODE034樣品在PALCAM瓊脂平板和李斯特氏菌顯色平板上均有典型菌落；CODE164樣品在李斯特氏菌顯色平板上無典型菌落。挑取2個樣品的典型菌落接種于木糖發(fā)酵管、鼠李糖發(fā)酵管進行培養(yǎng)。結(jié)果顯示，CODE034、CODE164兩個樣品的木糖陰性、鼠李糖陽性。在溶血實驗中，CODE034有溶血圈、CODE164無溶血圈；典型菌落在TSA-YE平板純化后，在VITEK 2 COMPACT全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行鑒定，實驗結(jié)果見表1和表2。

表1 生化反應(yīng)實驗結(jié)果

表2 全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果

2.2 全自動酶聯(lián)免疫熒光分析儀法檢測結(jié)果

依據(jù)試劑盒判定原則，陽性參照值為0.05，若檢測結(jié)果值≥0.05，結(jié)論判定為陽性，檢測結(jié)果值＜0.05，結(jié)論判定為陰性。由表3可知，CODE034樣品單核細胞增生李斯特氏菌檢測陽性，CODE164樣品單核細胞增生李斯特氏菌檢測陰性。

表3 單核細胞增生李斯特氏菌VIDAS檢測結(jié)果

2.3 實時熒光PCR法檢測結(jié)果

以單核細胞增生李斯特氏菌標準菌株為陽性對照、金黃色葡萄球菌標準菌株為陰性對照，同CODE034、CODE164兩個樣品進行實時熒光PCR反應(yīng)。依據(jù)試劑盒判定原則，即樣品檢測Ct值≤35，判定單核細胞增生李斯特菌陽性；35＜樣品檢測Ct值＜40，建議樣本重做，重做結(jié)果樣品檢測Ct值≥40，判定單核細胞增生李斯特菌陰性，否則判定為單核細胞增生李斯特菌陽性；樣品檢測Ct值≥40，判定單核細胞增生李斯特菌陰性。由圖1可知，CODE034、CODE164、陽性對照、陰性對照的實時熒 光PCR反應(yīng)Ct值分 別 為21.45、undetermined、17.66、undetermined。實驗結(jié)果表明，CODE034樣品中檢出單核細胞增生李斯特氏菌，CODE164未檢出單核細胞增生李斯特氏菌

圖1 CODE034、CODE164實時熒光PCR檢測法檢測結(jié)果圖

3 結(jié)論與討論

單核細胞增生李斯特氏菌常規(guī)培養(yǎng)法是微生物檢驗中傳統(tǒng)生化鑒定方法，其鑒定準確率較高，一般的實驗室都能開展。但對操作人員的操作能力和培養(yǎng)基質(zhì)量性能等要求較高，溶血實驗難度較大，對于經(jīng)驗不足的檢驗員易產(chǎn)生假陽性和漏檢；檢測時間較長，至少需要6 d才能獲得實驗結(jié)果。VITEK 2 COMPACT自動微生物鑒定系統(tǒng)常用于微生物檢測的生化鑒定，是一種可靠的、快速的生化鑒定方法，相較于常規(guī)的培養(yǎng)基生化鑒定能夠基本排除人的能力因素[13]。本次能力驗證CODE034樣品分離得到疑似菌落鑒定為單核細胞增生李斯特氏菌，CODE164樣品分離得到疑似菌落英諾克李斯特氏菌，VITEK 2 COMPACT給出的鑒定概率均為99%，與后期收到的能力驗證結(jié)果一致。

全自動酶聯(lián)免疫熒光分析儀法的檢測時間為2 d，優(yōu)勢較為常規(guī)培養(yǎng)法明顯，檢測結(jié)果亦準確，但設(shè)備、試劑都必須為生物梅里埃公司的產(chǎn)品，價格較貴。同時，構(gòu)建VIDAS法檢測單核細胞增生李斯特氏菌的標準曲線有效期為14 d，需要經(jīng)常性定標。

實時熒光PCR檢測法的最快檢測時間為1 d，相對常規(guī)培養(yǎng)法方便快捷、靈敏度高、準確性好，目前已應(yīng)用到很多的細菌鑒定中，是常規(guī)培養(yǎng)法輔助檢測的首選。其缺點為容易被能力驗證組織者人為添加的死菌干擾，出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。

本次參加食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測能力驗證，后期收到了“滿意”證書，有效地驗證了實驗室的單核細胞增生李斯特氏菌檢測能力，提升了實驗室的檢驗?zāi)芰唾|(zhì)量控制水平。本次能力驗證以常規(guī)培養(yǎng)法為基礎(chǔ)，將免疫學(xué)、分子生物學(xué)等簡便快捷輔助方法相結(jié)合，確保結(jié)果的準確性和快速性。開拓致病菌檢測新思路，為今后微生物檢測的發(fā)展提供了方向。