蒲福龍，伍尚煒，鄭映玲，鄭玉意，侯雪丹

（廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

廢棄木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的高值化利用是實(shí)現(xiàn)國(guó)家“碳達(dá)峰”“碳中和”目標(biāo)的途徑之一，其中生物質(zhì)纖維素的高效水解則是生物質(zhì)成功利用的關(guān)鍵，但是由于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的天然頑固性，使其直接利用較為困難，因此木質(zhì)纖維素在酶解之前通常會(huì)進(jìn)行預(yù)處理，打破其致密的結(jié)構(gòu)、分離生物質(zhì)組分以提高纖維素酶的可及性。常用的預(yù)處理技術(shù)通常有機(jī)械粉碎、稀酸預(yù)處理、堿預(yù)處理和水熱法等，不同的預(yù)處理方法有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。除了尋找更優(yōu)化的預(yù)處理方法，關(guān)于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中關(guān)鍵組分對(duì)纖維素酶解影響的研究也必不可少。一般而言，生物質(zhì)底物中的木質(zhì)素是影響纖維素酶解的主要成分，主要通過兩個(gè)方面阻礙酶解：一方面，木質(zhì)素在物理結(jié)構(gòu)上阻礙酶與纖維素有效接觸而影響酶水解效率；另一方面，木質(zhì)素能非特異性地吸附纖維素酶，并且降低酶的活性從而對(duì)纖維素酶水解產(chǎn)生負(fù)面影響。有研究發(fā)現(xiàn)，水溶性木質(zhì)素對(duì)含木質(zhì)素的底物酶解具有促進(jìn)作用，主要是通過和木質(zhì)素底物對(duì)酶的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合促進(jìn)酶解，這表明，無論是水溶性還是非水溶性木質(zhì)素都與酶進(jìn)行了不同程度的吸附和結(jié)合，所以木質(zhì)素的非特異性吸附對(duì)酶解是一個(gè)很重要的影響因素。眾多研究表明，木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附程度與木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)特性密切相關(guān)。而木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)則主要取決于生物質(zhì)的預(yù)處理方法。不同的生物質(zhì)預(yù)處理獲得的木質(zhì)素內(nèi)酚羥基、脂肪族羥基與羧基的含量存在差異。一般而言，木質(zhì)素中的酚羥基會(huì)與酶形成氫鍵而影響纖維素酶活性，而羧基和脂肪族羥基則會(huì)使木質(zhì)素的疏水性減弱，從而影響酶的催化效率。

深度共熔溶劑（deep eutectic solvents，DES）是一種由氫鍵供體和氫鍵受體組成的可設(shè)計(jì)溶劑，已被用于生物活性萃取、生物催化、金屬加工等各種領(lǐng)域。DES 對(duì)木質(zhì)素優(yōu)良的解聚能力，使其在木質(zhì)纖維素生物質(zhì)預(yù)處理和提取木質(zhì)素方面有很好的應(yīng)用前景。DES 在預(yù)處理過程中提供了酸堿催化體系并主要通過破壞木質(zhì)素中的—O—4醚鍵使木質(zhì)素進(jìn)行解聚，從而使生物質(zhì)組分分離。各種類型的醇類、羧酸類DES對(duì)多種生物質(zhì)原料展現(xiàn)出優(yōu)良的預(yù)處理效率，特別對(duì)木質(zhì)素組分的脫除效果顯著。然而，現(xiàn)有研究對(duì)各類DES提取木質(zhì)素組分的結(jié)構(gòu)性質(zhì)及其對(duì)纖維素酶水解效率影響規(guī)律的認(rèn)識(shí)仍然不足，需要系統(tǒng)地研究以理解溶劑性質(zhì)、木質(zhì)素結(jié)構(gòu)性質(zhì)與多糖酶水解效率之間的關(guān)系。因此，本文以基于乳酸的DES提取水稻秸稈中的4種木質(zhì)素為研究對(duì)象，通過研究木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附特性，結(jié)合木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)特性分析，闡明疏水性作用、氫鍵相互作用和靜電作用在木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附和抑制方面的影響規(guī)律，揭示基于乳酸的DES提取木質(zhì)素對(duì)纖維素酶水解效率的影響機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

水稻秸稈收集于本地農(nóng)田，曬干后經(jīng)機(jī)械粉碎至250～400μm 的粒徑，于60℃烘箱過夜至恒重，密封袋收集并干燥保存；來源于酵母的復(fù)合纖維素酶（Celluclast 1.5L，酶蛋白濃度為37.17mg/mL，濾紙酶活為93.69FPU/mL，含5.63g/L 葡萄糖和1.13g/L木糖），諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司天津分公司；氯化膽堿、乳酸、鹽酸胍、精氨酸、甜菜堿鹽酸鹽、微晶纖維素（Avicel）、檸檬酸、檸檬酸鈉，Aladdin 公司；硫酸、乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DES的制備

將乳酸和各種氫鍵受體按9∶1 摩爾比均勻混合，裝入100mL磨口瓶中，置于一定溫度（乳酸-氯化膽堿、乳酸-鹽酸胍為80℃；乳酸-甜菜堿鹽酸鹽、乳酸-精氨酸為100℃）下攪拌均勻，待呈現(xiàn)均一、澄清、透明狀態(tài)的溶液后停止加熱，然后將獲得的DES[乳酸-氯化膽堿9∶1（LC）、乳酸-鹽酸胍9∶1（LGH）、乳酸-精氨酸9∶1（LArg）、乳酸-甜菜堿鹽酸鹽9∶1（LBH）]裝入帶螺旋口的西林瓶中干燥、密封保存以備用。

1.2.2 木質(zhì)素的提取

將DES與水稻秸稈粉末以10%的固液比混合，于120℃下恒溫?cái)嚢?h（200r/min），隨后加入適量無水乙醇，多次清洗離心分離混合物。收集離心后的醇洗上清液，旋蒸除去無水乙醇，加入3倍體積的水，置于4℃下沉淀48h。離心分離沉淀物，并用去離子水清洗木質(zhì)素沉淀，冷凍干燥后即為DES提取木質(zhì)素。4 種木質(zhì)素樣品分別記為L(zhǎng)ignin-LC（L-LC）、 Lignin-LGH （L-LGH）、 Lignin-LArg（L-LArg）、Lignin-LBH（L-LBH）。

1.2.3 木質(zhì)素對(duì)微晶纖維素酶水解效率的影響

在含4.8mL 的50mmol/L 醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH=4.8）的25mL具塞三角燒瓶中加入100mg微晶纖維素（Avicel），于50℃下預(yù)熱10min后分別加入20mg的L-LC、L-LGH、L-LArg、L-LBH，最后添加200μL 復(fù)合纖維素酶（93.69FPU/mL）啟動(dòng)水解反應(yīng)，恒溫振蕩（150r/min），定時(shí)取樣300μL，于100℃水浴5min滅活終止酶反應(yīng)。以高效液相色譜（HPLC）測(cè)定葡萄糖濃度，以未加木質(zhì)素的酶水解反應(yīng)為對(duì)照。HPLC（安捷倫1260，配有Aminex HPX-87H 色譜柱和示差檢測(cè)器）測(cè)試條件：流動(dòng)相為5mmol/L 硫酸水溶液，流速為0.5mL/min，柱溫、檢測(cè)器溫度分別為65℃和50℃。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，相對(duì)誤差小于5%。

1.2.4 木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附特性

用50mmol/L 的醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH=4.8）作為溶劑配制復(fù)合纖維素酶蛋白溶液（0.02～1.60mg/mL 濃度梯度），然后加入定量的木質(zhì)素使其濃度為4g/L，放置于2mL離心管中并密封。將所有樣品置于4℃下孵育3h（150r/min）后取出，離心（4℃、10000r/min）取上清液，以Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)初始溶液和離心所得上清液中游離酶含量的差異，計(jì)算木質(zhì)素對(duì)酶蛋白的吸附量。結(jié)果符合Langmuir 吸附等溫線，計(jì)算公式如式(1)和式(2)所示。

式中，為木質(zhì)素吸附酶蛋白的量，mg/g木質(zhì)素；為木質(zhì)素最大吸附酶蛋白的量，mg/g 木質(zhì)素；為L(zhǎng)angmuir 常數(shù)，mL/mg 酶；為溶液中游離酶的濃度，mg/mL；為結(jié)合強(qiáng)度。

1.2.5 木質(zhì)素疏水性

通過測(cè)定木質(zhì)素對(duì)疏水性染料孟加拉玫瑰紅的吸附，分析木質(zhì)素表面疏水性。以50mmol/L 的醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH=4.8） 為溶劑配制含40mg/L 的孟加拉玫瑰紅溶液，將其與不同質(zhì)量的木質(zhì)素混合，使木質(zhì)素濃度梯度范圍在2～10g/L，于50℃下孵育2h（150r/min）。低溫離心（10000r/min、10min）后收集上清液，于543nm 處讀取吸光值以測(cè)定游離染料含量。通過孟加拉玫瑰紅的原始含量與游離含量的差異，得到木質(zhì)素表面吸附染料的含量。分配系數(shù)（PQ）計(jì)算方法如式(3)。繪制木質(zhì)素含量與PQ 值的回歸曲線，獲得木質(zhì)素表面疏水性數(shù)據(jù)。

1.2.6 FTIR分析

采用研究型紅外光譜儀對(duì)水稻秸稈和4種木質(zhì)素樣品進(jìn)行紅外分析，所用設(shè)備為Thermo-Fisher Nicolet 6700，波長(zhǎng)范圍為4000～400cm，通過32次掃描以0.48cm的分辨率記錄光譜。

1.2.7 核磁分析

以定量磷譜（P-NMR）測(cè)定木質(zhì)素組分羥基含量。精確稱取40mg 木質(zhì)素樣品，溶解于500μL氘代溶劑中（氘代氯仿∶氘代吡啶=1∶1.6，體積比），然后，向溶液中加入50μL乙酰丙酮鉻溶液（5.6mg/mL）和200μL內(nèi)--羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亞胺（9.23mg/mL）。最后加入100μL磷化試劑（2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧磷烷溶液，TMDP）?；旌?5min 后以Bruker 600MHz（型號(hào)為AV600）核磁共振儀測(cè)定，采用TopSpin2.0軟件處理數(shù)據(jù)，通過積分面積計(jì)算樣品中酚羥基、醇羥基和羧基的含量。

以二維異核碳?xì)湎嚓P(guān)譜（2D HSQC NMR）分析木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，參照本文作者課題組以前的測(cè)試條件并作部分修改。將120mg 木質(zhì)素樣品溶解于1.2mL 的DMSO-d中后轉(zhuǎn)移至核磁管，采用Bruker 600MHz 核磁波譜儀進(jìn)行測(cè)量，溶劑峰DMSO-d作為內(nèi)標(biāo)峰（C/H，39.5/2.49）進(jìn)行校正。

2 結(jié)果與討論

2.1 木質(zhì)素對(duì)微晶纖維素酶水解效率的影響

由于特殊的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的抑制作用普遍存在。遺憾的是，現(xiàn)有研究對(duì)DES 溶解木質(zhì)素影響纖維素酶活性的規(guī)律仍認(rèn)識(shí)不足。因而，本文首先以不添加木質(zhì)素的纖維素酶水解微晶纖維素反應(yīng)為對(duì)照，考察4 種木質(zhì)素（L-LC、LLGH、L-LArg、L-LBH）的添加對(duì)微晶纖維素酶水解效率的影響，結(jié)果如圖1所示。木質(zhì)素的添加降低了微晶纖維素的酶水解效率，在水解28h 后，木質(zhì)素對(duì)酶水解的抑制作用大小順序?yàn)椋篖-LC＞L-LGH＞L-LArg＞L-LBH。具體而言，L-LC 組的木質(zhì)素添加使葡萄糖的釋放量相對(duì)于對(duì)照組降低了14.7%，而L-LGH 使葡萄糖的釋放量降低較少（4.5%）?？梢?，不同的DES 提取的木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的抑制作用存在明顯的差異性。

圖1 微晶纖維素酶水解過程曲線

本文所用的4種基于乳酸的DES中，氯化膽堿作為氫鍵受體的研究最為普遍，已有研究表明其在溶解和提取木質(zhì)素中表現(xiàn)出優(yōu)良的性能，并有報(bào)道指出氯化膽堿在作用過程中與氫鍵受體之間的協(xié)同作用機(jī)制，即Cl通過離子相互作用而破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中的—O—4醚鍵而提取木質(zhì)素。而甜菜堿鹽酸鹽與氯化膽堿比較接近，但其結(jié)構(gòu)中含有羧基，疏水性比氯化膽堿弱，提取疏水性的木質(zhì)素的能力則相對(duì)稍弱。當(dāng)鹽酸胍作為氫鍵受體時(shí)，其對(duì)生物質(zhì)的作用能力也較強(qiáng)，原因是其強(qiáng)酸性和其與乳酸供體間的優(yōu)良協(xié)同效應(yīng)?？梢?，木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)性質(zhì)對(duì)其抑制纖維素酶的作用效力影響較大，木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附作用主要源于疏水作用、靜電作用和氫鍵作用的綜合情況。因而，需要進(jìn)一步探究這4種DES提取的木質(zhì)素對(duì)纖維素酶吸附能力，以分析其對(duì)纖維素酶抑制強(qiáng)弱的原因。

2.2 木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附性

眾多研究表明，纖維素底物中木質(zhì)素可通過對(duì)纖維素酶的非特異性吸附而影響酶催化效率，為了研究DES 所提取出的木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附能力和吸附量，繪制了纖維素酶在L-LC、L-LGH、L-LArg和L-LBH上的Langmuir吸附等溫線，如圖2所示。根據(jù)吸附等溫線，分別計(jì)算了纖維素酶的最大吸附量、Langmuir 親和吸附常數(shù)和結(jié)合強(qiáng)度（表1）。結(jié)果顯示纖維素酶在4種木質(zhì)素上的吸附特性符合Langmuir 等溫線模型，纖維素酶在木質(zhì)素上的最大吸附量具有明顯的差異，如LC提取的木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的最大吸附量最大，為46.35mg/g；吸附量最小的為L(zhǎng)Arg，僅4.52mg/g。而LGH 和LBH 提取的木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的最大吸附量比較接近，前者稍高。

圖2 木質(zhì)素對(duì)纖維素酶蛋白的Langmuir吸附作用

表1 Langmuir吸附等溫線參數(shù)

結(jié)合強(qiáng)度代表了木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的總體吸附強(qiáng)度，其強(qiáng)弱規(guī)律與最大吸附量基本一致，除了L-LGH的結(jié)合強(qiáng)度比L-LC相對(duì)稍高。而吸附平衡常數(shù)代表結(jié)合親和力的大小，除了L-LArg外，3種木質(zhì)素顯示的規(guī)律性與最大吸附量和吸附強(qiáng)度趨勢(shì)基本一致，且這3種木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附能力與微晶纖維素酶水解效率呈負(fù)線性相關(guān)性（圖3），即吸附能力越強(qiáng)、吸附量越大，微晶纖維素的酶解效率越低，也說明木質(zhì)素對(duì)酶的吸附能力越大，其對(duì)酶的抑制作用越明顯。Wang 等也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象：乙酸提取楊木木質(zhì)素比球磨木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附量大，前者比后者對(duì)酶水解的抑制作用則更強(qiáng)。在Yao等關(guān)于木質(zhì)素對(duì)纖維素酶作用機(jī)制研究中，也證實(shí)了木質(zhì)素對(duì)纖維素酶水解的抑制作用與其對(duì)纖維素酶吸附能力正相關(guān)，并提出非特異性吸附是影響纖維素酶水解效率的主要因素。

圖3 最大酶吸附量與微晶纖維素酶水解效率的關(guān)系

因此，就本文而言，3種木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的抑制程度大小為L(zhǎng)-LC＞L-LGH＞L-LBH，與其對(duì)纖維素的吸附能力大小規(guī)律基本相同。相比之下LLArg 組比較特殊，不符合這一規(guī)律。為進(jìn)一步解釋該現(xiàn)象，測(cè)定了各DES 提取木質(zhì)素的組成成分，發(fā)現(xiàn)其他3 種木質(zhì)素的純度均為85%以上，而LLArg 提取的木質(zhì)素含量?jī)H55%（含11%的纖維素）。所以L-LArg對(duì)纖維素酶的吸附強(qiáng)度和最大吸附量較低的原因可能是是粗木質(zhì)素樣品中纖維素含量較高。同時(shí)，因?yàn)槠渲泻写罅康睦w維素組分，纖維素酶的底物結(jié)合域則與其天然底物纖維素組分有較強(qiáng)的親和力，因而L-LArg 顯示了最強(qiáng)的酶結(jié)合親和力。由于天然的結(jié)合趨勢(shì)對(duì)微晶纖維素的酶水解作用起促進(jìn)作用，導(dǎo)致L-LArg 對(duì)酶解效率的抑制作用相對(duì)較弱。

2.3 木質(zhì)素的疏水性對(duì)纖維素酶吸附作用的影響

從吸附性研究結(jié)果可知，木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附很大程度上是抑制微晶纖維素酶水解的主要原因。如前文所述，木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附作用包括疏水作用、靜電作用和氫鍵作用。其中，疏水相互作用被認(rèn)為是影響纖維素酶吸附非常重要的因素，如Sakkos 等研究結(jié)果證明，疏水性越強(qiáng)的底物對(duì)纖維素酶的吸附親和性越強(qiáng)。本研究中討論的4種DES提取的木質(zhì)素疏水性大小順序?yàn)椋篖LArg＞L-LC＞L-LHG＞L-LBH（表2）。除L-LArg外，其余3種DES提取的木質(zhì)素的疏水性大小與其最大纖維素酶吸附規(guī)律一致。由于纖維素酶具有疏水性，因此木質(zhì)素疏水性越大，相應(yīng)的吸附纖維素酶的量越多，對(duì)纖維素酶水解效率的抑制程度也越大。因而木質(zhì)素疏水性與最大酶蛋白吸附量呈現(xiàn)明顯的正線性相關(guān)性，且相關(guān)性較高（圖4）。在利用對(duì)甲苯磺酸提取的甘蔗渣木質(zhì)素對(duì)纖維素酶吸附性研究中，同樣發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素疏水性與纖維素酶的吸附性的正相關(guān)性。Song等研究DES（LC）提取柳樹、玉米稈木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的抑制作用時(shí)，也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。L-LArg 木質(zhì)素的疏水性大的原因可能是大量的結(jié)晶纖維素組分殘留，纖維素內(nèi)部較為緊密牢固的氫鍵網(wǎng)絡(luò)使其疏水性較大。這種疏水性區(qū)域是纖維素酶的天然底物，即使其與纖維素酶結(jié)合，也不會(huì)體現(xiàn)較強(qiáng)的抑制作用。因此，即使L-LArg 疏水作用最大，其對(duì)纖維素酶的最大吸附量最小，因而對(duì)纖維素酶的抑制作用也最小。

表2 木質(zhì)素疏水性數(shù)據(jù)

圖4 木質(zhì)素對(duì)酶蛋白的最大吸附量與木質(zhì)素疏水性的關(guān)系

2.4 氫鍵作用對(duì)纖維素酶抑制效應(yīng)的影響

為了進(jìn)一步探究DES 提取木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的抑制作用機(jī)制，本文通過解析木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)性質(zhì)（紅外光譜、P-NMR、HSQC）以深入探究木質(zhì)素結(jié)構(gòu)性質(zhì)，尤其是氫鍵、靜電相互作用對(duì)纖維素酶的抑制效應(yīng)的影響。首先，紅外光譜（圖5）顯示木質(zhì)素的特征峰在1605cm、1423cm和1514cm處，為芳環(huán)骨架碳碳鍵的拉伸振動(dòng)峰，所有木質(zhì)素樣品均在此處出現(xiàn)譜帶，但L-LArg 的譜帶明顯弱于其他三個(gè)，說明4種DES提取木質(zhì)素已具備基本骨架結(jié)構(gòu)，但L-LArg 中木質(zhì)素純度較其他3 種相對(duì)較低。3360cm處峰為木質(zhì)素分子中的羥基伸縮振動(dòng)，說明木質(zhì)素中含有豐富的酚羥基基團(tuán)。而L-LC和L-LGH表現(xiàn)出更強(qiáng)的譜帶，說明這兩種木質(zhì)素中含有更多的羥基基團(tuán)。推測(cè)在較為強(qiáng)烈的DES預(yù)處理?xiàng)l件下（L-LC、L-LGH實(shí)驗(yàn)組），木質(zhì)素中更多的酚亞結(jié)構(gòu)被釋放出來，因而更易與纖維素酶形成氫鍵相互作用。2930cm和2860cm處為脂肪鏈和O—CH基團(tuán)中的CH—伸縮振動(dòng)峰，LLArg 在2860cm處表現(xiàn)出明顯較弱的譜帶，說明L-LArg 在DES 提取過程中損失的甲氧基較多，而另外3 種木質(zhì)素的甲氧基保留相對(duì)較多。在2930cm處，4 種木質(zhì)素均顯示較強(qiáng)譜帶，證明脂肪鏈發(fā)生的斷裂較少。所有木質(zhì)素均在1740cm和1220cm處有明顯的譜帶，證明木質(zhì)素中有羧基存在。據(jù)報(bào)道，羧基通過削弱疏水相互作用而阻礙酶在木質(zhì)素上的吸附，同時(shí)由于許多纖維素酶組分因其等電點(diǎn)而表現(xiàn)出的總負(fù)電荷而加強(qiáng)靜電斥力。然而，添加木質(zhì)素仍然會(huì)導(dǎo)致纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附，這證實(shí)靜電斥力不足以對(duì)抗纖維素酶和木質(zhì)素組分之間的疏水作用而形成的氫鍵。

圖5 木質(zhì)素的紅外光譜

2D HSQC NMR譜圖（圖6）顯示了4種木質(zhì)素的基本骨架結(jié)構(gòu)，在側(cè)鏈區(qū)[圖6(a)]可以觀察到較強(qiáng)的甲氧基信號(hào)峰。很明顯，L-LArg 的所有峰信號(hào)均弱于其他3種木質(zhì)素，這說明LArg的預(yù)處理強(qiáng)度最弱，對(duì)木質(zhì)素的提取能力最弱，這與L-LArg最低的木質(zhì)素得率（3.7%）所反映的規(guī)律一致?！狾—4 和—對(duì)應(yīng)的信號(hào)峰（A 和C）雖然都能檢出，但是峰強(qiáng)度均較弱，這說明了4種DES在實(shí)驗(yàn)的木質(zhì)素提取環(huán)境下對(duì)—O—4 和—的破壞程度都較高，4種木質(zhì)素中L-LBH的—O—4和—保留最多。對(duì)于-5 的峰信號(hào)（B），僅在L-LC 和L-LBH的譜圖中檢出，而L-LGH和L-LArg中的-5均被破壞。另外，除了L-LArg外，其他3種木質(zhì)素中阿拉伯糖單元（Ara）的信號(hào)均被檢測(cè)到，說明LC、LGH、LBH在提取木質(zhì)素的同時(shí)也提取了一定量的阿拉伯糖。L-LGH 和L-LBH 譜圖中的少量木糖單元信號(hào)峰說明LGH和LBH對(duì)木糖有輕微的提取作用。芳香區(qū)譜圖的規(guī)律與側(cè)鏈區(qū)基本一致，S、G和H結(jié)構(gòu)均能被很好地檢測(cè)到，說明4種木質(zhì)素中均含有S、G、H結(jié)構(gòu)。而且峰強(qiáng)度大小排序?yàn)長(zhǎng)LC＞L-LGH＞L-LBH＞L-LArg，這基本印證了前面所提到的木質(zhì)素對(duì)酶抑制程度大小排序的大致規(guī)律。

圖6 木質(zhì)素的HSQC圖譜

P-NMR 結(jié)果表明（圖7）4 種DES 木質(zhì)素酚羥基含量和總羥基含量與其對(duì)纖維素酶的吸附能力之間有明顯的線性相關(guān)性，兩者含量越高，其對(duì)酶蛋白的吸附量越大。例如，L-LC 的酚羥基含量最大，為3.37mmol/g，所以也最大，為46.35mg/g；L-LArg的酚羥基含量最小，為0.966mmol/g，也最低（4.52mg/g）；L-LGH 與L-LBH 的酚羥基含量接近，所以值也接近。此外，除了L-LArg 外，羥基含量與微晶纖維素酶水解效率線性負(fù)相關(guān)，即羥基含量越高、酶水解效率越低。L-LC 含有的脂肪族羥基、酚羥基和總羥基含量明顯高于其他3種木質(zhì)素，說明L-LC 更易與纖維素酶形成氫鍵結(jié)構(gòu)，從而影響纖維素酶的水解活性。對(duì)于脂肪族羥基，含量的多少與纖維素酶的吸附量規(guī)律一致，該規(guī)律與纖維素酶水解的抑制程度大小相同（LLArg除外），即脂肪族羥基含量越高，越易促進(jìn)木質(zhì)素與纖維素酶相互作用，對(duì)酶的抑制作用則越強(qiáng)。酚羥基的含量，與脂肪族羥基規(guī)律存在差異（羥基含量L-LC＞L-LBH＞L-LGH＞L-LArg）。由于LBH提取的木質(zhì)素中纖維素含量（1.44%）低于LLGH 提取的木質(zhì)素（4.03%），因而，其對(duì)木質(zhì)素與碳水化合物連接鍵的破壞程度相對(duì)較多，酚羥基含量更高?？偭u基含量是脂肪族羥基和酚羥基之和，4種木質(zhì)素的總酚羥基含量基本上反應(yīng)了DES的木質(zhì)素提取作用程度，即L-LC＞L-LBH＞L-LGH＞L-LArg，這體現(xiàn)了4種木質(zhì)素與纖維素酶之間的氫鍵作用強(qiáng)弱規(guī)律。總體來說，木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附作用大小，氫鍵作用僅是影響因素之一。

圖7 羥基含量與酶解效率、酶蛋白最大吸附量的關(guān)聯(lián)圖

2.5 靜電作用對(duì)纖維素酶抑制作用的影響

除了氫鍵相互作用，木質(zhì)素與纖維素酶之間的靜電相互作用也是影響兩者之間吸附能力以及酶水解抑制程度的一項(xiàng)因素。有報(bào)道指出分離木質(zhì)素中的羧基含量隨著預(yù)處理程度的增加而增加，部分原因是木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合物中酯鍵的斷裂，從而釋放了羧基官能團(tuán)。本研究中，4 種木質(zhì)素的羧基含量與酶蛋白吸附量、纖維素酶水解效率之間并無明顯相關(guān)性（圖8）。羧基含量最高的為L(zhǎng)-LC，L-LBH 次之，L-LGH 最低，這3 種木質(zhì)素羧基含量與總酚羥基含量大小一致，基本上符合預(yù)處理強(qiáng)度越大形成的羧基含量越多的規(guī)律。此外，羧基易在酶反應(yīng)體系解離，從而使木質(zhì)素帶負(fù)電荷。文獻(xiàn)表明，纖維素酶也帶有負(fù)電荷，帶負(fù)電的木質(zhì)素易與纖維素酶形成靜電斥力，從而降低木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附量。然而本文中的幾種木質(zhì)素的羧基總體含量不高，羧基產(chǎn)生的靜電斥力不足以消除更強(qiáng)的疏水相互作用和氫鍵相互作用力。所以，疏水相互作用和氫鍵相互作用主要決定了木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附力及抑制作用大小，該結(jié)論與Song 等在研究對(duì)苯甲磺酸提取的木質(zhì)素對(duì)纖維素酶吸附作用時(shí)的結(jié)果一致。

圖8 羧基含量對(duì)酶解效率、木質(zhì)素疏水性和木質(zhì)素對(duì)酶蛋白的最大吸附量的影響

3 結(jié)論

（1）由木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附性研究結(jié)果可知，4 種DES 提取木質(zhì)素的吸附特性曲線符合Langmuir等溫曲線模型，且木質(zhì)素對(duì)酶蛋白的吸附性越強(qiáng)，其對(duì)酶的抑制效應(yīng)也越大。

（2）木質(zhì)素疏水性與酶蛋白的吸附性能也有高度的線性正相關(guān)性，即疏水性越大，其對(duì)酶蛋白吸附能力越強(qiáng)，纖維酶水解效率則越低。

（3）木質(zhì)素的基本結(jié)構(gòu)性質(zhì)分析表明DES 提取強(qiáng)度越大，木質(zhì)素產(chǎn)生的（脂肪、酚）羥基含量和羧基含量越高，與酶蛋白的氫鍵作用則越強(qiáng)，因而對(duì)纖維素酶水解效率的抑制程度越大。

（4）羧基的靜電斥力效應(yīng)雖可削弱吸附作用，但對(duì)總體的酶蛋白吸附和活性抑制程度影響較小。

（5）4種DES對(duì)木質(zhì)素的提取能力和結(jié)構(gòu)破壞作用能力最強(qiáng)的是LC，LGH 和LBH 基本相當(dāng)，LArg 最弱，說明氯化膽堿作為氫鍵受體易于與乳酸氫鍵供體協(xié)同作用，以更好地破壞木質(zhì)素和碳水化合之間的連接鍵、木質(zhì)素的—O—4鍵，而關(guān)于這4種DES的氫鍵受體在木質(zhì)素提取過程中作用機(jī)制的差異性有待進(jìn)一步深入探究。