郭 真，陳倩倩，陸 星，田 江，彭桂香，梁翠月

(華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院/根系生物學研究中心，廣東廣州 510642)

隨著人口的增加，人們對農(nóng)產(chǎn)品安全及產(chǎn)量的需求也逐漸加大?；首鳛檗r(nóng)業(yè)生產(chǎn)的基礎，在促進糧食增產(chǎn)方面起著至關重要的作用，但近幾十年來肥料的過量施用已導致我國農(nóng)業(yè)投入產(chǎn)出比明顯降低，甚至造成農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的嚴重污染。為了維持農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，人們對新型農(nóng)用肥料的需求呈上升趨勢。而微生物在土壤改良和農(nóng)作物增產(chǎn)等方面的重要作用已逐漸為人們所認識。目前，利用促生菌、根瘤菌、菌根真菌等有益微生物作為主體的新興微生物肥料，已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到廣泛應用，在推動我國綠色農(nóng)業(yè)方面發(fā)揮不可估量的作用。

其中，促生菌(plant growth-promoting bacteria，PGPB)是一類通過復雜的直接或間接機制促進植物生長發(fā)育、防治病蟲害的一類微生物，促生菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上能夠活化土壤養(yǎng)分，幫助作物抵御疾病，促進作物的生長繁殖，其作用機理主要包括調節(jié)植物激素(如產(chǎn)ACC脫氨酶、分泌吲哚乙酸、赤霉素等)，活化土壤養(yǎng)分(溶磷、解鉀以及固氮)，調控次生代謝物的釋放以及病原體的防治等。目前發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌、青霉菌、假單孢菌及根瘤菌屬等均有促進植物生長的作用。其中芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上是利用較多的一類促生菌。Azaroual等研究發(fā)現(xiàn)，在小麥根際接種2種不同的芽孢桿菌，均能有效溶解土壤中的難溶性磷，提高了小麥對磷的利用，從而促進其生長發(fā)育。劉魯峰等發(fā)現(xiàn)在根際接種內生枯草芽孢桿菌后，甘蔗的根系長度、活力和生物量等指標均顯著高于不接種對照 。這些研究表明，某些芽孢桿菌能夠顯著促進植物生長，且其對植物的促生作用機理不同。因此，解析芽孢桿菌促進植物生長的機理對于充分利用芽孢桿菌資源具有重要指導意義。

20世紀80年代以來，我國微生物肥料產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，規(guī)模逐漸增加，工業(yè)化及生產(chǎn)水平不斷提高，推廣應用范圍也在逐步擴大，但也存在如微生物資源保存數(shù)量不足、機理研究工作不充分、有益微生物開發(fā)利用率低等問題。因此，筆者從不同土壤篩選出3株芽孢桿菌，研究這3株菌株的促生和解磷功能，為農(nóng)用微生物肥料的開發(fā)提供重要的菌種資源。

1 材料與方法

從廣東省湛江市(32°98′48.46″E、114°35′44.05″N)水稻土中分離了一株芽孢桿菌，將其命名為RL1；從貴州省興義市(104°54′13.02″ E、24°58′17.44″ N)大豆根際土壤中分離了2株芽孢桿菌，分別命名為Y26和P90。

挑取單克隆于裝有液體LB培養(yǎng)基的2 mL離心管中，在搖床中28 ℃ 180 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期，吸取2 L菌液于LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中28 ℃下培養(yǎng)，并分別在24、48、72 h對其拍照。

將目標菌株活化后，挑取單克隆，用無菌水將其稀釋成菌懸液備用。吸取10 L菌懸液滴將其固定在潔凈的載玻片中央，在干燥后的菌膜上滴加結晶紫染色液，染色1 min后，用無菌水清洗多余的染色液；然后滴加碘液染色1 min，再用清水清洗多余染色液；加95%乙醇，搖動玻片脫色20～60 s，吸去多余水分，滴加番紅染液復染1 min，用水清洗，吸去多余水分，用油鏡觀察菌體顏色及形態(tài)。

微生物DNA的提取按照細菌DNA提取試劑盒所示方法提取(Omega D3350 Bacterial DNA Kit)。以上述步驟提取的DNA為模板，用PCR反應引物進行擴增。上游引物序列：5′-GTTTGATCMTGGCTCAG-3′；下游引物序列：5′-TACGGYTACCTT GTT ACGACTT -3′。PCR反應條件：94 ℃保持3 min；94 ℃ 0.5 min，54 ℃ 0.5 min，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃保持7 min。

取5 μL PCR產(chǎn)物到 1%瓊脂糖凝膠上電泳約20 min，將清晰條帶送至天一輝遠生物科技有限公司(廣州)測序，所得序列在NCBI blast(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和LPSN基因庫(https：//bacterio.net/)數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸序列比對，獲得其同源性較高的序列，然后用MEGA 5.2軟件對這些序列進行分析，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

對菌株的解磷能力進行了定性和定量測定。定性試驗：活化目標菌株后，挑取單克隆于1 mL液體LB培養(yǎng)基，在搖床中28 ℃、180 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用移液槍吸取2 μL不同濃度(1、10、10和10)菌液于無機磷固體培養(yǎng)基，在28 ℃培養(yǎng)21 d后拍照觀察溶磷圈。定量試驗：吸取1%的菌液在50 mL無機磷培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)21 d，每3 d吸取2 mL含菌液的液體培養(yǎng)基，5 000 r/min離心3 min，取上清液用鉬藍比色法測定可溶性磷含量。對照試驗CK為不加菌液的處理，每個處理設4個重復。

對菌株的產(chǎn)酸能力進行了定性和定量測定。在定性試驗中，取單克隆接種于1 mL 液體LB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將其稀釋4個倍數(shù)(1、10、10、10)，并吸取2 μL不同濃度的菌液于固體PVK改良培養(yǎng)基表面，在28 ℃中培養(yǎng)4、5和6 d后拍照。定量試驗中，取單克隆接種于1 mL液體LB培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期，吸取1%的菌液接種于50 mL無機磷培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)15 d，每3 d吸取2 mL的上清液，測定pH。對照試驗CK為不加菌液的處理，每個處理4個重復。

挑取單克隆接種于1 mL液體LB培養(yǎng)基，在搖床中28 ℃、180 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，吸取1%的菌液接種至50 mL King液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)9 d，吸取菌液，5 000 r/min離心3 min，取1 mL上清液于2 mL離心管，并加入1 mL的salkowski比色液，在黑暗中靜置30 min，在530 nm波長下測定吸光值。以純吲哚-3-乙酸制作標準曲線，計算培養(yǎng)基中的吲哚-3-乙酸含量。對照試驗CK為不加菌液的處理，每個處理4個重復。

對菌株進行淀粉水解能力和3-酮基乳糖反應等性質的鑒定。在淀粉水解能力鑒定試驗中，吸取2 μL菌液接種于可溶性淀粉固體培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，在培養(yǎng)基平板上滴加2 mL碘液，觀察菌落周圍顏色。3-酮基乳糖反應試驗中，吸取2 μL菌液接種于乳糖酵母固體培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后加入本尼迪克特試劑，于室溫下放置1 h，觀察菌株周圍的黃色或磚紅色氧化亞銅沉淀。

采用泥炭土培養(yǎng)方法，以大豆基因型YC03-3為植物材料，在正常磷和鈣磷條件下設置促生菌添加試驗和對照試驗，每個處理設置5個重復。其中，正常磷處理以磷酸二氫鉀為磷源，鈣磷處理以磷酸三鈣為磷源，磷濃度均為0.03 mg/g(磷酸二氫鉀和磷酸三鈣以基肥施入)。

將基質和蛭石按照3∶1重量混勻，添加Hogland’s無磷營養(yǎng)液(pH 5.8)至濕潤狀態(tài)，充分混勻，裝盆。挑選大小一致的大豆種子，氯氣熏蒸法滅菌后，每盆播種3顆種子，播種7 d后間苗，每盆保證1棵植株，種植期間依據(jù)基質干濕程度定量澆蒸餾水，每3 d等量澆一次Hogland’s無磷營養(yǎng)液。將目標芽孢桿菌接種于液體LB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD值0.6，5 000 r/min離心5 min后，用無菌Hogland’s無磷營養(yǎng)液重懸制成菌劑。種子萌發(fā)3、7和10 d后，每盆接種100 mL菌劑，種子萌發(fā)30 d后收樣。測定大豆干重、根表面積、總根長和磷含量。

試驗數(shù)據(jù)由Microsoft Excel 2019錄入，采用SPSS、Original 8.0等軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

將3株芽孢桿菌接種于固體LB培養(yǎng)基上，于24、48 和72 h對菌株形態(tài)進行觀察(圖1)和鑒定(表1)發(fā)現(xiàn)，3株菌的菌落形態(tài)和菌落擴張速度不同。其中，RL1菌落表面粗糙干燥，扁平，為乳白色；Y26菌落表面粗糙干燥，凸起，淡黃色；P90菌落表面平滑黏稠，凸起，淺黃色。通過革蘭氏染色法染色及光學顯微鏡觀察菌體形態(tài)，各菌株染色結果均為紫色，形狀均為桿狀，具有運動性，能夠產(chǎn)生芽孢。

對3株芽孢桿菌16S rRNA 基因進行 PCR 擴增并測序，根據(jù)16S rRNA核苷酸序列在NCBI blast(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和LPSN(https：//bacterio.net/)數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，RL1(登錄號：MW836813)和Y26(登錄號：MW836139)菌株與沙佛芽孢桿菌()的相似性為100%，P90(登錄號：MW836683)與阿氏芽孢桿菌()的相似性為100%(表2)。

將4株芽孢桿菌的16S rRNA基因序列比對分析結果使用MEGA軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖2。

3株芽孢桿菌分別接種在PKO固體和液體培養(yǎng)基上生長至21 d。固體培養(yǎng)試驗結果顯示，這3個菌株均能夠分解PKO固體培養(yǎng)基中的磷酸三鈣，并形成透明的溶磷圈(圖3A)。液體培養(yǎng)結果顯示，與不接種對照中的可溶性磷濃度無明顯變化相比，接種3株菌株的培養(yǎng)液中的可溶性磷含量隨培養(yǎng)時間的延長而持續(xù)升高，且培養(yǎng)21 d后，菌株RL1培養(yǎng)液中的可溶性磷濃度顯著高于P90和Y26(圖3B)。

圖1 3株芽孢桿菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of the three Bacillus strains

表1 3株芽孢桿菌菌落形態(tài)特征及菌體特征

表2 3株芽孢桿菌16S rRNA 序列比對結果

通過固體和液體培養(yǎng)2種方法檢測了3個菌株的泌氫能力。其中，將菌株接種在PVK改良固體培養(yǎng)基上1 d后，菌株周圍呈明顯黃色，且隨時間推移，菌落周圍的黃色逐漸加深，說明3株菌株均能分泌質子酸化周圍環(huán)境(圖4A)。在PKO培養(yǎng)液中接種3株菌株，其pH檢測結果顯示，接種3 d后培養(yǎng)基的pH由7.0下降至4.5～5.5，但3個菌株培養(yǎng)液的pH無明顯差異，且3 d后培養(yǎng)液的pH無明顯變化(圖4B)。

圖2 基于 16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

注：A.芽孢桿菌的解磷效果，4個菌斑為該微生物的4種濃度，左上、右上、左下、右下濃度依次為1、10-1、10-10、10-100；B.芽孢桿菌的解磷量，“***”表示芽孢桿菌溶解磷酸三鈣的量與對照組相比差異極顯著(P<0.001) Note：A.Determination of phosphorus solubility.The four plaque concentrations in the figure are 1,10-1，10-10 and 10-100(similarly hereinafter)；B.Phosphate solubilization capacity of the three Bacillus strains，“***” indicates significant statistical differences(P < 0.001)圖3 3株解磷菌株對難溶性鈣磷的溶解能力Fig.3 Capacity of three Bacillus strains in the mobilization of sparingly soluble Ca3(PO4)2(Ca-P)

注：A.3株芽孢桿菌的泌H+效果；B.接種3株芽孢桿菌對培養(yǎng)液pH的影響 Note： A.Ability of H+ secretion of the three Bacillus strains；B.The effects of three Bacillus strains on pH value in the growth medium圖4 3株芽孢桿菌泌氫能力Fig.4 Capability of three Bacillus strains in H+ secretion

進一步分析了這3株芽孢桿菌的淀粉水解、3-酮基乳糖氧化及產(chǎn)吲哚-3-乙酸能力。其中，在含可溶性淀粉的固體培養(yǎng)基中P90菌落周圍為明顯黃色，說明P90具有淀粉水解能力，而RL1和Y26菌落周圍無明顯黃色，說明這2個菌株不具備淀粉水解能力(圖5A)。在含有3-酮基乳糖的固體培養(yǎng)基中，3株芽孢桿菌均不能將培養(yǎng)基氧化成紅色，說明這3個菌株均不具有氧化乳糖的能力(圖5B)。

在液體King培養(yǎng)基中培養(yǎng)這3株促生菌，9 d后測定培養(yǎng)基中的吲哚-3-乙酸含量，菌株RL1、Y26和P90均具有分泌吲哚-3-乙酸的能力，且分泌量分別為15.21、12.40和15.40 mg/L(圖5C)。

接種3株芽孢桿菌均顯著促進了大豆植株的生長(圖6A)。與不接種對照相比，正常磷條件下(HP)接種RL1、Y26和P90的大豆植株地上部干重分別增加了68.32%、50.14%和32.39%(圖6B)，根系干重分別增加了40.38%、19.23%和27.89%(圖6C)，總根長分別提高了43.78%、24.55%和43.94%(圖6D)，根表面積分別提高了42.28%、28.76%和57.05%(圖6E)，地上部磷含量分別增加了48.29%、9.50%和18.30%(圖6F)，而根系磷含量分別增加了57.33%、26.56%和37.51%(圖6G)。

注：A.3株芽孢桿菌的淀粉水解效果；B.3株芽孢桿菌的3-酮基乳糖氧化效果；C.3株芽孢桿菌培養(yǎng)9 d后，培養(yǎng)液中吲哚-3-乙酸含量。“***”表示芽孢桿菌分泌吲哚-3-乙酸量與對照相比差異極顯著(P<0.001) Note：A.Starch hydrolysis ability of the three Bacillus strains；B.3-keto lactose oxidation of the three Bacillus strains；C.The concentration of IAA produced by the three Bacillus strains for 9 days，“***” indicates significant statistical difference(P < 0.001)圖5 3株芽孢桿菌的淀粉水解、3-酮基乳糖氧化及產(chǎn)吲哚-3-乙酸能力Fig.5 The ability of starch hydrolysis,3-keto-lactose oxidation and indole-3-acetic acid production of three Bacillus strains

注：A.大豆植株表型；B.植株地上部干重；C.植株根系干重；D.植株根系總根長；E.植株根表面積；F.植株地上部磷含量；G.植株根系磷含量。*表示接種芽孢桿菌與不接種對照處理相比差異顯著(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。標尺為20 cm Note：A.Soybean phenotypes；B.Shoot dry weight；C.Root dry weight；D.Total root length；E.Root surface area；F.Phosphorus content of shoot；F. Phosphorus content of root.* indicated significant difference between inoculation and non-inoculation(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001).Bar=20 cm圖6 3株芽孢桿菌對大豆生長發(fā)育的影響Fig.6 Effects of three Bacillus strains on soybean growth

與高磷處理相似，泥炭土中添加磷酸三鈣(CaP)作為唯一磷源時，接種RL1、Y26和P90的大豆植株與不接種對照相比，其地上部干重分別提高了46.02%、61.93%和64.2%(圖7B)，根系干重分別提高了10.71%、39.29%和48.21%(圖7C)，總根長分別提高了5.56%、31.08%和31.35%(圖7D)，根表面積分別提高了10.05%、42.02%和42.52%(圖7E)，地上部磷含量分別增加了27.49%、40.39%和39.77%(圖7F)，而根系磷含量分別增加了28.34%、72.56%和73.62%(圖7G)。

3 結論與討論

微生物肥料能夠活化土壤養(yǎng)分、改善土壤理化性質、防治土壤有害微生物、促進作物生長及改善作物品質等，因此其越來越廣泛地應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。微生物肥料的重要組成成分是有益功能菌。其中，促生菌定殖于植物根部，通過一系列生理生化活動，提高植物對生物及非生物脅迫的耐受性，改善植物對土壤養(yǎng)分的吸收利用，促進作物的生長發(fā)育。鑒于微生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上獨特的社會和經(jīng)濟價值，加強對微生物資源的開發(fā)利用與保護，具有極其重要的意義。

微生物種群結構的變化受多種因素的驅動，其中包括氣候、土壤理化性質、海拔、生態(tài)類型和人為活動等。我國西南喀斯特地區(qū)石漠化較為嚴重，植物種類、植被蓋度和土壤肥力均受石漠化的制約。而土壤微生物可直接參與土壤的物質循環(huán)和能量轉化，促進石漠化地區(qū)植物養(yǎng)分的吸收。此外，廣東省湛江市位于亞熱帶沿海地區(qū)，土壤類型以濱海鹽土和酸性土壤為主，是華南地區(qū)主要的糧食產(chǎn)地之一。但在酸性土壤中，磷極易被固定，導致土壤的磷有效性降低。這些特殊的地理環(huán)境，很可能孕育出具有特殊性質或新基因的微生物。因此，分離適應當?shù)赝寥兰皻夂驐l件的優(yōu)良菌株將對菌肥的開發(fā)和利用、維持當?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。因此，該研究選取貴州省興義市石漠化土壤，及廣東省湛江市水稻土作為研究對象，從中分別篩選出3株不同種類的芽孢桿菌。通過16S rRNA基因序列比對分析發(fā)現(xiàn)RL1和Y26屬于沙佛芽孢桿菌();P90屬于阿氏芽孢桿菌()。這3株菌株雖然來自不同類型的土壤，但均具有溶解磷酸三鈣、泌氫和產(chǎn)生吲哚-3-乙酸的能力，而P90還具有水解淀粉的能力。這與其他已報道的芽孢桿菌的生理生化特性類似。如柴曉虹等對12株不同種屬的促生菌進行評價，其中蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌具有不同程度的產(chǎn)酸、產(chǎn)吲哚-3-乙酸、淀粉水解以及其他功能。煙草植株根圍土壤中篩選出的巨大芽孢桿菌也具有較強的解磷和淀粉水解能力等。

芽孢桿菌所具有的分泌吲哚-3-乙酸和水解難溶磷的能力在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要應用價值。鄭文波等在江西紅壤花生地中發(fā)現(xiàn)1株巨大芽孢桿菌()，該菌株具有分泌吲哚-3-乙酸和解磷能力，接種該菌株后，花生植株全磷含量、根長、根尖數(shù)、根表面積及根體積均顯著增加。另外，河北冀微生物肥料有限公司研發(fā)的冀微菌肥以枯草芽孢桿菌為主體，其具有分泌吲哚-3-乙酸、解磷及解鉀等能力，該菌肥應用于結球白菜能夠顯著改善作物產(chǎn)量和品質。為了驗證該研究所分離的3株芽孢桿菌的解磷和分泌吲哚-3-乙酸的特性是否能夠促進植物生長，設計了正常磷處理和鈣磷2種處理，比較了接種和不接種條件下，大豆的生物量、根系性狀和磷含量。結果顯示，接種3株芽孢桿菌后，大豆的干重、總根長、根表面積及全磷含量與對照相比均顯著提高。這說明該研究所篩選的3株芽孢桿菌均能夠改變大豆的根系構型，提高植株利用外源難溶磷的能力。

綜上所述，該研究篩選的3株芽孢桿菌具有解磷、泌氫和產(chǎn)吲哚-3-乙酸的能力。在大豆盆栽試驗中，接種這3個菌株均能夠不同程度提高大豆的干重、總根長、根表面積和磷含量。雖然這3個菌株在離體培養(yǎng)條件下其解磷、泌氫和產(chǎn)吲哚-3-乙酸的能力無明顯差別，但接種不同菌種對大豆植株的促生效果不同，原因可能與其在植物根部的定殖效果、溫度、營養(yǎng)來源及作物種類等有關。雖然這3個菌株的具體促生機制還有待進一步研究，但大豆盆栽試驗結果表明，所篩選的菌株可作為一種高效的備選菌株，為微生物肥料的發(fā)展提供菌種資源。