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        侵染安康魔芋的芋花葉病毒外殼蛋白基因克隆及分析

        2022-10-13 04:57:06歡,吳
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年18期

        劉 歡,吳 薇

        (安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院,陜西安康 725000)

        魔芋(Durieu)屬于天南星科魔芋屬多年生草本植物,含有多種人體必需的微量元素,廣泛應(yīng)用于食品、藥品、農(nóng)業(yè)化工等領(lǐng)域,具有很好的保健功效。陜西是全國四大魔芋主產(chǎn)省份之一,安康魔芋已經(jīng)被評為中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品。近年來,隨著魔芋種植面積不斷擴大,品種逐漸增多,被稱為“植物癌癥”的各種病毒病逐漸成為制約魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素。

        國內(nèi)魔芋產(chǎn)區(qū)真菌、細(xì)菌和病毒病害發(fā)生較為普遍,相對于真菌、細(xì)菌病害,病毒病害的研究薄弱。由于魔芋以無性繁殖為主,病毒易通過種芋遠(yuǎn)距離傳播,制約魔芋產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。芋花葉病毒(Dasheen mosaic virus,DsMV)是天南星科植物最重要的病毒病原之一。DsMV主要在天南星科的大田作物、藥用植物以及花卉上侵染為害。其侵染作物后可引起系統(tǒng)癥狀或隱癥現(xiàn)象。據(jù)不完全統(tǒng)計,被DsMV侵染的天南星科作物,產(chǎn)量損失能達(dá)到60%左右。

        DsMV是馬鈴薯Y病毒屬()成員,基因組為正義單鏈RNA(+ssRNA),全長約10 kb,僅編碼一個大的多聚蛋白,通過自身編碼的蛋白酶將多聚蛋白加工成多個具有功能的蛋白,CP蛋白位于多聚蛋白的末端。目前已公布的DsMV基因組信息多來自芋頭和馬蹄蓮,而DsMV魔芋分離物基因組信息卻鮮見報道,或者僅有部分基因序列信息。筆者克隆了DsMV安康魔芋分離物完整的基因,并對其進(jìn)行了分子特性分析,旨在為建立可靠的病毒分子檢測方法提供重要信息,并為后續(xù)研究其分子致病機制打下基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        感染DsMV的魔芋葉片采集于安康市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,其葉片癥狀表現(xiàn)為嚴(yán)重的黃化、畸形和卷葉。取其新鮮葉片保存于安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院分子遺傳實驗室-80 ℃超低溫冰箱備用。

        魔芋葉片基因組RNA提取與反轉(zhuǎn)錄。取0.1 g葉片,加入液氮進(jìn)行研磨,迅速轉(zhuǎn)入1.5 mL無酶離心管中,按照北京康為世紀(jì)的 Omni Plant RNA Kit試劑盒提取說明書操作提取RNA。以RNA為模板,合成cDNA,反應(yīng)總體系為25 μL,包含RNA模板3.0 μL,Oligo D(18)T(TaKaRa,10 μmol/L) 1.0 μL,5×Reaction Buffer 5.0 μL,dNTPs(100 mmol/L each)2.0 μL,M-MLV(Promega)1.0 μL,RiboLock RNase Inhibitor 0.5 μL,RNA-Free Water 12.5 μL。

        基因擴增與檢測。根據(jù) GenBank 中登錄的 DsMV基因組序列,使用 mega 6.0 進(jìn)行多重比對,在基因保守區(qū)域應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計用于擴增完整的引物CP-F(5′- GCACCATATATTGCTGAAAC -3′),CP-R(5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3′),引物由西安擎科公司合成。RT-PCR反應(yīng)體系:cDNA模板2 μL,CP-F引物2 μL,CP-R引物2 μL,PrimeSTAR? Max DNA Polymerase(TaKaRa)25 μL,ddHO 19 μL。PCR反應(yīng)程序:98 ℃變性10 s,52 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s,進(jìn)行35個循環(huán)。PCR結(jié)束后,取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

        PCR產(chǎn)物測序與分析。利用DNA回收純化試劑盒對RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化,將回收產(chǎn)物與pGEM-T Easy Vector進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,提取質(zhì)粒送至西安擎科生物公司測序。使用Vector NTI Advance V11.5.2軟件中的ContigExpress程序,將測序得到的ABI文件導(dǎo)入,去除NIb和3′-UTR基因序列,獲得完整的序列。從GenBank獲得DsMV不同分離物基因序列,使用MEGA 6.0中的ClustalW算法進(jìn)行多重比對,采用Neighbor-Joining(NJ)法,將Bootstrap Replications設(shè)置為1 000,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

        2 結(jié)果與分析

        使用CP-F和CP-R引物,以cDNA為模板,PCR擴增得到約1.3 kb的單一條帶(圖1),與預(yù)期擴增到的基因片段大小吻合。

        注:M.DS 2000 DNA Marker;1.使用CP-F/R擴增健康魔芋葉片樣品;2.使用CP-F/R擴增受DsMV侵染的魔芋葉片樣品 Note:M.DS 2000 DNA Marker;1.Amplify healthy Amorphophallus rivieri leaf samples with CP-F/R;2.Use CP-F/R to amplify Amorphophallus rivieri leaf samples infected with DsMV圖1 DsMV cp基因RT-PCR擴增Fig.1 RT-PCR amplification of DsMV cp gene

        序列經(jīng)過測序后拼接,使用ContigExpress程序去除NIb和3′-UTR基因序列,最終得到的DsMV魔芋分離物基因全長為903 bp,將完整的DsMV序列上傳至GenBank 并獲得ID號(Access number:ON003977)。

        該研究測定了侵染安康魔芋DsMV的cp核苷酸序列,序列比對結(jié)果表明,DsMV安康魔芋分離物變異較大,GenBank中所有參與比對的序列與該研究獲得的DsMV安康魔芋分離物序列的覆蓋度僅72%~80%,一致性為80.30%~87.98%(圖2)。

        圖2 比對序列與目標(biāo)序列的覆蓋度Fig.2 Coverage of the compared sequence and the target sequence

        在GenBank上獲得的DsMV分離物信息見表1,與該研究得到的序列聯(lián)合分析。系統(tǒng)發(fā)育分析表明,DsMV基因可分為3個組(組I、組II和組III)(圖3)。已公布的DsMV基因多聚集在組I中,這些分離物寄主均是天南星科植物,且分布范圍廣,從進(jìn)化樹來看,它們并沒有寄主特異性,且與寄主地理位置沒有明顯聯(lián)系;組II中僅有來自中國芋頭的一個分離物;該研究獲得的DsMV 安康魔芋分離物單獨歸于組III。

        3 小結(jié)與討論

        DsMV自然狀態(tài)下主要侵染天南星科植物,20世紀(jì)60年代美國學(xué)者在芋頭中發(fā)現(xiàn)該病毒,之后日本、越南、新西蘭等國家相繼發(fā)現(xiàn)DsMV侵染不同寄主植物。我國學(xué)者在20世紀(jì)90年代在馬蹄蓮中通過血清學(xué)和電子顯微鏡檢測到DsMV。隨后國內(nèi)學(xué)者在芋頭、半夏和白附子中相繼發(fā)現(xiàn)DsMV。由于天南星科植物多數(shù)依靠無性繁殖,病毒主要通過種苗傳播,亦可通過蚜蟲或機械摩擦傳播。而我國是天南星科植物種植大國,陜西安康嵐皋縣魔芋已經(jīng)被評為中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品。隨著魔芋種植面積增加,加之魔芋常年進(jìn)行無性繁殖,易導(dǎo)致病毒積累、種性退化,豐產(chǎn)性和品質(zhì)均難以保證。而目前魔芋病毒病的研究僅僅停留在病原鑒定、田間調(diào)查、組織病變和RT-PCR檢測層面,魔芋中DsMV發(fā)生情況和分子特征卻鮮見報道。

        表1 從NCBI中獲得的DsMV cp序列信息

        圖3 DsMV cp基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of DsMV cp gene nucleotide sequence construction

        該研究克隆了侵染安康魔芋的DsMV基因,并對其進(jìn)行分子特征分析,表明其為完整的DsMV魔芋分離物基因序列,全長為903 bp,推導(dǎo)編碼的外殼蛋白由301個氨基酸組成。從結(jié)果看來,前150 bp序列未參與比對,可見其堿基序列差異較大,DsMV魔芋分離物與其他寄主分離物之間存在很大的分子變異。由于GenBank中DsMV魔芋分離物序列極少,通過其他寄主分離物聯(lián)合分析,初步判斷DsMV沒有明顯的寄主?;院偷乩砦恢孟嚓P(guān)性。

        該研究結(jié)果為后續(xù)DsMV魔芋分離物的分子特征和病害流行學(xué)綜合研究奠定了基礎(chǔ),同時為魔芋抗病毒育種、建立更可靠的DsMV分子檢測技術(shù)、全基因組測定和致病機制的研究提供參考。

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