楊玉珍，張耀武

(南陽(yáng)農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院植物組織培養(yǎng)中心，河南南陽(yáng) 473000)

冰燈玉露為百合科十二卷屬中軟葉類多肉植物，原產(chǎn)于南非，植株低矮，葉片呈蓮座狀緊湊排列，葉色碧綠，葉片頂端具晶瑩剔透的透明窗，“窗”大而透亮，具有較高的觀賞價(jià)值，故名為“玉露”，是百合科具有代表性的花卉品種，具有良好的市場(chǎng)前景，受到園藝工作者和花卉愛好者的青睞。近年來(lái)，我國(guó)和日本園藝工作者將從海外引進(jìn)的玉露品種通過(guò)篩選，選擇特征明顯的優(yōu)秀良種，再經(jīng)過(guò)不同品種間相互授粉、育苗、選種的過(guò)程培育出冰燈玉露、紫肌玉露等精品玉露，為保證這些精品玉露的優(yōu)良性狀，通常采用葉插和底座繁殖等無(wú)性繁殖方式，這些繁殖方法易損害母本，然而玉露本身生長(zhǎng)速度慢，繁殖系數(shù)小，繁殖速度極慢，難以滿足市場(chǎng)需求，導(dǎo)致其價(jià)格居高不下。近年來(lái)，采用組培快繁技術(shù)對(duì)多肉植物進(jìn)行繁殖的研究較多，而由于常規(guī)育種一些新的性狀很難通過(guò)雜交的方法獲得，通過(guò)組織培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織建立遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行誘變育種、體細(xì)胞雜交、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等種質(zhì)變異研究，是培育新品種的重要途徑，因此, 獲得胚性愈傷組織是種質(zhì)創(chuàng)新育種的關(guān)鍵。

通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖的商品苗，在外觀形態(tài)上與分株或播種繁殖苗存在明顯差異，其中組培苗基部葉片細(xì)長(zhǎng)畸形，觀賞效果差，將這些葉片去除后導(dǎo)致植株整體形態(tài)不完整，從而失去觀賞價(jià)值。這是由于瓶中移栽出的組培苗葉片細(xì)長(zhǎng)，厚度不足，整體植株細(xì)弱，生長(zhǎng)勢(shì)不強(qiáng)，有些組培苗不生根，即使生根也很細(xì)弱，且容易爛掉，導(dǎo)致組培苗需要數(shù)月乃至更長(zhǎng)時(shí)間的馴化硬化階段，新生葉才能恢復(fù)其正常的品種特征，呈現(xiàn)出觀賞特征，這種情況不僅增加了培養(yǎng)時(shí)間，提高了生產(chǎn)成本，還影響了商品價(jià)值，從而使這一技術(shù)的應(yīng)用受限。然而，探索在組培增殖階段和壯苗階段克服這項(xiàng)技術(shù)難題，目前在該領(lǐng)域鮮見報(bào)道。筆者以冰燈玉露葉片作為外植體，誘導(dǎo)產(chǎn)生松散的胚性愈傷組織，進(jìn)行離體再生，研究不同激素組合、培養(yǎng)方式對(duì)誘導(dǎo)松散型愈傷組織、誘導(dǎo)不定芽建立再生體系及建成促進(jìn)正常形態(tài)的影響，建立一套完整的組織培養(yǎng)植株再生體系，旨在為冰燈玉露遺傳變異、轉(zhuǎn)基因育種及快速繁育優(yōu)良新種質(zhì)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

供試材料為冰燈玉露。

外植體的選取和預(yù)處理。將冰燈玉露基部成熟葉片摘下，用洗滌劑溶液浸泡5 min左右，用軟毛刷仔細(xì)清洗，用自來(lái)水沖洗1 h。

外植體的滅菌與初代培養(yǎng)。在超凈工作臺(tái)上，將預(yù)處理的外植體葉片用75%乙醇溶液滅菌10 s，然后將0.1% HgC1溶液倒入燒杯中滅菌14 min ，再用無(wú)菌水沖洗5遍后，將葉片接種在不同初代培養(yǎng)基上。選取MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，3%蔗糖，0.5%瓊脂，pH 5.6。以6-BA、2,4-D和NAA 3種激素的較低水平進(jìn)行組合試驗(yàn)，每處理10瓶。接種25 d后觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況。培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度2 500 lx，光照時(shí)間12 h，溫度(23±1) ℃。

不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。愈傷組織培養(yǎng)一段時(shí)間后，自葉片基部切下轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，選取6-BA和NAA進(jìn)行不同濃度的組合配比試驗(yàn)，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。每處理20瓶，20 d后觀察不定芽誘導(dǎo)情況，篩選最佳增殖培養(yǎng)基。不定芽增殖到一定數(shù)量后，轉(zhuǎn)入?yún)采吭鲋撑囵B(yǎng)基。

叢生芽增殖培養(yǎng)。當(dāng)叢生芽長(zhǎng)到1.5～2.5 cm，具3～4片葉時(shí)自底部切下，轉(zhuǎn)入生根增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖，每瓶接種5株小苗。選擇1/2MS為基本培養(yǎng)基，以不同濃度的NAA和NAA進(jìn)行增殖培養(yǎng)試驗(yàn)，附加0.3%活性炭，接種30 d后調(diào)查幼苗生長(zhǎng)情況。

不同激素對(duì)冰燈玉露形態(tài)建成的影響。經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)獲得的冰燈玉露組培苗在移栽前形態(tài)與自然生長(zhǎng)苗存在較大差異。為了在移栽前對(duì)組培苗進(jìn)行形態(tài)重建，將組培苗轉(zhuǎn)移至含有不同激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，以獲得生長(zhǎng)外形與自然狀態(tài)下一致的幼苗。每瓶加入50 mL培養(yǎng)基，每處理20瓶，每瓶接種2個(gè)再生苗。培養(yǎng)條件:25 ℃,24 h連續(xù)光照，光照強(qiáng)度2 000 lx。接種后每天觀察再生苗的生長(zhǎng)情況，經(jīng)過(guò)約40 d培養(yǎng)，觀察再生苗在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)變化情況。

不同光照強(qiáng)度對(duì)冰燈玉露形態(tài)建成的影響。冰燈玉露形態(tài)重建苗在煉苗移栽階段溫度和光照都會(huì)影響其性狀，通常在溫室溫度保持在20～28 ℃時(shí)進(jìn)行煉苗移栽，這時(shí)光照強(qiáng)度對(duì)組培苗的形態(tài)影響較大。先帶瓶置于加蓋遮陽(yáng)網(wǎng)的大棚中不開蓋進(jìn)行過(guò)渡煉苗，7 d后逐步開蓋，清洗培養(yǎng)基，栽植到蛭石、小石子、草炭土、粗沙混合培養(yǎng)土上，防止強(qiáng)光照射。

對(duì)比煉苗階段不同光照強(qiáng)度對(duì)提高形態(tài)重建率的影響，采用4 000、3 000、2 500、2 000、1 500 lx的光照強(qiáng)度對(duì)冰燈玉露小苗進(jìn)行煉苗硬化。

2 結(jié)果與分析

外植體葉片在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d后，觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織生長(zhǎng)情況，結(jié)果見表1。由表1可知，使用低濃度6-BA和NAA組合愈傷組織誘導(dǎo)率低，愈傷組織較硬，不利于下一階段不定芽的誘導(dǎo)；添加2,4-D后誘導(dǎo)率較高，2,4-D濃度≥0.8 mg/L時(shí)，更有利于疏松愈傷組織的誘導(dǎo)，濃度越高，愈傷組織越疏松，顏色越淡，甚至出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。通過(guò)圖1對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，添加低濃度6-BA有利于愈傷組織的形成，但濃度為1.0 mg/L時(shí)有部分不定芽萌出。綜合分析可知，冰燈玉露愈傷組織最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.8 mg/L+NAA 1.0 mg/L，愈傷組織分割后繼續(xù)培養(yǎng)能增殖出大量疏松的愈傷組織，是后期遺傳轉(zhuǎn)化研究和離體再生植株的最佳材料。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素配比

將誘導(dǎo)出的松散愈傷組織轉(zhuǎn)移到不同濃度組合的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，接種后20 d調(diào)查叢生芽誘導(dǎo)生長(zhǎng)情況，結(jié)果見表2。由表2可知，6-BA濃度在1.0 mg/L以下對(duì)不定芽的誘導(dǎo)作用不明顯，添加IBA后對(duì)不定芽誘導(dǎo)也沒有明顯的促進(jìn)作用，低濃度6-BA和較高濃度的NAA配比對(duì)叢生芽誘導(dǎo)生長(zhǎng)有利，較高濃度的6-BA導(dǎo)致叢生芽分化率過(guò)高，細(xì)弱畸形，失去觀賞性。從圖2可以看出，配方6的生長(zhǎng)情況最好，當(dāng)6-BA濃度為0.6 mg/L，NAA為1.0 mg/L時(shí)，較有利于不定芽的分化，芽增殖倍數(shù)較高，苗健壯，葉色濃綠。因此，不定芽誘導(dǎo)最佳激素配比為配方6的6-BA 0.6 mg/L +NAA 1.0 mg/L。叢生芽在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)25 d左右，將叢生芽切分后轉(zhuǎn)入新鮮的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。繼續(xù)移入附加6-BA 0.6 mg/L +NAA 1.0 mg/L的培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖倍數(shù)達(dá)4.7，每25 d左右繼代1次。

表2 不同激素配比對(duì)誘導(dǎo)不定芽的影響

注：A為配方1葉片基部長(zhǎng)出少量愈傷組織;B為配方3葉片基部長(zhǎng)出較大愈傷組織;C為配方4葉片基部長(zhǎng)出淡綠色愈傷組織; D為配方8愈傷組織分割后繼續(xù)培養(yǎng)有不定芽萌出，出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象；E為配方2愈傷組織顏色發(fā)黃、質(zhì)地硬; F為配方4淡綠色愈傷組織分割后繼續(xù)生長(zhǎng) Note:A is formula 1, a small amount of callus grows from the leaf base; B is formula 3, the leaf base grows large callus;C is formula 4, with pale green callus on the leaf base; D is formula 8,after the callus was divided and continued to be cultured, adventitious buds sprouted and vitrification occurred; E is formula 2, callus color is yellowish and hard;F is formula 4, the light green callus continued to grow after segmentation圖1 成熟葉片誘導(dǎo)愈傷組織比較Fig.1 Comparison of callus induction from mature leaves

注：A為配方1誘導(dǎo)叢生芽生長(zhǎng)情況; B為配方2叢生芽誘導(dǎo)生長(zhǎng)情況;C～E為配方4～6叢生芽生長(zhǎng)情況；F～H分別為配方7、6、8增殖階段苗25 d生長(zhǎng)情況; I為配方6增殖階段苗40 d生長(zhǎng)情況 Note: A is the growth of induced cluster buds in formula 1; B is the induced growth of cluster buds in formula 2; C-E are the growth of cluster buds in formula 4-6; F-H are the 25 days growth of seedlings in the proliferation stage of formula 7, 6 and 8,respectively; I is the 40 day growth of the multiplication stage seedlings in formula 6圖2 不同激素配比叢生芽生長(zhǎng)情況Fig.2 Growth of cluster buds with different hormone ratios

在前期不定芽誘導(dǎo)階段控制增殖苗增速與培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，增殖過(guò)多，密集苗后期形態(tài)受影響，因此培養(yǎng)時(shí)間掌握在25～40 d全部轉(zhuǎn)接完畢，然后單株分栽到形態(tài)建成壯苗階段培養(yǎng)基中，每瓶接種2株，個(gè)別大苗每瓶單株接種。每瓶培養(yǎng)基50 mL左右，以1/2MS培養(yǎng)基添加不同濃度和比例的NAA與IBA進(jìn)行幼苗生根試驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表3可知，添加不同濃度、不同比例的NAA與IBA對(duì)冰燈玉露幼苗形態(tài)建成、生根壯苗具有顯著影響，單獨(dú)添加一種激素如NAA或IBA時(shí)，冰燈玉露組培苗基本是形態(tài)不正常苗，這種苗的葉片較自然條件下細(xì)長(zhǎng)，向上生長(zhǎng)，植株過(guò)高，且形狀與自然狀態(tài)下的苗不同，葉片分布不規(guī)則，葉片上端具有觀賞價(jià)值的“窗”不明顯。該研究早期多批次試栽組培苗，移栽后需要很長(zhǎng)時(shí)間的硬化階段，重建自然形態(tài)，而且組培苗肥大的肉質(zhì)根，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)緩慢，移栽時(shí)肥大根易脫落。組合后的生長(zhǎng)素以IBA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L為最佳，利于組培苗的形態(tài)重建，葉片圓鈍，排列整齊(圖3)，外觀上與自然條件下一致。

表3 生長(zhǎng)素種類和濃度對(duì)組培苗形態(tài)建成的影響

注： A～D為配方1、2、4、5的形態(tài)重建苗生長(zhǎng)情況; E為配方6 形態(tài)重建苗生長(zhǎng)情況; F為配方6形態(tài)重建苗從瓶中取出的生長(zhǎng)情況 Note:A-D are to the growth of morphological reconstruction seedlings of formula 1, 2,4 and 5; E is the growth of morphological reconstruction seedlings in formula 6; F is the growth of the morphological reconstruction seedlings of formula 6 taken out of the bottle圖3 不同激素組合組培苗形態(tài)建成情況Fig. 3 Morphogenesis of different hormone combinations

從圖4可以看出，在不同光照強(qiáng)度條件下，組培苗在生長(zhǎng)速度與形態(tài)上出現(xiàn)較大變化，煉苗過(guò)程中光照過(guò)強(qiáng)或過(guò)弱都會(huì)出現(xiàn)畸形苗。在光照強(qiáng)度為4 000 lx時(shí)葉片易失水，邊緣皺縮，在光照強(qiáng)度為2 500 lx時(shí)效果最好，組培苗葉色正常，形態(tài)飽滿，煉苗20 d后組培苗達(dá)到自然狀態(tài)。光照強(qiáng)度2 500 lx 以下時(shí)，形態(tài)開始變薄變長(zhǎng)，向高處生長(zhǎng)，觀賞價(jià)值低。因此，在煉苗硬化階段，需要根據(jù)天氣和遮陽(yáng)網(wǎng)材料及時(shí)測(cè)定光照強(qiáng)度，調(diào)整措施，保證觀賞性狀最佳。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)研究了不同激素配比對(duì)冰燈玉露愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽誘導(dǎo)、增殖比率和單株形態(tài)重建和煉苗硬化階段光照強(qiáng)度的影響，形成了一套完整的繁育體系，獲得了與自然條件下形態(tài)一致的組培苗，結(jié)果表明：不定芽誘導(dǎo)增殖和單株形態(tài)建成階段的激素配比決定了冰燈玉露組培苗硬化移栽前的植株形態(tài)，光照環(huán)境是造成組培苗煉苗畸形的主要因素。冰燈玉露愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.8 mg/L+NAA 1.0 mg/L，愈傷組織最佳分化不定芽培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.6 mg/L+ NAA 1.0 mg/L，分化時(shí)間短且不定芽增殖倍數(shù)較高，為4.7;采用1/2MS+ IBA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L為形態(tài)建成壯苗生根培養(yǎng)基，可以獲得生長(zhǎng)形態(tài)正常(與品種特性相一致)的組培苗，按照該方案系統(tǒng)培養(yǎng)，冰燈玉露組培苗移栽到20～28 ℃溫室環(huán)境下時(shí)，選擇在光照強(qiáng)度為2 500 lx時(shí)，能夠在短期內(nèi)恢復(fù)其自然生長(zhǎng)蓮座狀的特性，葉片肥厚圓鈍，窗體透亮。

注：A～E分別為4 000、3 000、2 500、2 000、1 500 lx光照條件下組培苗生長(zhǎng)情況 Note: A-E are the growth of tissue culture seedlings under 4 000,3 000,2 500,2 000,1 500 lx light,respectively圖4 不同光照強(qiáng)度對(duì)煉苗的影響Fig.4 Effects of different light intensity on seedling refining