王展華，王一涵，施 貝，張文萍，朱蕾穎，張翀宇

(國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(功能食品質(zhì)量與安全領(lǐng)域)，浙江省市場局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(保健品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江杭州 310052)

磺胺類藥物(sulfonamides，SAs)是一種以對位氨基苯磺酰胺(簡稱磺胺)為基本結(jié)構(gòu)的藥物?；前奉愃幬锞哂锌咕V廣、抗菌能力強(qiáng)、毒性小、易吸收、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。由于磺胺藥的抗菌機(jī)理為抑制微生物生長，高投藥量能夠明顯增加抑菌效果，為了達(dá)到抑菌效果，養(yǎng)殖戶在實(shí)際使用中存在濫用磺胺類藥物的現(xiàn)象。磺胺類藥物通過食品鏈進(jìn)行富集，會導(dǎo)致消費(fèi)者產(chǎn)生過敏反應(yīng)、腎臟損害、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道反應(yīng)。為了保障我國人民的食品安全，目前我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定了動(dòng)物源性食品中磺胺總量的最高殘留不得高于100 μg/kg。

目前用于動(dòng)物性食品中磺胺類藥物殘留檢測的方法主要有液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、液相質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)。近年來，液相質(zhì)譜聯(lián)用法因其檢出限度低、定量定性準(zhǔn)確，成為動(dòng)物源性食品中獸藥殘留檢測應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)。用于液相質(zhì)譜聯(lián)用法檢測的樣品前處理技術(shù)主要有液液萃取、固相萃取。其中固相萃取又分為基質(zhì)分散固相萃取、吸附-洗脫式固相萃取、通過式固相萃取?；|(zhì)分散固相萃取主要用于簡單基質(zhì)的凈化，用于動(dòng)物源性樣品凈化需要使用專用增強(qiáng)型脂質(zhì)型凈化材料，檢測成本較高，而且按樣品性質(zhì)按比例配制凈化材料用量，對于不同基質(zhì)的樣品通用性不強(qiáng)。吸附-洗脫式固相萃取是目前應(yīng)用最廣泛的固相萃取凈化技術(shù)，在動(dòng)物源性藥物殘留的檢測中，通常使用水相提取溶液，凈化需經(jīng)過固相萃取柱活化、上樣、淋洗、洗脫等步驟，由于動(dòng)物源樣品的水相提取液中會含有游離脂肪和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，在上樣、淋洗、洗脫步驟中極易堵塞固相萃取柱，導(dǎo)致試驗(yàn)時(shí)間延長和樣品回收率不穩(wěn)定。通過式固相萃取是一種新型的固相萃取技術(shù)，在直接上樣、接收的同時(shí)又能夠有效保證去除基質(zhì)干擾，有效地解決了常規(guī)吸附-洗脫式固相萃取、步驟煩瑣、耗時(shí)長的缺點(diǎn)。筆者選取日常監(jiān)督抽檢中需要檢測的19種磺胺類藥物，以基質(zhì)較為復(fù)雜的豬肝為研究基質(zhì)，建立通過式固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定豬肝中19種磺胺類獸藥殘留的方法，并完成方法的穩(wěn)定性和適應(yīng)性的研究，以期滿足日常監(jiān)督抽檢中動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物快速檢測的需要，同時(shí)對動(dòng)物源性磺胺類藥物殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)制定和更新具有重要的借鑒意義。

1 材料與方法

試劑。標(biāo)準(zhǔn)品：乙?；前?純度99.0%)、磺胺吡啶(純度99.0%)、磺胺嘧啶(純度99.0%)、磺胺甲噁唑(純度99.6%)、磺胺噻唑(純度99.5%)、磺胺甲嘧啶(純度99.5%)、磺胺二甲異噁唑(純度99.8%)、磺胺甲噻二唑(純度99.4%)、苯甲酰磺胺(純度99.3%)、磺胺二甲異嘧啶(純度99.0%)、磺胺甲氧噠嗪(純度99.2%)、磺胺氯噠嗪(純度99.1%)、磺胺鄰二甲氧嘧啶(純度98.0%)、磺胺間二甲氧嘧啶(純度99.5%)、磺胺苯吡唑(純度99.8%),德國Dr.Ehrenstorfer公司；磺胺對甲氧嘧啶(純度99.5%)、磺胺間甲氧嘧啶(純度97.5%)，中國食品藥品檢定研究院；磺胺二甲嘧啶(純度100.0%)，中國藥品生物制品檢定所；酞磺胺噻唑(純度99.7%)，北京安譜公司。磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液(濃度100 mg/L)，北京曼哈格公司。甲醇、乙腈(質(zhì)譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國sigma 公司)；ProElut PLS-A(200 mg，6 mL)固相萃取柱(北京迪馬公司)；Waters Acquity BEH C色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司)；ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Waters公司)；0.22 μm PTFE過濾頭(美國Agilent公司)。

試材。豬肝樣品購于浙江省內(nèi)不同農(nóng)貿(mào)市場。

儀器與設(shè)備。Shimadzu LC-30A高效液相色譜儀(日本島津公司)；SCIEX Triple Quad 5500-QTRAP Activated質(zhì)譜儀(美國ABSciex公司)；Milli-Q超純水儀(德國默克密理博公司)；LYNX 6000 超速離心機(jī)(美國熱電公司)；XPE205分析天平(瑞士梅特勒公司)；MultiReax多通道旋渦混合器(德國Heidolph公司)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

磺胺類藥物單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制。準(zhǔn)確稱取乙酰磺胺、磺胺吡啶等19種標(biāo)準(zhǔn)品分別置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解后定容，配成1 mg/mL的磺胺類藥物儲備液，在-18 ℃冷凍保存。

磺胺類藥物單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。分別精密移取25 μL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用初始流動(dòng)相稀釋至50 mL，配成500 μg/L的磺胺類藥物中間液，使用時(shí)，分別精密移取各單標(biāo)中間液用初始流動(dòng)相稀釋至所需濃度。

磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)混合工作液的配制。精密量取100 μL 磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用初始流動(dòng)相稀釋至10 mL，配成1 mg/L磺胺類藥物中間液，使用時(shí)，分別精密移取適量的中間液，用空白基質(zhì)稀釋至所需質(zhì)量濃度，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

樣品前處理。精密稱取5 g均質(zhì)后的試樣于50 mL離心管中，加入乙腈-水(=80/20)20.0 mL，超聲提取10 min后，于MultiReax多通道旋渦混合器中渦旋提取30 min，6 000 r/min 高速離心20 min，取4.0 mL上清液過ProElut PLS-A固相萃取柱后，用2.0 mL乙腈-水(=80/20)淋洗，收集全部流出液。將全部流出液45 ℃下氮吹近干，1.0 mL甲醇-乙腈-水混合溶液(=1/1/18)復(fù)溶，復(fù)溶液使用0.22 PTFE過濾頭過濾至進(jìn)樣瓶，待測。

色譜質(zhì)譜條件。

色譜條件。島津LC-30AD超高效液相色譜系統(tǒng)串聯(lián)Applied Biosystems Qtrap 5500三重四級桿質(zhì)譜儀，包括二元泵，在線脫氣，自動(dòng)進(jìn)樣器；色譜柱為Waters Acquity BEH C(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫35 ℃；流動(dòng)相為0.1%甲酸混合水溶液(A)和0.1%甲酸甲醇-乙腈混合溶液(=1/1)(B)；梯度洗脫程序：0～2 min，10%B，2～8 min，10%～80%B，8～11 min，80%～10%B；流速0.35 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件。離子源為TurboV 電噴霧(ESI)離子源；電離方式為正離子；霧化電壓(IS)5 500 V；離子源溫度(TEM)500 ℃；霧化氣壓力(GS1)275.79 kPa；輔助加熱氣壓力(GS2)275.79 kPa；碰撞室入口電壓(EP)10 V；碰撞室出口電壓(CXP)13 V；碰撞電壓(CE)、去簇電壓(DP)、定性離子對、定量離子對見表1。

表1 磺胺類藥物保留時(shí)間、定性、定量離子對及碰撞電壓和去簇電壓

接下表

2 結(jié)果與分析

分離色譜柱的選擇。選擇ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Waters ACQUITY UPLC BEH-C色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)進(jìn)行分離試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)進(jìn)行分離時(shí)，3種同分異構(gòu)體(磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶)在該色譜柱不能得到很好分離；而使用Waters ACQUITY UPLC BEH-C色譜柱，3種同分異構(gòu)體分離良好且峰型良好，響應(yīng)較高。Waters ACQUITY UPLC BEH-C屬于端基封尾的色譜柱，可以改善峰形，且耐受pH也更廣。因此，該研究最終選擇Waters ACQUITY UPLC BEH-C色譜柱作為分離柱。

液相色譜條件的優(yōu)化。在現(xiàn)有液相色譜檢測磺胺類藥物的研究方法中均采用了甲醇、乙腈為有機(jī)相和0.1%甲酸水為水相，該研究對比了甲醇+0.1%甲酸水、乙腈+0.1%甲酸水，發(fā)現(xiàn)在有機(jī)相為乙腈的情況下，磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶這3個(gè)同分異構(gòu)體無法有效分離，而有機(jī)相為甲醇時(shí)，磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑等出峰時(shí)間較晚，最終采用了0.1%甲酸混合水溶液(A)和0.1%甲酸甲醇-乙腈混合溶液(=1/1)(B)，在此流動(dòng)相條件下19種物質(zhì)均能很好的分離。該研究進(jìn)一步對梯度洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)待測目標(biāo)物均良好分離，多反應(yīng)監(jiān)測提取離子流圖見圖1。

磺胺類藥物適合在電噴霧離子源(ESI)的正離子模式下進(jìn)行檢測，使用500 μg/L的磺胺類藥物中間液，使用Analysis軟件在正離子模式掃描下，根據(jù)相應(yīng)物質(zhì)的分子量確定一級質(zhì)譜的掃描范圍，分別進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描找到母離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描確定出2～3個(gè)相應(yīng)較高的子離子，最后通過多反應(yīng)檢測掃描優(yōu)化相應(yīng)質(zhì)譜參數(shù)。優(yōu)化結(jié)果見表1。

該研究選取了ProElut PLS-A(200 mg，6 mL)和ProElut PLS(200 mg，6 mL)2種固相萃取柱進(jìn)行了比較凈化，其中ProElut PLS(200 mg，6 mL)固相萃取柱是國家標(biāo)準(zhǔn)GB 31658.17—2021中推薦使用的親水親脂平衡固相萃取柱，采用的凈化模式是吸附-洗脫模式，該模式在實(shí)際操作過程中樣品容易堵塞固相萃取柱，導(dǎo)致試驗(yàn)時(shí)間較長，而ProElut PLS-A采用直接通過模式，無吸附系統(tǒng)過程，縮短了試驗(yàn)時(shí)間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用ProElut PLS固相萃取柱對豬肝樣品進(jìn)行凈化的回收率普遍低于ProElut PLS-A固相萃取柱的樣品。該研究使用ProElut PLS-A固相萃取柱對樣品進(jìn)行凈化。

磺胺類藥物為極性物質(zhì)，常用的甲醇乙腈對磺胺類藥物均有較好的提取效果。與甲醇相比，乙腈可以有效地沉淀蛋白質(zhì)，且乙腈對糖類和脂肪的溶解度低于甲醇，該研究采用乙腈為提取溶劑。有研究表明，當(dāng)乙腈水溶液濃度小于60%時(shí)無法使蛋白質(zhì)完全變性，而使用純乙腈，樣品外部蛋白質(zhì)快速變性，產(chǎn)生包裹效應(yīng)，使組織內(nèi)部的藥物無法被充分提取。經(jīng)綜合考慮，該研究中采用80%的乙腈水溶液作為提取溶劑。

該研究采用空白基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積(A)與初始流動(dòng)相中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積(B)考察基質(zhì)效應(yīng)

圖1 19種化合物的提取離子流圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of 19 compounds

(ME)。試驗(yàn)結(jié)果(圖2)表明，凈化過的樣品依然存在基質(zhì)效應(yīng)，目前消除基質(zhì)效應(yīng)的方法有同位素稀釋和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線2種方法，在該研究中使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法來消除基質(zhì)效應(yīng)。

采用混合標(biāo)準(zhǔn)工作液使用空白基質(zhì)配制成2～80 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明，磺胺類藥物在豬肝基質(zhì)中在2～80 μg/L線性關(guān)系良好(>099)；在5 g空白豬肝基質(zhì)樣品中加入500 μL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(1 000 μg/L)，理論加標(biāo)濃度為10.0 μg/kg，按照已建立方法檢測，信噪比>10為定量限，信噪比>3為檢出限。從表2可以看出，該方法的19種磺胺類藥物的定量限遠(yuǎn)低于GB 31658.17—2021規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)要求(10 μg/kg)，可滿足日常監(jiān)督檢測的需求。

圖2 19種磺胺類藥物在豬肝臟基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)Fig.2 Matrix effects of 19 sulfonamides in porcine liver matrix

表2 19種磺胺類藥物的線性方程、決定系數(shù)、檢出限和定量限

分別選取了3個(gè)濃度梯度水平對空白樣品進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平測定6次，計(jì)算加標(biāo)回收率和RSD值，檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示。19種磺胺類藥物在豬肝樣品中的回收率為74.0%～123.2%，RSD均小于10%，表明該方法穩(wěn)定、可靠。

利用建立的方法對杭州市售豬肝樣品20批次進(jìn)行19種磺胺藥物殘留檢測，測定結(jié)果均為未檢出，說明目前杭州市售豬肝質(zhì)量較好。

3 結(jié)論

該研究建立了通過式固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定豬肝中19種磺胺類獸藥殘留的方法。豬肝中19種磺胺類藥物在方法的液相條件下均得到了很好的分離，同時(shí)方法采用的通過式ProElut PLS-A固相萃取柱的凈化方法減少了試驗(yàn)步驟，節(jié)約了樣品處理所需要的時(shí)間。經(jīng)試驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法檢出限、回收率、精密度均優(yōu)于現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)，適用于大批量動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留的快速篩查和定量。

表3 19種磺胺類藥物的加標(biāo)回收率及其RSD(n=6)