中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所生物治療室(110001)

蔣 濤△ 李 妍 孟凡東 隋承光

【提 要】 目的 運用統(tǒng)計學方法探討宮頸鱗狀細胞癌患者血清中miR-221聯(lián)合CEA、CD109及SCCA檢測在臨床診斷中的應用價值。方法 UALCAN數(shù)據(jù)庫獲取miR-221和CD109在宮頸鱗狀細胞癌患者中的表達水平及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系；采集患者外周血，提取血清，實時熒光定量PCR分析血清中miR-221和CD109的表達；免疫化學發(fā)光法檢測血清中CEA和SCCA的表達水平；logistic多因素回歸分析miR-221、CEA、CD109及SCCA的診斷價值；Pearson相關(guān)性分析各指標之間的相關(guān)性；分析單項檢測及聯(lián)合檢測的靈敏度、特異度及準確度。結(jié)果 miR-221、CEA、CD109及SCCA在宮頸鱗狀細胞癌患者中均呈高表達狀態(tài)(P<0.05)；logistic多因素回歸分析顯示miR-221、CEA、CD109及SCCA均對宮頸鱗狀細胞癌具有診斷價值(P<0.05)；Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，各指標之間均具有顯著的相關(guān)性(P<0.01)；聯(lián)合檢測的靈敏度均高于各項指標的單項檢測結(jié)果，準確度高于miR-221和CD109的單獨檢測結(jié)果，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 聯(lián)合CEA和SCCA檢測能夠更有效提高宮頸鱗狀細胞癌的早期檢出率，在臨床診斷中具有重要的應用價值。

宮頸鱗狀細胞癌(cervical squamous cell carcinoma，CSCC)是女性生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一[1]，其死亡原因主要是腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。早期診斷對于宮頸癌的治療及預后改善極為重要。腫瘤標志物在正常人的體內(nèi)含量極低，但在腫瘤患者體內(nèi)的含量卻較高，因其檢測操作簡便，易于被患者接受，廣泛應用于腫瘤的篩查和診斷中。但單個腫瘤標志物對于疾病的診斷往往靈敏度較低，為提高早期診斷率和治療效果，臨床通常聯(lián)合檢測腫瘤標志物的表達水平預測癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力，為腫瘤患者的早期治療提供有利時機。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為18～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在細胞內(nèi)具有重要的調(diào)節(jié)作用[2]。miRNA可通過在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控促癌或抑癌相關(guān)基因的表達而廣泛參與惡性腫瘤進程[3]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-221可以誘導腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，尤其在宮頸鱗狀細胞癌中，促進了腫瘤細胞的增殖[4]。鱗狀細胞癌抗原(SCCA)是具有相對較高特異性的一種抗原標志物，是診斷宮頸鱗癌的首選腫瘤標志物。有研究表明，檢測SCCA可以用于監(jiān)測宮頸癌患者的病情改變情況，也是制定輔助治療方案的參考依據(jù)[5]。miR-221聯(lián)合多種抗原標志物檢測宮頸鱗狀細胞癌，將有效提高患者的早期診斷率。

材料與方法

1.一般資料

選取2017年1月至2020年12月中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科和婦科CSCC患者70例作為患者組。70例宮頸息肉患者作為疾病對照組。篩選70例健康志愿者作為健康對照組。

納入標準：經(jīng)病理及影像學診斷確診的患者；年齡大于18歲；健康對照組人群均為經(jīng)過血液及超聲等相關(guān)檢查符合健康人群標準。排除標準：患有心理及精神疾病的患者；患有心腦血管疾病的患者；患有免疫系統(tǒng)疾病者；合并其他腫瘤患者；接受過放化療的患者；妊娠及哺乳期女性。

2.臨床數(shù)據(jù)及標本的采集方法

利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(http：//ualcan.path.uab.edu/)獲得miR-221和CD109在宮頸鱗狀細胞癌患者中的表達數(shù)據(jù)及生存分析圖譜。所有研究對象均采集清晨空腹靜脈血5ml，離心，3000 r/min，留取上層血清，用于后續(xù)實驗。

3.檢測方法

應用羅氏全自動分析儀，采用免疫化學發(fā)光法檢測所有研究對象血清中CEA和SCCA的表達水平。正常參考值：CEA<5μl/L；SCCA<2.5μg/L。

采用實時熒光定量PCR檢測血清中miR-221和CD109的相對表達水平。miR-221的引物序列上游：5′-GGACCACCGCTCATCGCTAA-3′，下游：5′-GTTACTATATGCCAAGCCCTAG-3′；CD109得引物序列上游：5′-ACATGATCTCAATCATGTGG-3′，下游：5′-ACACTGAAGCATCTTGGG-3′；內(nèi)參U6的引物序列上游：5′-CTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游：5′-AAAATATGGAACGCTTCACG-3′。采用2-△△Ct法計算miR-221、CD109的相對表達量。

4.統(tǒng)計學方法

本實驗中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進行分析處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示。樣本不滿足正態(tài)性檢驗，選擇Mann-Whitney U檢驗。應用R軟件包ggplot2分析數(shù)據(jù)庫中樣本的差異。采用單因素方差分析法進行組間的差異性比較，兩組間的差異比較應用t檢驗進行分析。多因素分析采用logistic回歸模型。應用Pearson相關(guān)性分析各指標的相關(guān)性。計算單獨診斷及聯(lián)合診斷的敏感度和特異度：敏感度=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%；特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%；準確度=(真陽性+真陰性)/(真陽性+假陽性+真陰性+假陰性)×100%，聯(lián)合檢測時任意陽性結(jié)果為陽性。P<0.05視為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.miR-221在CSCC患者中的表達

miR-221在宮頸鱗狀細胞癌中的表達水平(398.041±38.429)/million明顯高于正常對照組(241.956±29.623)/million(P<0.01)，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中miR-221的表達水平(503.474±49.189)/million也高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(381.157±43.292)/million及健康對照組(241.956±29.623)/million，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.CD109在CSCC患者中的表達

CD109在宮頸鱗狀細胞癌患者中的表達水平(11.913±3.492)/million明顯高于正常對照組(9.468±2.439)/million，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中CD109的表達水平(12.491±3.128)/million明顯高于健康對照組(9.468±2.439)/million，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3.各組血清中miR-221、CEA、CD109及SCCA的表達情況

CSCC患者組和疾病對照組患者血清中miR-221、CEA、CD109及SCCA的表達水平均高于健康對照組(P<0.05)，且CSCC患者組高于疾病對照組(P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 血清中miR-221、CEA、CD109及SCCA的表達水平

4.CSCC的診斷因素

以腫瘤是否發(fā)生為因變量，以CESC患者組和健康對照組為對象，logistic多因素回歸分析顯示miR-221、CEA、CD109及SCCA均對宮頸鱗狀細胞癌的診斷有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

表2 CSCC診斷因素的logistic回歸分析

5.血清miR-221、CEA、CD109及SCCA表達水平之間的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析得出，血清中miR-221、CEA、CD109及SCCA的表達水平之間均具有顯著的相關(guān)性(P<0.01，表3)。

表3 血清miR-221、CEA、CD109及SCCA表達水平之間的相關(guān)性

6.血清miR-221、CEA、CD109、SCCA單項檢測及聯(lián)合檢測對CSCC診斷的價值分析

從血清miR-221、CEA、CD109及SCCA單獨檢測的靈敏度、特異度及準確度分析，CEA和SCCA的準確度均高于miR-221和CD109的單獨檢測結(jié)果(表4)。因此選擇CEA和SCCA聯(lián)合檢測(并聯(lián)檢測)，探討聯(lián)合檢測對CSCC的診斷價值。

表4 血清miR-221、CEA、CD109、SCCA單項檢測對CSCC的診斷價值

CEA和SCCA聯(lián)合檢測的靈敏度、特異度及準確度分別為94.29%、77.14%和85.71%，其靈敏度和準確度均高于單項檢測結(jié)果，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

討 論

宮頸癌是威脅全球女性健康的主要疾病之一，其發(fā)病率日漸增高，全球每年約有50萬女性被確診為宮頸癌，且5年內(nèi)生存率不足50%[6]，病因復雜，其中高危型人類乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染是主要致病因素。近年來隨著篩查技術(shù)的發(fā)展及HPV疫苗的應用，已有效控制及治療部分患者，宮頸癌根治手術(shù)及同步放化療技術(shù)也日趨成熟，但多數(shù)局部晚期及復發(fā)轉(zhuǎn)移患者并無法受益，仍有多數(shù)腫瘤患者發(fā)展成為晚期癌癥。因此，尋找更多的癌前病變指標及早期診斷指標，探討宮頸癌不同病理類型間的表達差異對臨床診斷及治療具有重要意義。

近年有研究[7]顯示，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，miRNA可通過調(diào)控下游靶基因的表達，參與信號通路，發(fā)揮著類似癌基因或抑癌基因的作用。幾乎全部腫瘤細胞中均可檢測到miRNA的異常表達，基于miRNA的靶向治療也已成為近年來腫瘤治療研究的熱點。目前在宮頸癌患者中已發(fā)現(xiàn)許多異常表達的miRNA參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[8]。miR-221可通過對GHR、PUMA、Bmf、DDIT4等癌基因的調(diào)控影響細胞的增殖、分化及凋亡，進而影響腫瘤的發(fā)生和進展。本文通過數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，宮頸鱗狀細胞癌患者組織中，miR-221的表達明顯高于正常健康人群，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的miR-221表達水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者和健康對照組人群。本實驗檢測了宮頸鱗狀細胞癌患者血清中miR-221的水平，分析發(fā)現(xiàn)血清中miR-221的表達水平明顯高于宮頸息肉患者的表達水平。說明miR-221有可能作為癌基因在宮頸鱗狀細胞癌中發(fā)揮作用。

白細胞分化抗原109(CD109)是一種細胞表面抗原，屬于α2-巨球蛋白家族成員，在鱗狀細胞癌進展中屬于具有高風險性的分子標志物。在膠質(zhì)瘤、鱗狀細胞癌、基底細胞樣乳腺癌等多種腫瘤中均呈高表達狀態(tài)[9]。本實驗驗證了CD109在宮頸鱗狀細胞癌患者血清中的表達水平，結(jié)果顯示，CSCC患者血清中CD109的水平明顯高于宮頸息肉患者，可見，CD109可作為宮頸鱗狀細胞癌的特異性標志物。

CEA為一種特異性胚胎抗原酸性蛋白，可通過促進癌細胞DNA分裂途徑，增加癌細胞浸潤風險，也是腫瘤患者常見的檢測標志物[10]。血清鱗狀細胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCCA)作為一種特異性較好的宮頸癌標志物，能參與細胞基因調(diào)控、基質(zhì)降解，特異性反映細胞增殖、浸潤與轉(zhuǎn)移情況[11]，已廣泛應用于宮頸癌的診斷中。但單獨檢測CSCC患者血清SCCA水平，對于診斷宮頸癌的靈敏度較低，不利于宮頸癌的有效檢出。由于早期宮頸癌患者無明顯臨床癥狀，且發(fā)病緩慢，癥狀一旦出現(xiàn)，往往錯過最佳治療時機，嚴重影響了患者的治療效果及預后。研究表明，CSCC患者血清中SCCA水平的增高，與患者的臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度及腫瘤大小等均存在一定的相關(guān)性，而且SCCA的水平還會隨著患者宮頸癌肌層浸潤深度的不斷加深而逐漸增高[12]。

通過相關(guān)性分析得出，血清中各指標的表達水平之間存在顯著的相關(guān)性，因此，本實驗聯(lián)合檢測CSCC患者血清中CEA和SCCA的水平，發(fā)現(xiàn)其聯(lián)合檢測的靈敏度均高于各項指標的單項檢測結(jié)果，準確度高于miR-221和CD109的單獨檢測結(jié)果?？梢姡?lián)合檢測CSCC常見的腫瘤標志物檢測提高了宮頸鱗狀細胞癌的早期診斷效率，也為臨床上早期診斷CSCC提供了一定的理論數(shù)據(jù)。