中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系(410078)

劉亦萍 楊土保 王婷婷 張森茂 陳樂陶 羅 柳 刁靜怡 李金琦 李依寰 孫夢(mèng)婷 宋欣俐 魏劍暉 舒 靖 秦家碧△

【提 要】 目的 探討母親胱硫醚β-合成酶(cystathionine β synthase，CBS)基因多態(tài)性與子代先心病(congenital heart disease，CHD)及其亞型的關(guān)聯(lián)，為CHD遺傳易感標(biāo)志物的研究提供流行病學(xué)依據(jù)。方法 以464例單純CHD患兒母親為病例組，504例正常兒童母親為對(duì)照組，開展病例對(duì)照研究。通過問卷調(diào)查，收集研究對(duì)象的基本信息。完成調(diào)查問卷后，采集5ml血液，用于CBS基因多態(tài)性的檢測(cè)。利用多因素logistic回歸模型評(píng)估CBS基因多態(tài)性與CHD及亞型的關(guān)聯(lián)；利用Haploview 4.2軟件的四配子法構(gòu)建單倍型，評(píng)估單倍型與CHD的關(guān)聯(lián)；利用廣義多因子降維法(GMDR)分析基因-基因交互作用與CHD的關(guān)聯(lián)。結(jié)果 多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，母親CBS基因位點(diǎn)rs2851391和rs234714的多態(tài)性與子代CHD及其兩種亞型(ASD和PDA)的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)；且經(jīng)FDR調(diào)整后，關(guān)聯(lián)仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(QFDR<0.05)。5個(gè)SNP位點(diǎn)均與VSD的發(fā)生無關(guān)(QFDR>0.05)。GMDR分析結(jié)果顯示，5個(gè)SNP位點(diǎn)的基因-基因交互作用模型與子代CHD的發(fā)生無關(guān)(P>0.05)。rs1051319和rs2851391位點(diǎn)構(gòu)成的單倍型G-T可能與子代CHD的發(fā)生有關(guān)(QFDR<0.05)。結(jié)論 母親CBS基因多態(tài)性與子代CHD、ASD和PDA的發(fā)生有關(guān)，CBS基因位點(diǎn)構(gòu)成的單倍型(G-T)也與子代CHD的發(fā)生有關(guān)。

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)是我國(guó)最常見的出生缺陷[1]，其發(fā)生與遺傳和環(huán)境因素密切相關(guān)[2]。流行病學(xué)研究表明，圍孕期增補(bǔ)葉酸可有效降低胎兒CHD的風(fēng)險(xiǎn)[3]，但這種風(fēng)險(xiǎn)降低的潛在機(jī)制尚不清楚。關(guān)注葉酸/同型半胱氨酸(Hcy)代謝相關(guān)基因與CHD的關(guān)聯(lián)，可幫助解釋一部分機(jī)制。胱硫醚β-合成酶(cystathionine β synthase，CBS)是體內(nèi)Hcy轉(zhuǎn)硫途徑的關(guān)鍵酶之一，其活性受CBS基因調(diào)控。該基因變異可導(dǎo)致CBS活性降低，造成高同型半胱氨酸血癥(HHcy)，從而影響胚胎心臟發(fā)育[4-7]。因此，CBS基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)可能與CHD的發(fā)生有關(guān)。既往關(guān)于該主題的研究主要集中在少數(shù)幾個(gè)SNPs上，且研究結(jié)果不一致[8-11]。本研究評(píng)估母親CBS基因多個(gè)SNPs與CHD及其亞型包括室間隔缺損(VSD)、房間隔缺損(ASD)、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉(PDA)的關(guān)系，為CHD遺傳易感標(biāo)志物的研究提供流行病學(xué)依據(jù)。

資料與方法

1.研究對(duì)象

選取2018年3月至2019年8月湖南省兒童醫(yī)院心胸外科所收治的464例0～1歲單純CHD患兒的母親為病例組。464例患兒CHD各類型的百分比分別為：ASD 78例(16.8%)，VSD 286例(61.6%)，房室間隔缺損50例(10.8%)，PDA 130例(28.0%)，主肺動(dòng)脈隔缺損6例(1.3%)，法洛四聯(lián)癥26例(5.6%)，完全大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位2例(0.4%)。對(duì)照組為同一時(shí)期在湖南省兒童醫(yī)院就診的0～1歲正常兒童母親。

2.問卷調(diào)查

本研究使用統(tǒng)一的調(diào)查問卷，由經(jīng)培訓(xùn)過的調(diào)查員對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行面訪調(diào)查。調(diào)查內(nèi)容包括：母親文化程度、懷孕時(shí)年齡、死胎或死產(chǎn)史、自然流產(chǎn)史、早產(chǎn)史、妊娠糖尿病史、妊娠高血壓史、家族三代近親婚配史、家族成員先天畸形史、孕前感冒、孕前吸煙、孕前暴露在二手煙環(huán)境、孕前飲酒、孕前有飲茶習(xí)慣、長(zhǎng)期居住地附近有可疑環(huán)境污染源、染發(fā)或燙發(fā)、懷孕前或孕期服用葉酸和飼養(yǎng)或親密接觸寵物等。

3.DNA提取和基因型檢測(cè)

完成調(diào)查問卷后，取研究對(duì)象3～5ml外周靜脈血，使用QIAamp DNA Mini kit按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程提取DNA，用于基因分型。參考相關(guān)文獻(xiàn)介紹的方法[12]，篩選基因的待檢位點(diǎn)。具體為：檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找CBS基因的主要SNP位點(diǎn)，并結(jié)合HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)核實(shí)SNP位點(diǎn)信息，要求各位點(diǎn)最小等位基因頻率(MAF)≥10%。最終選擇了9個(gè)基因位點(diǎn)(rs12613、rs234783、rs234784、rs2851391、rs2298759、rs234785、rs234713、rs234714、rs1051319)作為本研究的待檢基因位點(diǎn)。利用Massarray飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行SNP檢測(cè)，具體檢測(cè)工作由博淼生物科技(北京)有限公司完成。

4.統(tǒng)計(jì)分析

利用Epidata3.0軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。涉及多重比較時(shí)，采用錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)校正的方法調(diào)整P值以控制假陽(yáng)性率，得到校正P值(QFDR)，并以QFDR<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[13]。計(jì)數(shù)資料采用率或構(gòu)成比進(jìn)行描述，比較采用χ2檢驗(yàn)或者Fisher精確概率法；等級(jí)資料采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。運(yùn)用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行對(duì)照組SNP位點(diǎn)的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。采用logistic回歸計(jì)算所有的比值比(OR)和95%置信區(qū)間(CIs)，多因素logistic回歸計(jì)算調(diào)整混雜因素后的OR和95%CIs。分析在三種遺傳模型下，SNP位點(diǎn)與CHD的關(guān)系，三種遺傳模型包括隱性模型(純合突變型 vs 野生型+雜合型)、顯性模型(純合突變型+雜合型 vs 野生型)和加性模型(純合突變型 vs 雜合型 vs 野生型)。利用Haploview 4.2軟件計(jì)算不同SNP位點(diǎn)之間的r2值，r2<0.8表明SNP位點(diǎn)之間不存在連鎖不平衡；同時(shí)，利用四配子檢驗(yàn)的方法構(gòu)建單倍型塊，并分析各單倍型在病例組和對(duì)照組之間的分布?；趶V義多因子降維法(GMDR)進(jìn)行基因-基因交互作用分析，在模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的情況下，測(cè)試樣本的準(zhǔn)確度越大、交叉驗(yàn)證一致性(CVC)越接近10，模型越好。

結(jié) 果

1.兩組基線資料的比較

病例組和對(duì)照組基線資料的比較結(jié)果見表1，在后續(xù)多因素分析中，將對(duì)兩組間比較有差異的變量(P<0.05)進(jìn)行調(diào)整。

表1 基線資料比較

2.對(duì)照組基因Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

CBS基因型分布頻率以及對(duì)照組人群中SNP位點(diǎn)的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果如表2所示。僅rs234784位點(diǎn)不符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律(P<0.05)。此外，rs2298759、rs12613和rs234713三個(gè)位點(diǎn)在研究人群中MAF<0.05，也不參與后續(xù)分析。

表2 母親CBS基因型分布頻率及對(duì)照組Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

3.母親CBS基因多態(tài)性與子代CHD的關(guān)聯(lián)分析

多因素logistic回歸分析及FDR調(diào)整P值的結(jié)果如表3所示，在隱性遺傳模型下，rs2851391位點(diǎn)和rs234714位點(diǎn)與子代CHD及ASD的關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(QFDR<0.05)；rs2851391位點(diǎn)與子代PDA的關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(QFDR<0.05)。在加性遺傳模型下，rs2851391位點(diǎn)和rs234714位點(diǎn)與子代PDA的關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(QFDR<0.05)。rs2851391位點(diǎn)和rs234714位點(diǎn)的純合突變型TT增加了子代CHD、ASD以及PDA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

表3 母親CBS基因多態(tài)性與子代CHD的關(guān)聯(lián)

4.連鎖不平衡及單倍型分析

連鎖不平衡分析顯示，各位點(diǎn)間不存在連鎖不平衡。單倍型分析顯示，5個(gè)SNP共形成了1個(gè)單倍型塊(block)(圖1)，單倍型在兩組間的分布情況如表4所示。Block1內(nèi)包含2個(gè)位點(diǎn)：rs1051319與rs2851391，構(gòu)成3種單倍型：G-C、G-T、C-C；其中，G-T(χ2=8.653，QFDR=0.004)，單倍型的頻率分布在兩個(gè)組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各位點(diǎn)LD圖

表4 SNP位點(diǎn)形成的單倍型在病例組和對(duì)照組中的分布情況

5.基因-基因交互作用分析

結(jié)果顯示，基因-基因交互作用模型均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示5個(gè)SNP位點(diǎn)的基因-基因交互作用模型可能與子代CHD的發(fā)生無關(guān)(表5)。

表5 基因-基因的交互作用

討 論

本研究評(píng)估了母親CBS基因多態(tài)性與子代CHD的關(guān)聯(lián)，多因素logistic回歸分析顯示，母親CBS基因位點(diǎn)rs2851391和rs234714的純合突變型TT增加了子代CHD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)FDR調(diào)整P值后，兩個(gè)位點(diǎn)與子代CHD的關(guān)聯(lián)仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究發(fā)現(xiàn)，rs2851391位點(diǎn)的基因多態(tài)性降低了CBS的活性[14]，且該位點(diǎn)TT基因型的受試者血漿Hcy水平明顯高于TC和CC基因型[15]。Hcy的增多，對(duì)胚胎的發(fā)育有毒性作用，可以氧化巰基產(chǎn)生自由基，干擾早期心血管生長(zhǎng)發(fā)育[16]；HHcy會(huì)產(chǎn)生大量S-腺苷蛋氨酸，影響DNA的甲基化程度，有研究表明在胚胎形成過程中異常的DNA甲基化可能是先天缺陷的致病因素[17]。

占先心病前3位的亞型分別是：VSD、ASD、PDA[18-19]，與本研究的CHD亞型構(gòu)成比一致，所以對(duì)母親CBS基因多態(tài)性與子代CHD三種亞型的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了評(píng)估。多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，CBS基因兩個(gè)位點(diǎn)rs2851391和rs234714的純合突變型TT增加了子代ASD、PDA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。且經(jīng)FDR調(diào)整P值后，兩個(gè)位點(diǎn)與ASD、PDA的關(guān)聯(lián)仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。總的來說，rs2851391和rs234714的純合突變型TT是CHD、ASD以及PDA發(fā)病的危險(xiǎn)因素，暫未發(fā)現(xiàn)與VSD發(fā)病有關(guān)。研究結(jié)果提示，不同CHD亞型遺傳易感因素可能存在差別，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

在單個(gè)基因位點(diǎn)多態(tài)性分析的基礎(chǔ)上，為了增加遺傳統(tǒng)計(jì)效力，對(duì)5個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了單倍型的構(gòu)建，形成了一個(gè)包含rs1051319和rs2851391的單倍型塊。其中G-T單倍型可能與子代CHD的發(fā)生有關(guān)(QFDR<0.05)，是子代CHD發(fā)病的危險(xiǎn)因素(OR=1.366)。

葉酸/Hcy的代謝非常復(fù)雜，胚胎細(xì)胞中的葉酸/Hcy水平可能受基因-基因交互作用影響。因此，本研究進(jìn)一步分析不同位點(diǎn)間的交互作用。結(jié)果顯示，5個(gè)SNP的基因-基因交互作用模型可能與子代CHD的發(fā)生無關(guān)(P>0.05)。

研究的局限性：第一，本研究是基于醫(yī)院的病例對(duì)照研究，只選擇了一所醫(yī)院，可能影響研究對(duì)象的代表性，存在一定的選擇偏倚。第二，盡管在分析母親CBS基因多態(tài)性與子代CHD及亞型的關(guān)系時(shí)調(diào)整了許多混雜因素，但仍不能完全排除潛在的殘留混雜。第三，由于樣本量的限制，ASD、VSD和PDA以外的CHD亞型與基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)沒有進(jìn)一步研究。

綜上所述，母親CBS基因多態(tài)性與子代CHD、ASD和PDA的發(fā)生有關(guān)，CBS基因位點(diǎn)構(gòu)成的單倍型(G-T)也與子代CHD的發(fā)生有關(guān)。