陶新梅，曾 利

(巴中市中心醫(yī)院產(chǎn)科，四川 巴中 636000)

妊娠期正常的羊水量對(duì)維持胎兒生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，羊水過少指妊娠晚期羊水量低于300mL，是一種常見的妊娠并發(fā)癥，會(huì)引起胎兒結(jié)構(gòu)異常、生長(zhǎng)受限及各種出生后綜合征[1-2]。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)通道，主要負(fù)責(zé)體內(nèi)水分子的運(yùn)輸[3]，AQP9作為一類對(duì)水具有高度選擇性的通道蛋白，在孕婦胎盤、胎膜上的分布和調(diào)控胎膜兩側(cè)羊水平衡及其與羊水量異常的相關(guān)性研究廣受關(guān)注[4]。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一種酸性蛋白質(zhì)，廣泛表達(dá)于人體的肝、腎組織等，有研究發(fā)現(xiàn)在人體胎盤胎膜中也有表達(dá)，而絨毛間質(zhì)細(xì)胞是主要合成及分泌細(xì)胞，HGF是妊娠中的重要因子，能通過促進(jìn)絨毛血管新生，調(diào)節(jié)胎盤形態(tài)[5]。既往研究發(fā)現(xiàn)，HGF表達(dá)水平降低會(huì)減少絨毛數(shù)量，減少胎盤血管生成，導(dǎo)致缺血缺氧、胎兒窒息等疾病[6]。本研究通過檢測(cè)羊水過少和正常孕產(chǎn)婦胎盤和胎膜組織中AQP9、HGF表達(dá)水平的差異，研究AQP9、HGF與妊娠結(jié)局間的相關(guān)性，以期為臨床診療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究收集2017年3月至2021年3月在巴中市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科分娩的羊水過少的114例孕產(chǎn)婦為觀察組，平均年齡(26.02±3.62)歲，平均孕周(39.52±3.61)周；另隨機(jī)收集同期114例羊水正常孕產(chǎn)婦為對(duì)照組，平均年齡(25.51±3.12)歲，平均孕周(39.45±3.25)周；兩組孕產(chǎn)婦的年齡、孕周和產(chǎn)前體重之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期間無明顯感染及服藥史，無黃體酮等保胎治療史；②孕周大于37周，小于41周；③觀察組孕婦經(jīng)B超檢查后符合羊水過少診斷[7]；④單胎；⑤經(jīng)檢查未見胎兒畸形等疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有婦科腫瘤；②伴有妊娠期高血壓疾病、妊娠期糖尿病等；③存在呼吸、循環(huán)、泌尿等重大臟器并發(fā)癥；④合并胎膜早破者。所有患者及家屬均簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 研究方法

本研究采用免疫組化方法檢測(cè)胎盤和胎膜組織中AQP9和HGF的表達(dá)。具體步驟如下：①標(biāo)本采集及固定：所有孕產(chǎn)婦胎盤娩出后，將胎盤的母體面分為四個(gè)象限，在每個(gè)中心取2塊1.0cm×1.0cm×1.0cm的胎盤組織和直徑2cm的胎膜組織，避開出血、鈣化及梗死區(qū)域，采集的標(biāo)本用甲醛溶液固定24～48h以上，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(厚度：4μm)。②利用免疫組化方法檢測(cè)AQP9、HGF的表達(dá)：用3%H2O2清除過氧化物酶后中加入特異性兔抗人AQP9多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，濃度1:50)，以及兔抗人HGF多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司，濃度1:100)，4°C冰箱過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗2min；采用PV-9000兩步法(北京中山生物技術(shù)公司)進(jìn)行免疫組化染色；同時(shí)使用DAB顯色，經(jīng)過蘇木精復(fù)染且脫水封片后在高倍顯微鏡下觀察AQP9和HGF的表達(dá)。③結(jié)果判讀：利用鏡下在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕色顆粒為陽性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)。每張切片在高倍鏡視野下，選取5個(gè)隨機(jī)視野，進(jìn)行觀察記錄。根據(jù)細(xì)胞染色程度和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分，染色程度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：強(qiáng)著色3分，中等著色2分，淺著色1分，不著色0分；陽性細(xì)胞數(shù)百分比計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為0分：著色細(xì)胞數(shù)≤5%，1分：5%～10%，2分：11%～50%，3分：>50%。最終組織學(xué)積分結(jié)果為染色程度得分和陽性細(xì)胞百分比得分之和。

1.3 觀察指標(biāo)

①兩組孕產(chǎn)婦胎盤組織和胎膜組織中AQP9、HGF的表達(dá)情況和相關(guān)性；②兩組孕產(chǎn)婦的妊娠結(jié)局情況，剖宮產(chǎn)和產(chǎn)程異常的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》[8]；③羊水過少孕產(chǎn)婦胎盤和胎膜組織中AQP9和HGF的表達(dá)與妊娠結(jié)局的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般情況比較

觀察組114例孕產(chǎn)婦的平均年齡為(26.02±3.62)歲，平均孕周(39.52±3.61)周，產(chǎn)前平均體重為(75.89±7.11)kg；對(duì)照組孕產(chǎn)婦平均年齡為(25.51±3.12)歲，平均孕周(39.45±3.25)周，產(chǎn)前平均體重為(75.31±6.93)kg；兩組孕產(chǎn)婦的年齡、孕周和產(chǎn)前體重之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意差異(t值分別為1.14、0.15、0.62，P>0.05)，兩組具有可比性，見表1。

表1 兩組患者的一般情況比較

2.2 兩組患者胎盤和胎膜組織中AQP9、HGF的表達(dá)情況

兩組孕產(chǎn)婦的胎盤和胎膜組織中均有AQP9和HGF的表達(dá)；胎盤組織中AQP9和HGF主要在胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜中表達(dá)，如圖1、圖2；胎膜組織中AQP9和HGF主要在胎盤上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜中表達(dá)，如圖3、圖4。觀察組孕產(chǎn)婦胎盤和胎膜組織中AQP9和HGF的表達(dá)水平均低于對(duì)照組(t值分別為27.03、33.31、18.17、12.27，P<0.01),見表2。

表2 兩組孕產(chǎn)婦胎盤和胎膜組織中AQP9、HGF表達(dá)的組織學(xué)積分比較

注：A對(duì)照組胎盤組織AQP9；B觀察組胎盤組織AQP9。

注：A對(duì)照組胎盤組織HGF；B觀察組胎盤組織HGF。

注：A對(duì)照組胎膜組織AQP9；B觀察組胎膜組織AQP9。

注：A對(duì)照組胎膜組織HGF；B觀察組胎膜組織HGF。

2.3 兩組患者AQP9和HGF在胎盤、胎膜組織中表達(dá)的相關(guān)性

觀察組胎盤和胎膜組織中AQP9的表達(dá)與HGF的表達(dá)均呈正相關(guān)(r值分別為0.69和0.82，P<0.05)；對(duì)照組胎盤和胎膜組織中AQP9的表達(dá)與HGF的表達(dá)無明顯相關(guān)性(r值分別為0.10和0.21，P>0.05)，見表3。

表3 兩組患者AQP9和HGF在胎盤、胎膜組織中表達(dá)的相關(guān)性

2.4 兩組患者妊娠結(jié)局的比較

觀察組孕產(chǎn)婦不良妊娠結(jié)局總發(fā)生率(90.35%)明顯高于對(duì)照組(37.72%)(χ2=68.56，P<0.01)；觀察組不良妊娠結(jié)局中剖宮產(chǎn)和產(chǎn)程異常發(fā)生率均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為35.86和10.28，P<0.01)，見表4。

表4 兩組孕產(chǎn)婦妊娠結(jié)局比較[%(n/N)]

2.5 羊水過少孕產(chǎn)婦胎盤、胎膜組織中AQP9和HGF的表達(dá)與妊娠結(jié)局的相關(guān)性

羊水過少孕產(chǎn)婦胎盤和胎膜組織中AQP9和HGF的表達(dá)與剖宮產(chǎn)呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.20、-0.39、-0.22、-0.31，P<0.05)；羊水過少孕產(chǎn)婦胎盤和胎膜組織中AQP9和HGF的表達(dá)與產(chǎn)程異常的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)性(r值分別為-0.27、-0.34、-0.26、-0.36，P<0.05)，見表5。

表5 羊水過少孕產(chǎn)婦胎盤和胎膜中AQP9和HGF的表達(dá)與不良妊娠結(jié)局的相關(guān)性

3 討論

羊水是胎兒能夠在母體內(nèi)正常生存的基本環(huán)境，能通過穩(wěn)定子宮內(nèi)部溫度環(huán)境、提供胎兒內(nèi)部環(huán)境及緩沖外部壓力等，在正常妊娠過程中，隨著孕周增加，羊水量在孕38周時(shí)可以達(dá)到1 000mL[9]。羊水過少是指孕產(chǎn)婦在妊娠28周以后的羊水量少于300mL，臨床上主要是根據(jù)B超進(jìn)行診斷，羊水過少的羊水指數(shù)≤5cm或者羊水最大暗區(qū)深度≤2cm可以診斷為羊水過少[10]。羊水量的改變對(duì)于維持母嬰臨床結(jié)局具有重要意義，羊水過少的發(fā)生能夠在增加胎兒宮內(nèi)窘迫、新生兒窒息、胎兒發(fā)育畸形等方面發(fā)揮消極作用；羊水過少的原因可以分為胎盤功能異常、母體原因、羊膜病變及胎兒畸形等[11]。

3.1 羊水過少孕產(chǎn)婦胎盤和胎膜組織中AQP9、HGF的表達(dá)和意義

AQP是一類通道蛋白，對(duì)水分子具有高度選擇性，目前已發(fā)現(xiàn)13種水通道蛋白[12]，統(tǒng)稱為AQP家族。AQP9最早發(fā)現(xiàn)于脂肪組織，隨后逐漸發(fā)現(xiàn)腦、肺、肝及胎盤等組織器官中也存在。本研究結(jié)果表明，孕產(chǎn)婦的胎盤和胎膜組織中均有AQP9表達(dá)，胎盤組織中AQP9主要在胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜中表達(dá)，胎膜組織中AQP主要在胎盤上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜中表達(dá)。AQP9能夠通過長(zhǎng)期、短期調(diào)節(jié)方式，從而影響細(xì)胞膜對(duì)水分子通透性，在胎盤胎膜上還能夠轉(zhuǎn)運(yùn)嘧啶、嘌呤等小分子物質(zhì)，通過影響滲透濃度梯度影響羊水量。既往有研究結(jié)果認(rèn)為，當(dāng)羊水量異常時(shí)，AQP9在羊膜的表達(dá)量與羊水量呈正相關(guān)，在胎盤的表達(dá)量則與羊水量呈負(fù)相關(guān)[13]。然而，AQP9 是參與羊水量異常的病理形成過程還是僅參與羊水量異常的代償性調(diào)節(jié)，其分子調(diào)節(jié)機(jī)制仍未知[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羊水過少孕產(chǎn)婦胎盤和胎膜組織中AQP9的表達(dá)水平明顯低于羊水正常組，提示胎盤和胎膜組織中AQP9的表達(dá)水平與羊水過少的發(fā)生存在負(fù)相關(guān)。

HGF是一種廣泛存在于體內(nèi)的酸性蛋白質(zhì)，具有能夠啟動(dòng)肝再生、促進(jìn)細(xì)胞分裂、促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)散和遷移等作用，在胎盤胎膜中也廣泛存在，由絨毛間質(zhì)細(xì)胞合成并分泌，調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞，促進(jìn)胎盤絨毛血管新生，維持胎盤形態(tài)，是妊娠維持的重要作用因子。胎盤中HGF水平的降低可能會(huì)使絨毛數(shù)量發(fā)生改變，從而影響胎兒呼吸[15]。本研究結(jié)果也表明孕產(chǎn)婦的胎盤和胎膜組織中均有HGF的表達(dá)，胎盤組織中HGF主要在胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜中表達(dá)，胎膜組織中HGF主要在胎盤上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜中表達(dá)；同時(shí)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羊水過少孕產(chǎn)婦胎盤和胎膜組織中HGF的表達(dá)水平明顯低于羊水正常組，提示胎盤和胎膜組織中HGF的表達(dá)水平與羊水過少的發(fā)生存在負(fù)相關(guān)。此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)羊水過少孕產(chǎn)婦的胎盤和胎膜組織中AQP9的表達(dá)與HGF的表達(dá)均呈正相關(guān)，而羊水正常的孕產(chǎn)婦胎盤和胎膜組織中AQP9的表達(dá)與HGF的表達(dá)無明顯相關(guān)性，提示胎盤和胎膜組織中AQP9和HGF的表達(dá)對(duì)羊水過少存在一定的協(xié)同作用。

3.2 胎盤和胎膜組織中AQP9、HGF表達(dá)與妊娠結(jié)局的相關(guān)性

既往研究結(jié)果表明，羊水過少會(huì)導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)發(fā)育受限，容易增加胎兒發(fā)生宮內(nèi)窘迫，在臨產(chǎn)中出現(xiàn)宮縮，容易壓迫臍帶，引起胎兒窒息[16]。羊水過少也容易降低胎兒對(duì)宮縮的耐受力，增加孕產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)概率；同時(shí)，羊水過少也會(huì)導(dǎo)致分娩時(shí)羊水沖洗能力下降，引起感染等。本研究結(jié)果顯示，觀察組孕產(chǎn)婦不良妊娠結(jié)局總發(fā)生率(90.35%)高于對(duì)照組(37.72%)，其中觀察組剖宮產(chǎn)率(74.56%)和產(chǎn)程異常率(15.79%)也高于對(duì)照組剖宮產(chǎn)率(35.09%)和產(chǎn)程異常率(2.63%)，與既往研究結(jié)果基本一致。同時(shí)，本研究相關(guān)性分析顯示，羊水過少孕產(chǎn)婦胎盤和胎膜組織中AQP9和HGF的表達(dá)與剖宮產(chǎn)和產(chǎn)程異常的發(fā)生均呈負(fù)相關(guān)，提示羊水過少產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)和產(chǎn)程異?？赡芘cAQP9和HGF表達(dá)水平降低有關(guān)。AQP9表達(dá)水平的降低減少母體和胎兒的液體交換，減少羊水生成，同時(shí)改變羊水的通透性，減少羊水的重吸收。另外，HGF的表達(dá)水平降低，可導(dǎo)致胎盤血管改變，減少血管生成及羊水生成，與AQP9具有協(xié)同作用，最終導(dǎo)致孕產(chǎn)婦妊娠結(jié)局改變。刑寧寧等[17]研究認(rèn)為，AQP1與HGF的異常表達(dá)共同影響胎盤血管，引起內(nèi)環(huán)境改變，減少羊水量，影響妊娠結(jié)局。

綜上所述，羊水過少孕產(chǎn)婦胎盤和胎膜組織中AQP9和HGF的表達(dá)水平較低，且均呈正相關(guān)；羊水過少孕產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)率、產(chǎn)程異常的發(fā)生率均增加，而胎盤和胎膜組織中AQP9和HGF的表達(dá)與不良妊娠結(jié)局的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。但本次研究中選取的研究對(duì)象來源較局限，存在地域、人文等因素的差異，可能存在一定的誤差。需擴(kuò)大樣本數(shù)量后進(jìn)行更為深入的探究。