賈鑫，王鋒，劉寶輝，楊凱強，王玉玖，董圣軍

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濱州 256600)

主動脈夾層(aortic dissection,AD)是主動脈壁的急性病變，伴有由于破裂或壁內(nèi)血腫引起的中膜分離[1]。主動脈夾層的發(fā)病率為每年每百萬人5至30例。急性主動脈夾層是一種高度致命的心血管急癥，未經(jīng)治療的患者在癥狀發(fā)作后每小時的致死率為1%～2%[2]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)主動脈夾層等大血管疾病的發(fā)病機制與血管壁結(jié)構(gòu)破壞、中層血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)大量消失及血管壁的重塑有關(guān)，而VSMCs表型轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解是導(dǎo)致這一病理過程的重要因素[3]。因此，深入了解VSMCs表型轉(zhuǎn)化的發(fā)病機制，尋找更有效、更安全的干預(yù)目標(biāo)，對AD的防治具有重要的臨床價值和社會意義。仙茅屬植物為仙茅科天門冬目，其中仙茅苷(curculigoside，Cur)是仙茅的主要活性成分。目前已有研究發(fā)現(xiàn)仙茅苷對心血管系統(tǒng)有明顯的保護作用[4-5]。但其在血管平滑肌細(xì)胞中的影響和機制方面的研究相對較少。

此次研究使用體外方式進(jìn)行實驗，先對大鼠的胸主動脈的平滑肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，將其通過脂多糖誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，探討仙茅苷對主動脈血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化的作用及其機制。旨在為仙茅苷臨床用于主動脈夾層的治療提供理論依據(jù)和新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 從濟南朋月實驗動物繁育有限公司購買30只無特定病原體的雄性SD大鼠(體質(zhì)量180～210 g)。許可證號：SYXK(魯)20190003。所有大鼠在濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動物房內(nèi)飼養(yǎng)和訓(xùn)練，許可證號：SYXK(魯)20180022。飼養(yǎng)期間所有大鼠自由飲食，室內(nèi)溫度20～25 ℃，濕度45%～55%。

1.2 試劑與儀器 噻唑藍(lán)(MTT，北京索萊寶公司)；仙茅苷標(biāo)準(zhǔn)品(上海鼎瑞化工有限公司)。兔源抗大鼠MMP-9、α-SMA、NF-κB和β-actin 抗體(美國Abcam公司)；羊抗鼠IgG(美國Abcam公司)；細(xì)胞裂解蛋白提取液、BCA試劑盒以及蛋白酶抑制劑(上海碧云天生物公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Biopac公司)；電泳、濕轉(zhuǎn)移槽以及Western blot發(fā)光照相系統(tǒng)(美國Rio-Red公司)；酶標(biāo)儀(美國Biotech公司)；生物顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng) 將實驗所需大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞通過組織貼塊法進(jìn)行培養(yǎng)[6]。實驗大鼠處死后將其胸主動脈小心取出并除去其外周殘存的結(jié)締組織，然后將其剪成1 mm大小的組織塊，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，使其瓶底向上，在其中添加細(xì)胞培養(yǎng)基5 mL，置于培養(yǎng)箱中，在30 ℃ 5% CO2條件下進(jìn)行3 h孵育處理，在培養(yǎng)瓶中組織塊完全與培養(yǎng)瓶底貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)，以保證其中組織塊能夠被培養(yǎng)基完全覆蓋，培養(yǎng)7 d后將培養(yǎng)瓶取出更換其中的培養(yǎng)基，對VSMCs的繁殖情況進(jìn)行觀察，然后每隔一天對培養(yǎng)基進(jìn)行更換到細(xì)胞完全融合成片為止。

1.3.2 細(xì)胞分組及處理 原代VSMCs傳代培養(yǎng)4-6代，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長現(xiàn)象，當(dāng)細(xì)胞密度>90%，且形態(tài)良好時則可進(jìn)行分組干預(yù)：①對照(control)組：DMSO 溶劑對照組(0.1%)培養(yǎng)24 h；②脂多糖(LPS)組：給予1 μg·mL-1LPS培養(yǎng)24 h；③脂多糖+仙茅苷(LPS+Cur)組：加入Cur(2.5、5、10 μmol·L-1)0.5 h后再加入1 μg·mL-1LPS培養(yǎng)24 h；④Cur組：加入10 μmol·L-1的Cur進(jìn)行干預(yù)后培養(yǎng)24 h。

1.3.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖率 將各組VSMCs通過添加10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行處理，得到相應(yīng)的單個細(xì)胞懸液，然后按照每孔1 000～10 000個細(xì)胞的接種量，200 μL/孔的標(biāo)準(zhǔn)將其加入96孔板中，然后進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)，每組設(shè)置6個復(fù)孔，接種完成后，將其置于環(huán)境為37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行48 h的細(xì)胞培養(yǎng)，之后取出96孔板，棄去其中剩余培養(yǎng)液，按照每孔20 μL向其中添加5 mg·mL-1的MTT溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后將孔內(nèi)剩余的培養(yǎng)上清液小心清除。按照每孔150 μL的要求向其中添加DMSO，然后振蕩10 min，確保其中的結(jié)晶物能夠完全融解。將所得液體置于酶聯(lián)免疫檢測儀中，在490 nm波長下檢測并記錄各孔的光吸收值，然后根據(jù)所得結(jié)果繪制橫縱坐標(biāo)分別為時間和吸光值的細(xì)胞生長曲線。重復(fù)進(jìn)行3次。增殖抑制率=(對照組OD值-各組實驗組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.3.4 細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移率 詳細(xì)實驗操作基于相關(guān)參考文獻(xiàn)確定[7]。傳代處理血管平滑肌細(xì)胞后，按照5×105的規(guī)格將其接種到6孔板中，對其進(jìn)行相應(yīng)處理后，通過潔凈槍頭在板表面垂直劃平行的3條劃痕。以此計時為0 h，拍照后將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h取出拍照，根據(jù)劃痕寬度變化計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5 通過Western blot法對細(xì)胞中MMP-9、α-SMA以及NF-κB蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢驗 各組細(xì)胞經(jīng)上述干預(yù)因素處理48 h后提取細(xì)胞蛋白，并根據(jù)BCA法所測蛋白濃度調(diào)整加入各組蛋白樣品的體積，保證各組蛋白上樣樣品質(zhì)量一致。依次通過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，滴加一抗α-SMA、MMP-9、NF-κB(1∶1 000稀釋)4℃過夜，洗膜、孵育對應(yīng)二抗、再次洗膜后用現(xiàn)配發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影，Bio-Rad照相系統(tǒng)進(jìn)行照相并分析蛋白的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 將所得實驗數(shù)據(jù)通過SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理分析，所得結(jié)果均通過加減標(biāo)準(zhǔn)差的形式進(jìn)行表示，在比較不同組情況時，將兩兩間的比較t檢驗進(jìn)行驗證，多組間的比較通過One-way ANOVA方法進(jìn)行驗證，若檢驗結(jié)果顯示P<0.05，則組間差異顯著，存在統(tǒng)計價值。

2 結(jié)果

2.1 仙茅苷影響血管平滑肌細(xì)胞增殖率的情況 根據(jù)MTT比色法對其進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)LPS組相較于控制組而言，在給予細(xì)胞LPS處理后，其OD值出現(xiàn)明顯提高(P<0.001)；而比較LPS組細(xì)胞OD值和LPS+Cur組細(xì)胞OD值，發(fā)現(xiàn)后者的OD值顯著下降(P<0.01)；Cur組細(xì)胞增殖率與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。表明LPS預(yù)處理血管平滑肌細(xì)胞可明顯增加血管平滑肌細(xì)胞增殖，而仙茅苷可明顯抑制脂多糖對血管平滑肌細(xì)胞的增殖作用(見表1)。

表1 仙茅苷對血管平滑肌細(xì)胞增殖率的影響

2.2 仙茅苷對血管平滑肌細(xì)胞遷移率的影響 與對照組相比，LPS誘導(dǎo)的主動脈血管平滑肌細(xì)胞遷移率升高(P<0.001)；而與LPS組相比，LPS+Cur組主動脈血管平滑肌細(xì)胞遷移率降低(P<0.01)；Cur組與對照組相比細(xì)胞遷移率無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。表明給予大鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞仙茅苷能夠抑制因LPS刺激引起的細(xì)胞遷移(見表2)。

表2 仙茅苷對血管平滑肌細(xì)胞遷移率的影響

2.3 仙茅苷對血管平滑肌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 與對照組相比，LPS組細(xì)胞內(nèi)MMP-9及NF-κB蛋白表達(dá)量明顯增加，而α-SMA蛋白表達(dá)量顯著減少(P<0.01)；LPS+Cur組細(xì)胞內(nèi)MMP-9及NF-κB蛋白表達(dá)量與LPS組相比減少明顯，α-SMA蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；Cur組與對照組相比無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。表明仙茅苷可抑制脂多糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)，且其機制可能與NF-κB信號通路有關(guān)(見圖1)。

圖1 仙茅苷對血管平滑肌細(xì)胞α-SMA、MMP-9以及NF-κB蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

主動脈夾層(AD)是常見的危及生命的疾病。由諸如馬凡綜合癥狀基因突變引起的AD被稱為可遺傳的AD，自發(fā)發(fā)生而沒有已知基因突變的AD被稱為散發(fā)的AD，并且與高齡、性別、吸煙、高血壓和血脂異常等危險因素相關(guān)[8]。遺傳性和散發(fā)性AD具有以下共同的組織學(xué)特征:血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、彈性纖維破壞和損耗及炎性細(xì)胞浸潤等，以上因素導(dǎo)致主動脈壁弱化、主動脈擴張、剝離和最終破裂[1]。其中主動脈壁中層血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化在AD發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的作用。

血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)是動脈中層的基本組成部分，對動脈生理和病理學(xué)至關(guān)重要。血管平滑肌細(xì)胞和其他處于終末分化期的細(xì)胞不同，其表現(xiàn)出十分有效的可塑性。當(dāng)機體處于健康狀態(tài)時不會使得血管平滑肌細(xì)胞受到刺激，其不會出現(xiàn)大量的遷移或者增殖并且細(xì)胞保有較強的收縮能力，在這一狀態(tài)下其會表達(dá)包括平滑肌α肌動蛋白(α-SMA)以及平滑肌22α蛋白(SM22α)等具有特定功能的收縮蛋白和細(xì)胞骨架蛋白以維持細(xì)胞正常形態(tài)功能。但是若改變細(xì)胞所處環(huán)境，將可能對血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生刺激，血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化成去分泌表型細(xì)胞，此狀態(tài)下細(xì)胞的收縮能力會大大降低，并且表現(xiàn)出較強的遷移和增殖能力，并表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)等特異性標(biāo)志物[9-10]。因此抑制VSMCs的表型轉(zhuǎn)化及其所致的異常增殖與遷移對于防治AD等血管相關(guān)疾病具有重要意義。

仙茅是石蒜科多年生草本植物，富含多糖、皂苷、酚類、酚苷、萜類等多種重要的生物活性物質(zhì)。仙茅苷是仙茅的主要活性化合物，其具有抗氧化、抗抑郁、防止骨質(zhì)疏松等多種藥理作用[5]。近年來Cur在心血管領(lǐng)域研究逐漸成為熱點，尤其對心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞均有保護作用[11-12]，而其在血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用尚未見報道，仍需進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示,脂多糖作用于VSMCs后,可顯著增加VSMCs增殖率、遷移率及MMP-9的蛋白表達(dá)量，降低細(xì)胞內(nèi)α-SMA蛋白表達(dá)量；進(jìn)一步提示脂多糖可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞從收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而導(dǎo)致增殖率、遷移率明顯升高。而與LPS組相比,LPS+Cur組血管平滑肌細(xì)胞的增殖率、遷移率以及MMP-9的蛋白表達(dá)量明顯減低，細(xì)胞內(nèi)α-SMA蛋白表達(dá)量明顯升高，進(jìn)一步提示仙茅苷可抑制由脂多糖誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的改變。而在進(jìn)一步研究我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS組細(xì)胞內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)量明顯升高；而LPS+Cur組血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)量顯著降低于LPS組。表明仙茅苷可抑制由脂多糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)升高。因此，仙茅苷在逆轉(zhuǎn)VSMCs由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化的過程可能是通過抑制NF-κB分子以及其介導(dǎo)的相關(guān)信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)仙茅苷可明顯抑制由脂多糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞表型自收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖率與遷移率，其作用機制可能通過抑制NF-κB信號通路實現(xiàn)，或可為臨床治療主動脈夾層等心血管疾病提供理論基礎(chǔ)。本研究局限性在于僅初步探討仙茅苷抑制血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的分子機制，其對于主動脈夾層等心血管疾病的防治作用還待進(jìn)一步研究。