藍康澍，田 欣，藍昕蕊，王勇勝

(西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

活體采卵(ovum pick-up，OPU)是指通過非手術(shù)的方式，在對供體影響最小的情況下采集母畜體內(nèi)卵子的方法。因其能與體外受精、胚胎移植等技術(shù)結(jié)合提高育種效率和促進育種進程而受到廣泛關(guān)注。OPU常與體外受精技術(shù)結(jié)合，但OPU所獲得卵母細胞數(shù)量少一直都是難以突破的難關(guān)，近幾年研究都注重提高卵母細胞的培養(yǎng)和發(fā)育效率，而注重于OPU本身效率提高的研究鮮有報道。雖然與傳統(tǒng)的取卵技術(shù)如手術(shù)法采卵等相比，具有效率高、對供體影響小等優(yōu)勢，但OPU技術(shù)仍處于摸索階段，在技術(shù)、操作上仍存在問題，若想通過OPU獲取大量的優(yōu)質(zhì)卵母細胞，必然要克服這些問題。本文對近年來牛OPU的發(fā)展歷程、活體采卵方法、影響因素和應用前景進行綜述，旨在為OPU技術(shù)的進一步完善提供理論基礎(chǔ)。

1 活體采卵技術(shù)發(fā)展歷程

活體采卵最早是一種用于應對人類不孕癥，采集人類卵巢內(nèi)卵母細胞的微創(chuàng)性技術(shù)，Steptoe在1967年首次用該項技術(shù)采集到人類的卵母細胞，并在后續(xù)的研究中，在此技術(shù)的基礎(chǔ)上，加以應用，成功獲得了世界上第一個試管嬰兒[1]。由于其突出的優(yōu)勢(微創(chuàng)，且可以獲得較多的卵母細胞)，這項技術(shù)逐漸應用于家畜繁殖上，用于優(yōu)良性狀的保存和傳遞、培育高繁殖力動物種群。1983年，加拿大研究人員首次將內(nèi)窺鏡運用于活體采卵，對50頭小母牛進行了總共129次內(nèi)窺鏡檢查[2]。該技術(shù)在1987年于丹麥首次于超聲波技術(shù)結(jié)合，效果良好[3]。在國外，內(nèi)窺鏡技術(shù)及超聲波技術(shù)較早運用于活體采卵，而對于盲采法鮮有報道。在國內(nèi)有較早關(guān)于盲采法的介紹，多采用自制采卵器進行活體采卵，后逐漸也被內(nèi)窺鏡采卵法及超聲波采卵法所代替，其中超聲波采卵法是活體采卵主要的方法[4]。

隨著牛繁殖技術(shù)的發(fā)展，如何提高活體采卵的效率一直備受人們關(guān)注。許多研究都從不同層面探索提高活體采卵技術(shù)效率的方法。隨著重視程度的提高，近幾年活體采卵技術(shù)發(fā)展迅速，已逐步達到成熟穩(wěn)定的階段。

2 活體采卵方法

活體采卵主要是通過超聲波儀器或內(nèi)窺鏡引導對供體母牛卵巢上的卵泡進行穿刺抽取卵泡液從而獲得卵母細胞的技術(shù)，在進行活體采卵程序之前，需要對動物進行直腸糞便清理以及麻醉(相關(guān)程序可參考Cavalieri F L B等[5]的研究)，以助于后續(xù)采卵程序的進行。過去卵母細胞的獲得方法都是從屠宰場的卵巢中獲取，該方法由于所獲得卵母細胞來源未知而無法滿足一些育種繁殖實驗的要求，而活體采卵技術(shù)的出現(xiàn)有效地解決了該問題。手術(shù)法采卵需要考慮多種因素如手術(shù)部位及操作手法等，操作不當很可能會引起子宮損傷和撕裂[6]。與手術(shù)法采卵相比，活體采卵技術(shù)對供體的傷害更小、重復性更高，能在更好地保護供體生產(chǎn)性能的前提下獲得盡可能多的卵母細胞[7]。隨著活體采卵技術(shù)的廣泛應用以及生產(chǎn)需求，活體采卵技術(shù)不斷發(fā)展，近年來取得較大進步?；铙w采卵方式主要包括以下幾種。

2.1 盲采法

根據(jù)周木清等[8]所提供的方法，盲采法需要使用自制采卵器，操作人員用手在陰道部位感知卵巢表面卵泡所在部位，用采卵器(由采卵針、持針器、注射器、集卵杯和三通導管等組成)在陰道穹隆部位對卵巢卵泡進行穿刺，再用負壓將卵泡液及卵子一同吸取，將卵母細胞收集后在實驗室進行后續(xù)相關(guān)的篩選和分級操作。

盲采法需要操作者用手感知卵泡的部位，方法直觀但只能感受到有限的、體積較大而容易被感知的卵泡，這也造成了通過盲采法所獲得的卵母細胞數(shù)要比直接從屠宰場的牛卵巢獲得的卵母細胞數(shù)量要少的結(jié)果。根據(jù)周木清等[8]的研究，屠宰場卵巢卵母細胞采集結(jié)果為平均每對卵巢可獲得卵3.55枚，采卵數(shù)高于盲采法活體采卵(平均每頭?？色@卵3.3枚)。

圖1 盲采法活體采卵模式圖Fig.1 Pattern diagram of blind ovum pick-up method

換而言之，盲采法更依賴操作者的經(jīng)驗，采集的結(jié)果受許多主觀因素影響而不穩(wěn)定。同時，由于對卵巢的穿刺位置僅憑感官定位，盲采法對供體的傷害也比較大，從而延長了可采卵的時間間隔、降低了采卵頻率[9]，種種原因都導致現(xiàn)如今盲采法的使用受到限制。

目前對于以上盲采法的缺陷尚無較完善的解決方案。使用自制簡易采卵器進行盲采法的盧晟盛等[10]建議在進行穿刺時直接刺穿卵泡而不是沿著卵巢皮質(zhì)穿刺卵泡，并在采卵后給供體注射抗菌素，這樣雖然會造成盲采法對卵子的低回收率，但可以較好地解決盲采法對卵巢傷害大、采卵間隔長、采卵頻率低等問題。

盲采法對設(shè)備及手術(shù)條件的要求較低，故有較大的推廣潛力，但現(xiàn)在仍沒有有效的方法解決其對供體生殖器官傷害大的問題，同時盲采法對操作人員要求較高，若想進一步增強其實用性及普及性，可以增強對操作人員的培訓，并且后續(xù)可以將提高盲采法對卵子的回收率作為切入點進行完善研究。

2.2 內(nèi)窺鏡或腹腔鏡采卵法

內(nèi)窺鏡或腹腔鏡法(laparoscopic ovum pick-up，LOPU)相對盲采法而言有更高的準確率，內(nèi)窺鏡和腹腔鏡的使用也使得卵巢表面的卵泡能夠被更直觀地觀察到，因此能在更準確、高效收集卵母細胞的同時減少對卵巢的傷害。該技術(shù)被證明是具有一定安全性的，且不會影響供體后續(xù)的繁殖活動與功能[11]。內(nèi)窺鏡采卵法在性成熟前的牛上已經(jīng)與體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)(invitroembryo production，IVEP)結(jié)合，目前已達到商業(yè)水平，具有較好的發(fā)展前景[11]。此外，也有關(guān)于將LOPU用于瀕危物種保護的報道，說明了該方法不僅在動物生產(chǎn)上扮演重要角色，在動物保護上也同等重要[12]。

常用內(nèi)窺鏡活體采卵需要經(jīng)過采卵前準備、穿刺和采卵三個步驟，在進行麻醉后向供體牛腹腔內(nèi)充入二氧化碳(增大腹腔體積便于操作)，再使用內(nèi)窺鏡活體采卵儀進行穿刺。操作者一手在直腸內(nèi)隔著腸壁固定住一側(cè)卵巢，另一只手持儀器從陰道進入，在陰道穹窿處插入腹腔。直腸內(nèi)的手將卵巢拉至內(nèi)窺鏡前端，通過內(nèi)窺鏡顯示屏觀察卵巢，不斷調(diào)整內(nèi)窺鏡與卵巢之間的位置以觀察卵巢表面形態(tài)、確定需要進行穿刺卵泡后對卵泡進行穿刺，之后同樣使用負壓吸取卵泡內(nèi)的卵泡液及卵子。該方法仍對供體牛卵巢和陰道穹隆傷害較大，可能還會影響卵母細胞的質(zhì)量以及供體牛的健康狀況[13]。

李繼成等[13]對原有內(nèi)窺鏡活體采卵法做以下改進：用細套筒將穿刺棒送入陰道穹窿，減小了對陰道穹窿損傷；穿刺后替換成粗套筒，加大了采卵視野面；不注入二氧化碳。這些改進旨在減少對卵巢及陰道的損傷、減少二氧化碳的消耗及提高采卵的準確性。為減少采卵前準備麻醉并發(fā)癥(如食物返流)的產(chǎn)生，Baldassarre H[11]提出在內(nèi)窺鏡采卵前進行一定時間的禁食禁飲(干草、谷物和水分別至少禁36 h、24 h和12 h)。

內(nèi)窺鏡采卵法除了可以像超聲波采卵法一樣將設(shè)備從供體陰道進入完成后續(xù)采卵程序外，在個體較小、不便于在陰道進行操作的犢?；蛐》雌c動物上還可以選擇從腹腔進入，將動物麻醉后采取仰臥、尾高頭低位，于腹部作3個切口，使用腹腔鏡、套管針、無創(chuàng)抓鉗和光源等設(shè)備進行采卵。

總體來說，內(nèi)窺鏡活體采卵可以更直觀、準確地對卵泡進行穿刺，雖然不可避免地會對陰道產(chǎn)生損傷，但相比其他方法，內(nèi)窺鏡法對卵巢和陰道的損傷相對較小。然而，由于設(shè)備復雜，操作繁瑣，該方法的使用還是受到很大限制。

圖2 內(nèi)窺鏡活體采卵模式圖Fig.2 Pattern diagram of laparoscopic ovum pick-up method

2.3 超聲波法

由于盲采法的低準確性以及內(nèi)窺鏡的操作復雜性，人們對新型活體采卵方法的需求越來越高，這就使超聲波法活體采卵應運而生。由于具有采卵率高、對卵巢傷害小和采卵間隔時間短等優(yōu)點[14]，超聲波法已逐漸成為活體采卵的主要方式。目前在牛上，超聲波法采卵與體外受精結(jié)合，已廣泛用于牛的胚胎生產(chǎn)[15]。

超聲波法主要是利用卵泡和卵巢其他組織對高頻聲波的吸收和反射能力不同，在熒屏上顯示卵巢橫截面圖像，操作者可以根據(jù)顯示的超聲圖像進行準確穿刺。在準備好儀器、對供體牛進行直腸糞便清除、硬膜外麻醉等術(shù)前準備后，操作人員一手持B超探頭輕緩插入陰道穹窿處，另一手在直腸內(nèi)透過腸壁對卵巢進行操作，方便探頭觀察卵巢，通過超聲屏幕對卵泡進行觀察，將需要進行穿刺的卵泡置于顯示屏取卵線上進行穿刺取卵，吸取卵母細胞及卵泡液程序與前兩種方法相同。許紅喜等[16]在進行卵母細胞吸取時，建議應先啟動真空泵再進行穿刺以防止卵母細胞流失。

黃右軍等[17]應用B型超聲波采卵法對42頭母水牛進行采卵，共穿刺卵泡762個，實際收回513枚卵母細胞，回收率可達67.3%。建議在對卵母細胞進行吸取時負壓不宜過大，否則會損害所吸取卵母細胞的卵丘細胞層，不利于卵母細胞的后續(xù)培養(yǎng)。D'Angelo A等[18]在2019年發(fā)表的論文中詳細介紹了超聲波法采卵，除了提出了采卵過程中的操作建議，文章還詳細地介紹了如何進行活體采卵的術(shù)后護理如檢查是否出現(xiàn)腹腔內(nèi)出血以及監(jiān)測動物意識、呼吸頻率等。

超聲波法采卵對供體牛的傷害最小，且恢復時間快，采卵頻率也相應較高，但超聲設(shè)備昂貴，且對操作人員要求高，距離其進一步的普及使用仍有一段距離。

圖3 超聲波活體采卵模式圖Fig.3 Pattern diagram of ultrasound-guided ovum pick-up method

3 活體采卵影響因素

通過對活體采卵主要方法的了解，可見活體采卵技術(shù)發(fā)展已取得較大進步，已經(jīng)可以代替手術(shù)法成為更成熟的卵母細胞采取方式。但是活體采卵的卵母細胞回收成果還具有較大的波動性，除受操作人員熟練程度影響，還有許多因素在活體采卵過程中起著十分重要的作用。這些因素可以影響活體采卵的頻率、卵母細胞回收率等，故弄清這些作用因素以及明確其與活體采卵的關(guān)系，有助于進一步提高活體采卵的效率，使其得到更為廣泛的應用。

3.1 連續(xù)采卵間隔影響

無論是哪種活體采卵方法，都會對供體牛的陰道和卵巢產(chǎn)生一定的傷害，這些傷害需要一定時間的恢復，如果無視傷害恢復時間而高頻率進行采卵必然會對供體造成較大影響，高頻率的穿刺甚至會引起卵巢的囊腫[19]。同時，由于牛卵巢的卵泡儲備有限，高頻率采集可能會導致收集到的卵母細胞質(zhì)量較前幾次收集的低。有研究表明不同的采卵時間間隔所得的卵母細胞不同，陳明棠等[20]對供體進行連續(xù)10個月的采卵，間隔3 d～27 d不等，結(jié)果表明大部分母牛卵巢在經(jīng)過連續(xù)35次采卵后有明顯損傷，在質(zhì)地上也變硬和粘連，回收效果大體呈下降趨勢。但并非采卵頻率越高采卵的效果就越差，姚順等[21]認為，在對卵巢卵泡進行采卵后約3 d后會形成優(yōu)勢卵泡，此時若不對卵巢進行采卵，優(yōu)勢卵泡就會通過控制促卵泡素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)的合成和分泌來引起劣勢卵泡的萎縮閉鎖，從而使能采集到的卵母細胞數(shù)量減少。

表1 3種活體采卵方法優(yōu)缺點對比Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of three ovum pick-up methods

但是活體采卵的最短時間間隔仍需要進一步探索，以在對供體傷害較小的情況下取得盡可能多的卵母細胞。所以在對供體進行活體采卵時，除需要進行正確的操作外還要合理安排采卵時間和選擇適宜的采卵頻率，在進行一定次數(shù)的連續(xù)采卵后給予供體充分的時間恢復，最大限度減少對供體卵巢的傷害，防止卵巢出現(xiàn)粘連、硬化和囊腫等影響后續(xù)采卵的并發(fā)癥。

3.2 外源激素及其他化學物質(zhì)影響

最早的OPU程序中不包含激素刺激，僅定期在每周進行2次采卵，但在將所有可見卵泡進行抽吸時未見有優(yōu)勢卵泡發(fā)育[22]。向供體注射促性腺激素、促性腺激素釋放激素等有利于卵泡的形成和發(fā)育，Sakaguchi K等[23]已證實促性腺激素釋放激素可以提高水牛活體采卵所獲得卵母細胞數(shù)量和胚胎生產(chǎn)力，且多次注射FSH中的最后一次注射與活體采卵的時間間隔影響卵母細胞的發(fā)育能力，但單次注射FSH與采卵的最佳時間間隔還有待研究[24]。最佳的激素處理方案仍需要進一步探索。除此之外，還有報道稱小母牛血漿中的抗苗勒氏管激素水平與卵泡數(shù)量正向關(guān)，是除直腸檢查外評估排卵數(shù)和胚胎數(shù)的可靠指標[25]。

上述激素雖然與卵泡發(fā)育相關(guān)、可以促進卵泡發(fā)育，但仍存在許多問題。趙善江等[26]的研究表明，諸多因素如血液循環(huán)對激素的消耗等都會影響供體對FSH的反應。梁金旺等[27]表明孕馬血清促性腺激素(Permanent magnet synchronous generator，PMSG)半衰期長，在供體體內(nèi)不易被清除，容易影響后續(xù)卵泡的發(fā)育和成熟。各類激素的合理有效使用條件仍需不斷摸索。

除各類激素外，還有許多外源化學物質(zhì)可以應用于活體采卵。李寧等[28]證明，在母牛飼糧中加入β-胡蘿卜素可以促進促黃體素(luteinizing hormone，LH)分泌，進而促進卵泡發(fā)育。相比直接注射激素效果更可控，可以避免出現(xiàn)激素使用過多而因為半衰期較長而影響后續(xù)卵泡發(fā)育等問題。

在進行活體采卵前進行必要的激素處理可以一定程度地提高卵母細胞質(zhì)量和胚胎生產(chǎn)力。但由于激素在體內(nèi)的消耗以及代謝需要一定的時間，劑量過大會由于激素長時間發(fā)揮作用而干擾供體本身的繁殖周期以及繁殖活動，所以要合理安排處理劑量以及頻率。

3.3 采卵年齡段影響

不同年齡段的牛生殖系統(tǒng)發(fā)育情況不同，其產(chǎn)生卵泡的能力也不同。青年母牛雖然體格發(fā)育已經(jīng)成熟，但其乳腺及生殖器官還尚未發(fā)育完全，故經(jīng)產(chǎn)母牛相較于青年母牛而言更適合被選為超排供體。并且與成年母牛的卵母細胞相比，小牛的卵母細胞發(fā)育能力非常差[29]。Baldassarre H等[30]的研究也證明從大于130日齡的荷斯坦奶牛上獲得的胚胎發(fā)育到囊胚期的數(shù)量(19.9%±6%)要比小于100日齡的荷斯坦奶牛的(9.5%±8%)多。但并非年齡越大效果越好，隨著母牛年齡增大，其生殖功能也相應退化，Currin L等[31]表明母牛到達一定年齡后，供體牛所能提供的平均卵母細胞數(shù)量隨著年齡增加而下降。

目前采卵的最佳年齡段仍在摸索，選取原則也有待研究。青年母牛雖然生殖器官尚未發(fā)育成熟，卵泡的生成能力較弱，但其卵母細胞的體外受精率、胚胎體外發(fā)育率都要高于成年奶牛[32]。雖然隨著母牛年齡的增大，所能獲取的平均卵母細胞數(shù)下降，但卵母細胞的囊胚率卻增加[31]。王騰飛等[33]選取3頭13月齡～15月齡營養(yǎng)狀況良好且無疾病的青年母牛進行相關(guān)試驗，結(jié)果表明，雖然獲得的可用卵母細胞數(shù)差異不顯著，但供體牛之間的體外受精囊胚率差異顯著(囊胚率分別為54.7%±15.8%、32.9%±11.1%和12.4%±2.0%)。

活體采卵的年齡段不但可以影響所能獲取的卵母細胞數(shù)量，還可以影響卵母細胞質(zhì)量進而影響活體采卵的后續(xù)實驗。在進行活體采卵時也需要選取合適年齡段的母牛進行采卵，綜合母牛生殖機能發(fā)育情況等因素，以提高卵母細胞采集數(shù)量。

3.4 其他因素

除以上主要因素外，活體采卵的效果還受其他因素影響。采卵時需要使用負壓吸取卵泡液和卵母細胞，此時負壓過大會破壞卵母細胞的卵丘細胞層，進而影響到后續(xù)試驗的效果[17]。Gutiérrez-Aez JC等[34]的研究表明在6月～8月進行采卵能獲得更多卵母細胞。此前許多人疑惑的關(guān)于牛的品種組成是否影響采卵效果，Monteiro CAS等[35]關(guān)于荷斯坦奶牛和瘤牛雜交品種的研究也給出了否定的回答，Mointeiro猜測原因可能是雜交個體仍能保留原有主要品種的特征。

控制好采卵的各類條件，有利于使采卵的效果趨向穩(wěn)定和高效，可以提高活體采卵的效率，有助于活體采卵技術(shù)的進一步推廣。

4 活體采卵技術(shù)的應用前景

活體采卵技術(shù)最早是為人類不孕癥而建立的收集人類卵母細胞的輔助生殖方法，后逐步應用于牛，顯著提高了牛的生殖效率，不僅可以獲得更多優(yōu)質(zhì)的卵母細胞，并且還可以確定卵母細胞的來源，達到母牛優(yōu)良性狀的高效遺傳。活體采卵具有微創(chuàng)性、可重復性和可靠性等特點，可以在對供體幾乎不產(chǎn)生損傷的條件下收集優(yōu)質(zhì)的卵母細胞，且無需考慮供體的繁殖狀態(tài)[22]，適用范圍廣，具有廣泛的應用前景。牛的活體采卵為體外胚胎生產(chǎn)和體細胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)等技術(shù)提供了良好的材料[12]。還有研究表明內(nèi)窺鏡采卵法所得的卵母細胞已經(jīng)成功用于體細胞核移植克隆程序的受體細胞質(zhì)、用于顯微注射的合子以及用于轉(zhuǎn)基因和基因組編輯動物的生產(chǎn)[11]。OPU與超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)(multiple ovulation and embryo transfer，MOET)相比具有顯著優(yōu)勢。OPU與MOET的目的都是從優(yōu)良雌性個體中產(chǎn)生更多后代，但是MOET的結(jié)果差異較大，且會干擾供體的正常生殖和生產(chǎn)周期，缺乏穩(wěn)定性與可靠性。此外，活體采卵還有用于卵巢囊性綜合征或類似疾病治療的潛能[22]。OPU技術(shù)也可用于科學研究，OPU可以干擾卵泡的動力學，可以輔助人們進一步了解卵泡的發(fā)展進程及相關(guān)調(diào)控機制，為將來與卵泡相關(guān)技術(shù)應用提供理論基礎(chǔ)。

5 展望

活體采卵可以對特定的母牛進行活體采卵，為卵核移植、基因工程、胚胎工程等技術(shù)提供了優(yōu)質(zhì)的實驗材料。實現(xiàn)活體采卵技術(shù)的進一步完善和推廣，是使繁殖育種技術(shù)更上一層樓的重點突破口。隨著內(nèi)窺鏡、超聲波等技術(shù)設(shè)備的引入，活體采卵的準確性大大提高，對供體的傷害性也大幅度降低，但仍有很多方面需要進一步提高。在技術(shù)上，無論是內(nèi)窺鏡法還是超聲波法都要求操作人員能夠熟練操作儀器設(shè)備。在儀器設(shè)備方面，超聲波等儀器的高昂價格使得該技術(shù)的使用受到限制。此外，在采卵過程中控制好各類影響因素如供體牛的年齡段、采卵前的激素處理、采卵的頻率和進行采卵的季節(jié)等，也是獲得較好采卵效果的關(guān)鍵。

本文對現(xiàn)階段活體采卵遇到的主要問題以及影響活體采卵效果的主要因素進行綜述，為活體采卵技術(shù)的改良以及發(fā)展提供便利，旨在為繁殖育種進程提供參考。