王興珍，張學(xué)虎，童建偉，孫鑒弘，姬宏偉*

(1.甘肅省張掖市甘州區(qū)畜牧獸醫(yī)工作站，甘肅張掖 734000；2.甘肅省張掖市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，甘肅張掖 734000；3.甘肅省張掖市甘州區(qū)平山湖蒙古族鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，甘肅張掖 734000)

近年來，隨著我國肉牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，其養(yǎng)殖量逐漸增多，個別的地區(qū)已經(jīng)形成規(guī)?；?、集約化的養(yǎng)殖模式。在肉牛養(yǎng)殖過程中，呼吸道疾病成為臨床中常見的疾病之一。引起肉牛的呼吸道病原菌有多種，與運輸及環(huán)境變化等應(yīng)激因素有關(guān)，常常出現(xiàn)混合感染，其感染率和病死率均較高，給肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[1，2]。腔隙莫拉菌(Moraxellalacunata)為革蘭氏陰性菌，屬于莫拉菌屬(Moraxella)的成員。該菌主要寄居在溫和動物皮膚、口腔黏膜、上呼吸道等，可以引起多種動物和人的肺炎、結(jié)膜炎、腦膜炎及慢性鼻竇炎等一系列的病癥，也是引起呼吸道繼發(fā)性感染的致病菌之一[3-5]。許多研究表明腔莫拉菌從患病的豚鼠、山羊、駱駝及犬等多種哺乳動物體內(nèi)分離到，且分離得到的部分菌株致病性較強，呈逐年增加趨勢，該菌為具有重要的潛在致病性細菌[6-7]。莫拉菌在醫(yī)學(xué)上主要有腔隙莫拉菌、卡他莫拉菌、非液化莫拉菌等8種，引起人類感染的病例報道也呈逐年增多趨勢。國內(nèi)關(guān)于肉牛源腔隙莫拉菌的報道較少[8]。本研究對張掖地區(qū)肉牛不同養(yǎng)殖場采集患有呼吸道疾病的肉牛鼻腔拭子、肺臟及肝臟等病料組織進行腔隙莫拉菌分離鑒定，并對其進行致病性和耐藥性研究，為肉牛腔隙莫拉菌引起的呼吸道疾病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2019年-2020年，從張掖地區(qū)肉牛不同養(yǎng)殖場采集患有呼吸道疾病的肉牛的鼻腔拭子、肺臟及肝臟等病料組織127份。

1.1.2 主要試劑 70 mL/L綿羊血平板、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)；革蘭氏染色液試劑盒，購自北京陸橋生物科技有限公司；革蘭氏陰性菌細菌生化鑒定試紙條、藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；胎牛血清，購自四季青有限公司；DNA Marker DL 2000，2×TaqMarker Mix，均購自TaKaRa公司；細菌基因組提取試劑盒，購自北京天根物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 雙人超凈工作臺，博科(BIOBASE)公司產(chǎn)品；全自動細菌生化鑒定系統(tǒng)，法國梅里埃公司產(chǎn)品；多功能PCR儀、凝膠成像儀，ThermoFisher公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱，蕪湖華測儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 實驗動物 22 g～25 g昆明系小白鼠，購自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)院實驗動物中心，由本單位動物疾病監(jiān)測中心飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng) 對患有呼吸道疾病的肉牛的鼻腔拭子、肺臟及肝臟等病料組織經(jīng)過處理后，無菌條件下接種于70 mL/L綿羊血平板上，37℃培養(yǎng)12 h～24 h，挑取疑似菌落劃線于TSA培養(yǎng)基(含50 mL/L胎牛血清)，37℃培養(yǎng)12 h～24 h，挑取TSA培養(yǎng)基的單個菌落，接種于TSB(含50 mL/L胎牛血清)中進行震蕩純化培養(yǎng)后，進行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 細菌生化試驗鑒定 參照革蘭氏陰性菌細菌生化鑒定試紙條說明書，將分離菌株調(diào)整菌液濃度為0.5個麥?zhǔn)蠞岫?，接種于試條中，37℃培養(yǎng)12 h～24 h后，并觀察試驗結(jié)果。

1.2.3 細菌的PCR鑒定 參考文獻[11]，根據(jù)細菌16S rDNA基因序列設(shè)計細菌的通用引物，F(xiàn):5′-CGCTATTTACCCAGTG-3′，R:5′-CGTTGAACACGAAGA-3′，目的基因1 500 bp，由上海生工生物工程股份有限公司合成。用細菌基因組提取試劑盒制備分離菌株的DNA模板，進行PCR檢測，其PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司進行基因測序，其測序結(jié)果與GenBank中登錄序列進行同源性對比，選擇代表株構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分離菌株的PCR檢測、測序及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹是由上海生工生物工程股份有限公司完成。判定標(biāo)準(zhǔn)：同源性≥99%，可以定義到種的水平；若同源性在97%～98.9%，可以定義到屬的水平；若<97%，則定義為科水平。

1.2.4 人工感染致病性試驗 參考文獻[7]報道的方法，將分離菌株培養(yǎng)至對數(shù)期后菌落計數(shù)，調(diào)整菌液濃度108CFU/mL，每株菌腹腔注射5只小白鼠，劑量為0.2 mL，對照組接種等量的無菌PBS，接種12 h后觀察6 d，記錄發(fā)病及死亡情況，并進行細菌分離鑒定。

1.2.5 藥敏試驗 將純化培養(yǎng)的分離菌株，調(diào)整菌液濃度為108CFU/mL，無菌條件下均勻涂布TSA培養(yǎng)基，每種藥物3個重復(fù)進行藥敏試驗，取平均值。參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2017推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進行和結(jié)果判定，統(tǒng)計分離菌株的耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)

疑似腔隙莫拉菌的菌株在70 mL/L綿羊血平板上生長半透明的、圓形的、濕潤的不溶血的單個菌落，且生長良好，在TSA平板上長出邊緣整齊的、圓形凸起的乳白色的菌落(圖1)；革蘭氏染色鏡檢可見分離菌株為兩端鈍圓的短桿菌，呈現(xiàn)單個或成對排列的細菌(圖2)。

圖1 分離菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of isolated strains

圖2 分離菌株的形態(tài)學(xué)觀察(1000×)Fig.2 Morphological observation of isolated strains(1000×)

2.2 細菌生化檢測結(jié)果

分離的菌株均不分解蔗糖、乳糖、鼠李糖、甘露醇、麥芽糖等，氧化酶反應(yīng)、觸酶反應(yīng)為陽性，V-P試驗為陰性，動力試驗為陰性，不產(chǎn)硫化氫。與《伯杰菌鑒定手冊》中腔隙莫拉菌生化特性基本一致，分離的79株病原菌初步鑒定為腔隙莫拉菌。

2.3 細菌的PCR鑒定結(jié)果

對初步鑒定為79株腔隙莫拉菌的分離菌株，用細菌通用引物16S rDNA基因序列進行PCR鑒定，結(jié)果顯示，分離的79株均擴增出1 500 bp大小的目的基因條帶，與預(yù)期相符(圖3)。分離的菌株測序結(jié)果與GenBank中登錄的15株腔隙莫拉菌參考株基因序列同源性在97.9%以上，參照判定標(biāo)準(zhǔn)，分離菌株可以判定為莫拉菌。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～8.分離菌株；9.空白對照M.DNA Marker DL 2 000;1-8.Isolated strains;9.Blank control圖3 分離菌株的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR identification results of isolated strains

選出代表菌株構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，分離菌株(Mor)與腔隙莫拉菌聚為一支，親緣關(guān)系最近，與其他參考菌株位于不同的分支，親緣關(guān)系較遠(圖4)。

2.4 人工感染致病性試驗結(jié)果

攻毒組小白鼠在攻毒后的2 d～3 d，出現(xiàn)采食量減少、精神沉郁等不同程度發(fā)病狀態(tài)，個別小白鼠未表現(xiàn)任何癥狀癥狀出現(xiàn)急性死亡。剖檢死亡的小鼠，見肺臟、肝臟、脾臟等具有不同程度的出血，個別小白鼠出現(xiàn)腹腔積液。從死亡的小白鼠體內(nèi)再次得到了腔隙莫拉菌，直到試驗結(jié)束，對照組小鼠健康存活。通過統(tǒng)計，64株分離株能引起小鼠的死亡，為致病性菌株。

2.5 耐藥性分析結(jié)果

用K-B藥敏紙片法對64株致病性腔隙莫拉菌進行藥敏試驗，并進行耐藥性檢測。結(jié)果由表1可知，分離的64株致病性腔隙莫拉菌對阿莫西林、氨芐西林、慶大霉素、磺胺間甲氧嘧啶、新霉素、紅霉素、強力霉素、大觀霉素等8種抗生素耐藥率較高，耐藥率在66.7%～98.4%之間；對頭孢噻呋、頭孢噻肟、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考等6種藥物耐藥率在7.8%～30.2%之間。

▲:Isolated strains圖4 分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of isolated strains

表1 耐藥性結(jié)果Table 1 Results of drug sensitivity test

由表2可知，臨床中分離的64株致病性腔隙莫拉菌呈現(xiàn)多重耐藥性，耐14種藥物有1株，耐13種藥物有3株，耐12種藥物有4株，耐11種藥物有7株，耐7種藥物的有5株，耐6種藥物有4種，耐10、9、8種藥物的分離菌株最多，分別占分離菌株的23.2%、21.9%和17.2%。

表2 多重耐藥性檢測結(jié)果Table 2 Results of multidrug resistance test

3 討論

腔隙莫拉菌是人畜共患條件性致病菌之一，該菌是寄居于人類的口腔、上呼吸道、結(jié)膜中的正常菌群，尤其在機體抵抗力發(fā)生改變時，該菌可以生長、繁殖，引起兒童中耳炎、結(jié)膜炎、慢性鼻竇炎及咽炎等一系列的病癥，臨床中腔隙莫拉菌引起的侵入性感染比較少見[10-11]。根據(jù)國外研究報道，腔隙莫拉菌主要引起人敗血癥、心內(nèi)膜炎、化膿性關(guān)節(jié)炎、尿路感染及男泌尿生殖道感染等。從腦脊液中分離到 1 株腔隙莫拉菌，具有致病性。謝林峰等報道從患病嬰兒血液中分離到腔隙莫拉菌，近年來腔隙莫拉菌引起人類發(fā)病的病例報道逐年增多[12-15]。腔隙莫拉菌對人類危害較大，因此，醫(yī)護人員和獸醫(yī)科研工作者應(yīng)該引起重視[16]。本研究表明，分離得到了79株腔莫拉菌，其中64株能引起小鼠發(fā)病，為致病性菌株，該菌對肉牛養(yǎng)殖業(yè)的安全生產(chǎn)及人類的健康可能存在潛在的風(fēng)險。朱利霞等2019年首次從肉牛呼吸道疾病分離得到腔隙莫拉菌，在國內(nèi)外有關(guān)肉牛呼吸綜合征源腔隙莫拉菌報道較少，對其流行趨勢有待進一步研究。董文龍等研究表明，臨床分離的腔隙莫拉菌能跨物種傳播，致使人類和山羊感染并引起發(fā)病[5]。腔隙莫拉菌對人類和動物均存在潛在的威脅。因此，在獸醫(yī)臨床中應(yīng)該引起重視，防止該菌在人類和動物之間傳播。

臨床中動物細菌性疾病主要依靠抗生素治療，應(yīng)該根據(jù)藥敏試驗結(jié)果和結(jié)合動物本身的實際情況合理使用抗生素，提高治療效果。本研究表明，分離的64株腔隙莫拉菌對臨床常用的抗生素產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性。在臨床中治療肉牛腔隙莫拉菌引起呼吸癥狀時應(yīng)該選擇敏感的藥物交替使用，同時注意環(huán)境的消毒。與朱麗霞等[7]、董文龍等[10]報道的腔隙莫拉菌耐藥性存在一定差異性，可能與地區(qū)、感染的宿主(羊)及抗生素的使用有關(guān)。本研究可為肉牛源多腔隙莫拉菌引起呼吸道疾病的防控提供參考。