魏立翔，解藝璇，高之煜，曹鑫艷，張彥兵，孫延鳴

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003)

干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factors，IRFs)是一類在天然免疫和適應(yīng)性免疫調(diào)控中均發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄因子，IRFs廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞[1]。在哺乳動(dòng)物中，該家族成員包括IRF1～I(xiàn)RF9，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)以及生長(zhǎng)調(diào)控等功能[2]。其中，干擾素調(diào)節(jié)因子1(interferon regulatory factor 1，IRF1)是干擾素(interferon，IFN)通路中的重要組成部分，可激活I(lǐng)FN和核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)啟動(dòng)子[3]。IRF1的轉(zhuǎn)錄活性取決于其基因N端的DNA結(jié)合區(qū)域(DNA binding domain，DBD)，由115個(gè)氨基酸組成，通過(guò)DBD結(jié)構(gòu)，IRF1基因可以結(jié)合到DNA上，從而發(fā)揮調(diào)控功能[4]。IRF1是最早被認(rèn)為可以激活I(lǐng)FN-β的轉(zhuǎn)錄因子，后來(lái)被證實(shí)IRF1可以與IFN-β基因啟動(dòng)子區(qū)域的干擾素調(diào)節(jié)元件(interferon stimulated responsive elements，ISREs)結(jié)合，從而調(diào)控該基因的表達(dá)[5]。

靜息狀態(tài)細(xì)胞中IRF1常以低水平表達(dá)，當(dāng)機(jī)體受病毒感染時(shí)，IRF1表達(dá)顯著上調(diào)，激活1型IFN的啟動(dòng)子，觸發(fā)由IFN介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)[6-7]。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，新佛朗西絲菌感染細(xì)胞時(shí)，IRF1可通過(guò)驅(qū)動(dòng)鳥苷酸結(jié)合蛋白(guanylate binding proteins，GBPs)的表達(dá)，使細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)被殺死[8]。綿羊支原體肺炎是一種由綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，MO)引起的呼吸道疾病，以咳嗽、氣喘、進(jìn)行性體重減輕和肺間質(zhì)增生炎癥為主要特征[9]，嚴(yán)重威脅我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展；前期數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，MO感染能誘導(dǎo)綿羊肺部IRF1差異表達(dá)[10]。然而，綿羊IRF1基因尚未克隆，以及綿羊IRF1功能尚不清楚。

本研究旨在克隆綿羊IRF1基因ORF，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建IRF1真核表達(dá)載體,以期為探索綿羊IRF1功能提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒 HEK293T為本實(shí)驗(yàn)室保存；DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；真核表達(dá)載體p3×Flag-CMV-14，購(gòu)自上海康朗生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 Trizol，英濰捷基有限公司產(chǎn)品；DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL 2000，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，LATaq酶，Hind Ⅲ、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶，TaKaRa公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，南京諾維贊生物科技有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；小鼠抗FLAG-M2抗體，Sigma公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，上海圣爾生物科技有限公司產(chǎn)品；超敏ECL發(fā)光試劑盒，上海圣爾生物科技有限公司產(chǎn)品；LipofectamineTM2000，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 Micro21低溫高速離心機(jī)、ABI-2720 PCR擴(kuò)增儀，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；Alpha紫外凝膠成像儀，美國(guó)Protein Simple公司產(chǎn)品；PowerPac基礎(chǔ)型核酸電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱，Thermo Fisher生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中預(yù)測(cè)的綿羊IRF1基因序列(登錄號(hào)：NM_001009751.1)，使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，上游引物添加了HindⅢ酶切位點(diǎn)，序列為：5′-ccAAGCTTatgcctatcactcggatgcgcatgagacc-3′；下游引物添加了EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，序列為：5′-cgGAATTCtggtgcacaaggaatggcctggatggagggc-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 綿羊IRF1擴(kuò)增及鑒定 采集感染MO綿羊肺臟組織，用Trizol法提取綿羊肺組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明合成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴(kuò)增綿羊IRF1基因。PCR反應(yīng)體系為50 μL：2×LATaqmix 25 μL，肺組織cDNA 2 μL，上、下游引物各2 μL，ddH2O 19 μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃ 20 s，56℃ 20 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收DNA并測(cè)序。

1.2.3 綿羊IRF1生物信息學(xué)分析 使用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序的基因序列進(jìn)行拼接，獲得綿羊IRF1 ORF基因全長(zhǎng)序列，將IRF1全長(zhǎng)序列提交GenBank(登錄號(hào)：MZ959373)。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索不同物種的IRF1 氨基酸序列，使用ClustalX2、DNAstar軟件對(duì)山羊、豬、人、馬氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)；利用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；使用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)在線程序?qū)d羊IRF1蛋白的氨基酸組成、分子式、等電點(diǎn)等進(jìn)行分析；使用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線軟件對(duì)綿羊IRF1蛋白的信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；使用NetPhos2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)、NetNGlyc1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/)在線軟件對(duì)綿羊IRF1蛋白的磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4 重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV-14-IRF1構(gòu)建和鑒定 利用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ對(duì)測(cè)序正確的PCR產(chǎn)物和p3×Flag-CMV-14載體分別雙酶切，純化回收后連接。連接體系20 μL，包括T4 DNA連接酶1 μL、線性化載體3 μL、純化的片段14 μL、10×Ligation buffer 2 μL，16℃金屬浴過(guò)夜連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐西林抗性平板，挑選陽(yáng)性單菌落液體培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。IRF1質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.5 綿羊IRF1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及蛋白樣品制備 HEK293T細(xì)胞接種6孔板，過(guò)夜培養(yǎng)，使用LipofectamineTM2000將重組陽(yáng)性質(zhì)粒p3×Flag-CMV-14-IRF1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時(shí)將空質(zhì)粒p3×Flag-CMV-14轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染24 h后，收獲細(xì)胞。蛋白裂解液裂解細(xì)胞，沸水浴5 min，超聲處理裂解，12 000 r/min離心10 min，吸取上清與5×SDS loading buffer混合，沸水浴10 min；蛋白樣品保存-20℃。

1.2.6 蛋白免疫印跡試驗(yàn) 將蛋白樣品進(jìn)行100 g/L SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后使用濕轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)印到NC膜，用50 g/L的脫脂乳于室溫封閉2 h～3 h，用1×TBST對(duì)NC膜漂洗3次，加入小鼠抗-FLAG 抗體(1∶4000)，4℃孵育過(guò)夜，用1×TBST洗滌3次后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶6000)，室溫孵育50 min，用1×TBST洗滌3次后，用ECL顯色發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果

2.1 綿羊IRF1擴(kuò)增及鑒定

用PCR成功擴(kuò)增出綿羊IRF1基因ORF，大小為969 bp，與預(yù)期大小相符(圖1)?？寺〉木d羊IRF1 ORF基因序列與GenBank中預(yù)測(cè)的綿羊IRF1 ORF基因序列一致，表明成功克隆綿羊IRF1基因ORF。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000；1.綿羊IRF1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2000；1.PCR product of sheep IRF1圖1 綿羊IRF1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of sheep IRF1

2.2 綿羊IRF1生物信息學(xué)分析

2.2.1 綿羊IRF1氨基酸序列與其他物種的比對(duì)分析 用綿羊IRF1氨基酸序列與山羊(XP 005682678.1)、豬(NP 001090882.1)、人(P10914.2)、馬(XP 005599497.1)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，相似性分別為100%、91.61%、87.73%和89.44%。綿羊與上述幾個(gè)物種IRF1 前117個(gè)氨基酸序列完全一致(圖2)。

陰影標(biāo)記的區(qū)域?yàn)橥葱园被幔谏幱皡^(qū)代表氨基酸同源性為100%，灰色陰影區(qū)代表同源性為75%以上。The shaded areas are homologous amino acids,the black shaded areas represent 100% homology of amino acids,and the gray shaded areas represent more than 75% homology of amino acids.圖2 綿羊IRF1氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.2 Multiple alignment of the amino acids sequences of sheep IRF1

2.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 利用綿羊、山羊、牛、豬、白鰭豚、馬、人、小鼠、大鼠、雞、鴿子、斑馬魚等的IRF1氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，哺乳動(dòng)物IRF1、鳥類IRF1分為兩大支，說(shuō)明哺乳動(dòng)物之間IRF1親緣關(guān)系較近，而與鳥類IRF1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；綿羊、山羊、牛IRF1聚為一支，綿羊等IRF1與小鼠、大鼠IRF1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，在不同的分支(圖3)。

圖3 不同物種IRF1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic of sheep IRF1 sequences predicted by different species

2.2.3 綿羊IRF1理化性質(zhì) 綿羊IRF1基因ORF為969bp，編碼322個(gè)氨基酸。其中帶負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)為44個(gè)，帶正電荷氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)為39個(gè)，Ser、Pro、Glu、Leu含量比較高，分別為10.2%、9.0%、7.1%和7.1%(表1)；分子式為C1596H2497N435O497S17，理論等電點(diǎn)為5.58，屬于弱酸性蛋白；綿羊IRF1蛋白有一個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，存在于第163位氨基酸，潛在值為0.602 1。此外，綿羊IRF1蛋白無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)。

表1 綿羊IRF1氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of sheep IRF1

2.2.4 綿羊IRF1磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 使用NetPhos2.0 Server對(duì)綿羊IRF1磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白存在多個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，綿羊IRF1蛋白可能具有較高的磷酸水平(圖4)。

圖4 綿羊IRF1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.4 Phosohorylation site prediction of sheep IRF1 protein

2.3 綿羊IRF1 真核表達(dá)載體構(gòu)建和鑒定

利用限制性內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV-14-IRF1雙酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2條條帶(圖5)，其中大小約為6 310 bp的為p3×Flag-CMV-14載體條帶，大小約為969 bp的是綿羊IRF1條帶；進(jìn)一步測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果與預(yù)測(cè)的綿羊IRF1 基因序列一致，表明成功構(gòu)建p3×Flag-CMV-14-IRF1重組質(zhì)粒。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000；1.重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV-14-IRF1；2.重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV-14-IRF1 HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切M.DNA Marker DL 15 000；1.p3×Flag-CMV-14-IRF1 recombinant plasmid；2.p3×Flag-CMV-14-IRF1 recombinant plasmid digested by HindⅢ and EcoRⅠ圖5 重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV-14-IRF1酶切圖Fig.5 Enzyme digestion of recombinant plasmid p3×Flag-CMV-14-IRF1

2.4 IRF1重組蛋白的表達(dá)分析

綿羊IRF1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，利用Western blot方法檢測(cè)IRF1重組蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示p3×Flag-CMV-14-IRF1質(zhì)粒在細(xì)胞中高效表達(dá)，綿羊IRF1大小為50 ku左右，與預(yù)期大小一致，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.轉(zhuǎn)染空載體(500 ng)；2.轉(zhuǎn)染p3× Flag-CMV-14-IRF1 (250 ng)；3.轉(zhuǎn)染p3× Flag-CMV-14-IRF1 (500 ng)1.Transfection of empty vector(500 ng);2.Transfection of p3× Flag-CMV-14-IRF1 (250 ng);3.Transfection of p3× Flag-CMV-14-IRF1 (500 ng)圖6 綿羊IRF1蛋白過(guò)表達(dá)分析Fig.6 Analyzed over expression of sheep IRF1 protein by Western blot

3 討論

干擾素調(diào)節(jié)因子家族在干擾素的產(chǎn)生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其中IRF1參與宿主對(duì)病原微生物的天然免疫和適應(yīng)性免疫，具有調(diào)控IFN-β表達(dá)的功能[7]。然而，綿羊的IRF1基因尚未克隆鑒定。本研究成功克隆了綿羊IRF1 ORF，對(duì)克隆的序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建了綿羊IRF1的真核表達(dá)載體，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功表達(dá)了綿羊IRF1重組蛋白。

IRF1具有和其他干擾素家族成員相同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其N端編碼DNA結(jié)合區(qū)域(DNA binding domain,DBD)的氨基酸在結(jié)構(gòu)和功能上高度保守[11-12]。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，綿羊、山羊、人、馬、豬的IRF1前117個(gè)氨基酸高度保守，其中，克隆的綿羊IRF1氨基酸序列與山羊的完全一致。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可見(jiàn)，哺乳類、鳥類、魚類的IRF1處于不同分支。

在成功克隆綿羊IRF1 后，構(gòu)建IRF1真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，初步探索IRF1蛋白特性。綿羊IRF1真核表達(dá)結(jié)果顯示，IRF1蛋白顯示分子量不同的兩個(gè)條帶，推測(cè)較大的條帶是磷酸化的IRF1，這一結(jié)果與綿羊IRF1磷酸化預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合，即在綿羊IRF1蛋白上預(yù)測(cè)到較多的磷酸化位點(diǎn)。另外，IRF1作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，一般要經(jīng)過(guò)磷酸化修飾后進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮功能。因此，本研究構(gòu)建的綿羊IRF1真核表達(dá)質(zhì)粒，可用于后續(xù)關(guān)于綿羊IRF1功能的研究。

IRF1在宿主抵御病原體方面發(fā)揮著重要作用。分支桿菌感染巨噬細(xì)胞可刺激IRF1表達(dá)，IRF1又激活下游免疫應(yīng)答基因發(fā)揮抗分支桿菌的作用[13]。研究表明，豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染通過(guò)上調(diào)IRF1表達(dá)激活TNF-α啟動(dòng)子，從而促進(jìn)豬肺部TNF-α高水平轉(zhuǎn)錄[14-15]。此外，腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1)也可參與誘導(dǎo)IRF1和IFN-β的表達(dá)增加[16]。值得注意的是，MO感染綿羊誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的TNF-α，綿羊肺部IRF1上調(diào)表達(dá)[9]。那么，在MO感染中綿羊IRF1是否能激活TNF-α啟動(dòng)子促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，需要進(jìn)一步研究。

本研究克隆、分析了綿羊IRF1基因，并構(gòu)建了綿羊IRF1真核表達(dá)載體，成功表達(dá)出了綿羊IRF1的重組蛋白，為探究MO感染中綿羊IRF1功能提供了材料。