鄭艷玲，鄭月茂，姜八一，王勇勝，張 涌*

(1.西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院,山東濰坊 261061)

產肉量是肉畜的主要經濟性狀，它一向是畜牧業(yè)育種和飼養(yǎng)管理的主要目標之一。1997年，美國John Hopkins大學的McPherron等[1]研究發(fā)現(xiàn)肌肉生成抑制素(myostatin，MSTN)是骨骼肌生長發(fā)育的負調控因子，其活性的喪失，會引起動物肌肉的過度發(fā)育，肌纖維直徑變大或肌纖維數(shù)增加，表現(xiàn)為動物的“雙肌”性狀。在自然界中存在MSTN基因突變導致的比利時藍牛、皮特蒙特牛及特克賽爾綿羊的雙肌表型。對牛的研究表明，雙肌性狀可以使牛在相同的飼喂條件下肌肉產量增加20%～30%，雙肌牛的肉骨比比普通牛高30%，雙肌肉有較好的肉質，且脂肪率低，口感良好。因此，通過對MSTN基因的突變、缺失、敲除及基因沉默等遺傳修飾，獲得轉基因克隆動物，可以達到提高家畜肌肉重量的目的，生產具有商業(yè)化價值的優(yōu)良品種家畜。本研究根據(jù)牛的MSTN基因序列設計并合成4對針對MSTNCDS區(qū)的miRNA寡聚單鏈DNA序列，將其連入miRNA表達載體中，構建得到了能夠有效對MSTNmRNA合成和蛋白表達進行干擾的載體，為后續(xù)通過miRNA干擾敲減肉牛MSTN基因的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌株和細胞 BLOCK-iTTMPol Ⅱ miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP (K4936-00)載體構建試劑盒，Invitrogen生物技術有限公司產品；DH5α菌株為實驗室保存；秦川肉牛胎兒骨骼肌衛(wèi)星細胞為實驗室保存細胞。

1.1.2 主要試劑SalⅠ、1 kb DNA Ladder，MBI公司產品；Trizol，Invitrogen公司產品；反轉錄試劑盒與SYBR?Premix ExTaqTMⅡ (Perfect Real Time)，大連寶生物公司產品；胎牛血清，GIBCO公司產品；Ham’s F-10液體培養(yǎng)基，Sigma公司產品；一抗MSTN多克隆抗體，Millopore公司產品；細胞轉染試劑Fugene HD，Roche公司產品。

1.1.3 主要儀器 凝膠成像分析系統(tǒng)(GDS8000)，美國UVP公司產品；熒光定量PCR儀(7500)，美國ABI公司產品；熒光相差倒置顯微鏡(TE2000)，日本NIKON公司產品。

1.2 方法

1.2.1 miRNA寡聚單鏈DNA序列的合成 根據(jù)牛MSTN基因序列 (序列號AY160688)，應用Invitrogen公司的在線設計軟件Invitrogen’s RNAi Designer設計4對miRNA寡聚單鏈DNA序列及1對無效序列(陰性對照)，交由上海英駿生物公司進行合成，序列見表1。

表1 miRNA寡聚單鏈DNA序列(附陰性對照序列)Table 1 miRNA single-stranded oligo DNA sequences (with the negative control sequence)

1.2.2MSTN基因miRNA干擾載體的構建 將4對靶向MSTN的寡聚單鏈DNA序列及1對陰性對照退火后形成雙鏈，然后用載體構建試劑盒BLOCK-iTTMPol Ⅱ miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP進行重組，將5對雙鏈的miRNA oligo分別插入到miRNA表達載體pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR中，從而構建5個miRNA干擾載體，分別命名為miR-MSTN-1、miR-MSTN-2、miR-MSTN-3、miR-MSTN-4及miR-Neg，干擾載體的總長度為5 763 bp。

1.2.3 有效干擾載體的篩選

1.2.3.1 肉牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的復蘇和培養(yǎng) 將凍存的原代秦川肉牛胎兒骨骼肌衛(wèi)星細胞在37℃水浴中解凍，接種在60 mm細胞培養(yǎng)皿中，用含15%胎牛血清的Ham’s F-10對細胞進行培養(yǎng)。

1.2.3.2 細胞的瞬時轉染 當細胞生長至80%匯合時，將細胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化，按5×105細胞/皿將骨骼肌衛(wèi)星細胞接種于含15%FBS的Ham’s F-10培養(yǎng)液的6孔板上。當骨骼肌衛(wèi)星細胞生長達到50%～60%匯合時，用脂質體FugeneHD將MSTN基因miRNA干擾載體miR-MSTN-1、miR-MSTN-2、miR-MSTN-3、miR-MSTN-4及陰性對照干擾載體miR-Neg轉染骨骼肌衛(wèi)星細胞，未轉染細胞作為空白對照。

1.2.3.3 熒光顯微鏡觀察轉染效率 利用熒光顯微鏡觀察干擾載體轉染48 h后的細胞。選擇最大激發(fā)波長為488 nm，最大發(fā)射波長為507 nm。

1.2.3.4 實時熒光定量PCR法檢測MSTNmRNA的表達 用Trizol從1組未轉染組(空白對照組)細胞和5組轉染細胞(試驗組)中分別提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA，實時熒光定量PCR法分析各組MSTN基因相對表達水平，β-actin作為內參基因，定量數(shù)據(jù)用2-△△Ct的方法分析。PCR引物序列見表2。

表2 實時熒光定量PCR引物信息Table 2 Primer information for real-time quantitative PCR

1.2.3.5 Western blot檢測MSTN蛋白表達 從未轉染組和試驗組胎兒骨骼肌衛(wèi)星細胞中提取全蛋白進行MSTN蛋白表達的檢測，用MSTN多克隆抗體作為一抗，MSTN一抗稀釋倍數(shù)為1∶3 000；β-actin作為內參蛋白。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SPSS 26軟件進行統(tǒng)計學分析。組間比較采用T檢驗，P<0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.01表明差異極顯著。

2 結果

2.1 干擾載體構建結果

本試驗設計了4對針對MSTN基因CDS區(qū)4個不同區(qū)域的miRNA寡聚單鏈DNA序列及1對陰性對照序列，并構建了miRNA干擾載體，分別命名為miR-MSTN-1、miR-MSTN-2、miR-MSTN-3、miR-MSTN-4和miR-MSTN-Neg。miR-MSTN-1、miR-MSTN-2、miR-MSTN-3、miR-MSTN-4和miR-MSTN-Neg經載體上的單酶切位點SalⅠ酶切后均得到1條5 763 bp的條帶(圖1)，說明載體構建正確。

M.DNA標準；1.miR-Neg；2.miR-MSTN-1；3.miR-MSTN-2；4.miR-MSTN-3；5.miR-MSTN-4M.DNA Marker;1.miR-Neg;2.miR-MSTN-1;3.miR-MSTN-2;4.miR-MSTN-3;5.miR-MSTN-4圖1 miRNA干擾載體SalⅠ酶切鑒定結果Fig.1 Identification of miRNA expression vectors with SalⅠ

2.2 細胞轉染結果

用4個干擾載體與1個陰性對照載體轉染骨骼肌衛(wèi)星細胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察，干擾載體轉染組細胞發(fā)綠色熒光，48 h后80%以上的細胞中有EmGFP表達，而未轉染組沒有檢測到EmGFP的表達，說明轉染成功(圖2)。

A、A0.未轉染組；B、B0.miR-Neg轉染組；C、C0.miR-MSTN-1轉染組；D、D0.miR-MSTN-2轉染組；E、E0.miR-MSTN-3轉染組；F、F0.miR-MSTN-4轉染組；A、B、C、D、E、F.光學顯微鏡下觀察；A0、B0、C0、D0、E0、F0.熒光顯微鏡下觀察A,A0.Untransfected group;B,B0.miR-Neg group.C,C0.miR-MSTN-1 group;D,D0.miR-MSTN-2 group;E,E0.miR-MSTN-3 group;F,F0.miR-MSTN-4 group;A,B,C,D,E,F.Cells observed under light microscope;A0,B0,C0,D0,E0,F0.Cells observed under fluorescent microscope.圖2 未轉染組及轉染組轉染48 h后細胞觀察結果(×200，標尺代表50 μm)Fig.2 The result of untransfected cells and transfected cells observed under the fluorescence microscope after 48 h post-transfection (×200,the scale bars indicate 50 μm)

2.3 實時熒光定量PCR法檢測MSTN mRNA的表達結果

在轉染肉牛骨骼肌衛(wèi)星細胞48 h 后，實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR-MSTN-1、miR-MSTN-2、miR-MSTN-3、miR-MSTN-4 4個試驗組均有效抑制了MSTN基因mRNA的表達。MSTNmiRNA干擾載體轉染組與未轉染組相比MSTNmRNA的相對表達量為52.6%、47.4%、50.9%和26.3%，差異均極顯著(P<0.01)，而陰性對照組與未轉染組相比相對表達量為91.2%，差異不顯著(P>0.05)，通過計算得到4個miR-MSTN轉染組干擾效率分別為47.4%、52.6%、49.1%和73.7%(圖3)。

1.未轉染組；2.miR-Neg轉染組；3.miR-MSTN-1轉染組；4.miR-MSTN-2轉染組；5.miR-MSTN-3轉染組；6.miR-MSTN-4轉染組；a.P<0.011.Untransfected group;2.miR-Neg group;3.miR-MSTN-1 group;4.miR-MSTN-2 group;5.miR-MSTN-3 group;6.miR-MSTN-4 group;a.P<0.01圖3 miRNA干擾載體對MSTN表達的影響Fig.3 Effect of miRNA interference vectors on MSTN expression

2.4 Western blot檢測MSTN蛋白表達

Western blot進一步檢測MSTN蛋白表達量發(fā)現(xiàn)，4個MSTN干擾組MSTN蛋白水平與對照組相比明顯下降，其中miR-MSTN-4組與陰性對照組及未轉染組相比蛋白表達量均少于其他3個組(圖4)。

1.未轉染組；2.miR-Neg轉染組；3.miR-MSTN-1轉染組；4.miR-MSTN-2轉染組；5.miR-MSTN-3轉染組；6.miR-MSTN-4轉染組

3 討論

MSTN會抑制動物的肌肉生長和發(fā)育，當MSTN基因在某些條件下缺失或突變時，會導致動物肌肉肥大，這對提高動物肌肉產量是極其有益的，因此，不斷有科研人員開展敲減動物體內MSTN基因的研究。在畜牧業(yè)上，已有很多研究利用基因敲除技術獲得了MSTN基因缺失的動物[2-4]。

MSTN基因是動物體內正常表達的一個基因，它不僅僅在骨骼肌中表達，在很多動物的心肌、乳腺組織等均有表達[5-6]。雙肌牛具有的繁殖力下降、難產率增加、成活率低及患有呼吸道疾病等缺點，可能都是由于MSTN基因的非骨骼肌特異性表達引起的，MSTN敲除或抑制以后影響了其在非骨骼肌組織器官參與的正常生理過程。利用組織特異性基因敲除或組織特異性RNA干擾的方法對MSTN基因進行組織特異性基因沉默為動物育種開辟了一條新的途徑，具有很好的發(fā)展前景，目前還沒有見到利用組織特異性敲減MSTN的報道。

pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR載體中CMV 啟動子可由高效的RNA聚合酶Ⅲ或具有聚合酶Ⅱ啟動子啟動的單順反子甚至多順反子轉錄，這可允許組織特異性表達系統(tǒng)和條件性表達系統(tǒng)的使用[7]，從而能夠達到組織特異性干擾的目的。其中還含有形成miRNA前體物必需的5＇和3＇miR 側翼區(qū)，借鑒了miRNA的左右翼序列，相對于普通的shRNA，更易形成成熟的干擾RNA，表達水平更高，干擾效率也更強[8]，因此，本試驗選用pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR用于干擾載體的構建。構建的載體中含有報告基因EmGFP進行共轉染，這有利于追蹤轉染的細胞，可對其轉染效率進行觀察。

本試驗針對MSTN基因的外顯子區(qū)設計的4對miRNA寡聚單鏈DNA序列，通過試驗證明其對骨骼肌衛(wèi)星細胞MSTNmRNA及蛋白的表達都有一定的沉默作用，而包含第4對片段miR-MSTN-4干擾效果最好，對MSTNmRNA表達的干擾效率達到70%以上，這可能與第4對片段是針對MSTN基因編碼活性區(qū)保守性最高的第3外顯子設計有關。本研究為后續(xù)利用miRNA干擾MSTN轉基因肉牛的研究奠定了基礎。