余希婧 黃 輝 胡秀武 朱俐娜 耿樂樂 呂明芳 華水生

（1.江西省南昌市洪都中醫(yī)院，江西 南昌 330038；2.江西省南昌市長蛇灸效應(yīng)機制和督脈特異性重點實驗室，江西省針灸醫(yī)學臨床研究中心，江西 南昌 330038）

強直性脊柱炎（AS）是一種免疫介導的炎癥性疾病，是常見的進行性風濕性疾病，伴有疼痛及結(jié)構(gòu)和功能損害［1-2］。AS是脊柱關(guān)節(jié)病患者中最常見的影響中軸骨骼的疾病，可導致炎性腰痛，嚴重影響患者的生活質(zhì)量［3］。炎癥反應(yīng)是AS的重要因素，AS引起的脊柱炎癥可逐漸導致胸椎和肋椎關(guān)節(jié)的融合和骨化，在AS的早期若未進行有效干預，部分患者的背部后凸度增加，胸部僵硬，胸腔內(nèi)永久性不動，并出現(xiàn)聯(lián)合體，使得脊柱活動度降低［4-6］。

近年來，許多研究表明中醫(yī)藥對AS有顯著療效，如針刺、針灸結(jié)合、溫針、電針、蜂療、火針療法等都可顯著改善AS癥狀［7-9］。已有研究明確了AS中炎性細胞因子是改善AS危險分層和評價治療方法的重要指標［10］，另一方面，激活過氧化物酶體增殖激活受體（PPARγ）可顯著抑制炎癥因子的表達［11］。雖然目前尚不清楚AS的發(fā)病機制，但白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子在AS發(fā)病中起著重要作用［12-14］。在臨床上采用長蛇灸治療可顯著改善AS早期患者的臨床癥狀和體征，但長蛇灸改善AS的分子機制尚需進一步研究。本研究主要觀察長蛇灸是否通過激活PPARγ來抑制炎癥因子從而改善早期AS大鼠模型，有望阻斷或延緩疾病的快速進展。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3月齡健康SD大鼠，共48只，雌雄不限，體質(zhì)量250～280 g，購自北京華富康生物科技有限公司。本實驗中的動物模型按照我院動物倫理委員會的指導原則進行處理（倫理號：S2020ZPYFB0996）。

1.2 試藥與儀器

艾絨購于南陽神農(nóng)艾草生物制品有限公司。二甲基十八胺購于美國Sigma。ELISA試劑盒（美國R&D systems公司），Bio-Rad微孔板熒光分光光度計（美國Rayto），Trizol試劑（美國Invitrogen），RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國賽默飛），qPCR試劑盒（百邁客生物），RIPA裂解液（北京鼎國長生生物），BCA試劑盒（北京鼎國長生生物），PVDF（美國Bio-Rad），ECL顯色液（美國賽默飛）。

1.3 模型制備

把大鼠隨機分為4個組，空白對照組、模型組、長蛇灸組、假長蛇灸組，每組12只。用二甲基十八胺溶解人蛋白多糖提取物，腹腔注射2 mg，每周2次，共4次，構(gòu)建強直性脊柱炎模型［15］?？瞻讓φ战M注射同劑量的生理鹽水。2周后評估大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀和體征［16］，評分標準為0分（無癥狀）、1分（1個腳趾紅腫）、2分（多個腳趾紅腫）、3分（腳趾僵硬）和4分（畸形或腳踝受累）。

1.4 治療方法

成模后開始進行長蛇灸治療，大鼠沿背側(cè)頸部脊柱督脈減去寬約0.5 cm毛發(fā)，將大鼠背側(cè)向上固定于工作臺上，取生姜研磨成糊狀，在背側(cè)沿頸部脊柱督脈擺放成寬0.4 cm、高0.3 cm的長方條，用純艾絨搓成細條狀，鋪在姜層上點燃，燃盡為1壯，每次5壯，隔日1次，共7次。假長蛇灸組操作同治療組，不點燃艾絨。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 細胞因子的ELISA分析 麻醉大鼠取眼眶后血液氮保存。用ELISA試劑盒測定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-23的含量。用Bio-Rad微孔板熒光分光光度計在405 nm處測量光密度，然后分析數(shù)據(jù)。

1.5.2 實時定量PCR分析細胞因子mRNA 最后1次長蛇灸治療4 h后，麻醉取大鼠椎體組織，使用Trizol試劑從組織中分離RNA。將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑說明書進行qPCR實驗。引物如下：IL-1β 正義鏈：5'-TGAGACCTAGTGTGG-3'，反義鏈：5'-TCCATTGAGGGAGGCTT-3'；IL-6正義鏈：5'-AGCTAACGCGACTTC-3'，反義鏈：5'-TGACGTCGAACGCA GTGC-3'；TNF-α 正義鏈：5'-CGAGTAGCGTGCGTA-3'，反義鏈：5'-GTTACTGTCGAGATGTCAT-3'；IL-17正義鏈：5'-ATGCTTGATCATGACTGT-3'，反義鏈：5'-CTATACATCATGGTCATG-3'；IL-23正義鏈：5'-CTAAGTCCTGCGACTGA-3'，反義鏈：5'-CGATCCTAGCAATGAC-3'；β-actin正義鏈：5'-TGTCAACTGGGACGATA-3'，反義鏈：5'-GGGGTGTTGAAGGTCAAA-3'。

1.5.3 Western blotting 麻醉大鼠取20 mg的AS組織，用100 mL RIPA裂解液在冰上30 min充分裂解組織。4℃、12 000 r/min離心15 min，用BCA試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)（50 μg），轉(zhuǎn)移到PVDF上。5%脫脂牛奶封閉，然后將PVDF膜在4℃孵育一抗過夜，再用二抗在室溫下孵育1 h，并用ECL顯色液顯色。用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度。

1.6 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，采用雙因素方差分析對不同組間的外周疾病進展情況進行分析，單因素方差分析用于比較蛋白質(zhì)表達水平。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠不同時間關(guān)節(jié)平均評分比較

見圖1，表1。通過監(jiān)測足爪腫脹和后腿關(guān)節(jié)僵硬來評估AS周圍性關(guān)節(jié)炎，模型組與空白對照組相比評分顯著增高，長蛇灸組與模型組相比評分顯著下降，表明長蛇灸可顯著改善AS模型大鼠的周圍關(guān)節(jié)炎。

表1 各組大鼠不同時間關(guān)節(jié)平均評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠不同時間關(guān)節(jié)平均評分比較（分，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與長蛇灸組比較，#P＜0.05。下同。

組別空白對照組模型組長蛇灸組假長蛇灸組n 12 12 12 12 0 d 0.17±0.29 0.29±0.27 0.33±0.26 0.30±0.27 1 d 0.33±0.29 0.43±0.35 0.29±0.39 0.36±0.48 3 d 0.21±0.27 0.86±0.90 1.00±0.82 1.14±0.69 5 d 0.25±0.27 1.86±0.90*2.14±0.69 2.00±0.82 7 d 0.21±0.26 3.14±1.07*3.29±1.38△3.57±1.27 9 d 0.14±0.24 4.29±1.11*3.43±1.27△4.43±0.79#11 d 0.16±0.21 5.86±1.07*4.00±0.82△5.93±1.10#13 d 0.08±0.20 6.79±1.22*4.57±1.13△6.64±1.11#15 d 0.07±0.19 8.50±1.04*5.14±0.90△8.21±1.41#

圖1 長蛇灸對周圍病進展及關(guān)節(jié)平均評分的影響

2.2 各組大鼠炎性細胞因子水平比較

見表2。與空白對照組相比，模型組的TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-23和IL-6水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，長蛇灸組的TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-23和IL-6水平顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠外周血炎性細胞因子水平比較（pg/mg，±s）

表2 各組大鼠外周血炎性細胞因子水平比較（pg/mg，±s）

組別空白對照組模型組長蛇灸組假長蛇灸組n 12 12 12 12 IL-1β 1.63±0.32 8.13±1.64*4.60±0.36△9.60±1.28#TNF-α 15.13±3.01 45.63±2.12*27.47±2.50△42.57±2.21#IL-6 1.57±0.31 8.57±1.66*4.60±0.85△9.60±1.55#IL-17 11.17±1.04 18.83±1.40*13.67±1.36△20.13±2.65#IL-23 95.27±4.61 182.07±10.72*120.70±10.01△183.70±15.19#

2.3 各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-23的mRNA表達水平比較

見表3。與空白對照組比較，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，長蛇灸組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-23的mRNA水平顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-23 mRNA表達水平比較（%，±s）

表3 各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-23 mRNA表達水平比較（%，±s）

組別空白對照組模型組長蛇灸組假長蛇灸組n 12 12 12 12 IL-1β mRNA 92.07±10.55 205.33±17.89*148.90±16.16△209.87±27.57#TNF-α mRNA 93.07±14.05 305.53±20.52*176.30±7.65△314.17±22.42#IL-6 mRNA 97.57±2.31 185.10±13.26*141.70±5.96△186.13±23.48#IL-17 mRNA 96.30±3.44 275.77±23.15*205.33±14.71△292.47±26.53#IL-23 mRNA 99.23±0.80 246.93±14.84*165.70±14.93△243.77±30.66#

2.4 各組大鼠PPARγ表達比較

見圖2，表4。與正常大鼠相比，模型大鼠PPARγ表達顯著下降（P＜0.05）。與模型組相比，長蛇灸組的PAARγ表達水平顯著增加（P＜0.05）。

表4 各組大鼠PPARγ/β-actin表達比較（±s）

表4 各組大鼠PPARγ/β-actin表達比較（±s）

組別空白對照組模型組長蛇灸組n 12 12 12 PPARγ/β-actin 0.18±0.06 0.06±0.01*0.30±0.14△

圖2 各組大鼠PPARγ條帶

3 討論

AS是一種病因不明的全身性自身免疫性疾病，早期的癥狀是脊柱和骶髂關(guān)節(jié)的骨關(guān)節(jié)侵蝕，最終導致強直和纖維化，炎癥因子在自身免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［17-18］。促炎細胞因子的濃度升高導致AS患者局限于脊椎和骶骨關(guān)節(jié)的軸向表現(xiàn)，強直是由于間充質(zhì)細胞的增殖和生長以及富含蛋白多糖的膠原基質(zhì)的聚集，在關(guān)節(jié)中炎癥介質(zhì)緩慢地損害骨組織。研究證實，炎癥介質(zhì)如IL-6、IL-1β和TNF-α刺激破骨細胞和其他炎癥細胞加重病變［19-20］。在細胞中PPARγ對炎癥因子轉(zhuǎn)錄起著關(guān)鍵作用，其激活后可減輕炎癥損傷［21］。有研究報道，艾灸治療通過抗炎發(fā)揮緩解強直性脊柱炎的結(jié)構(gòu)和功能，改善相關(guān)癥狀［22-23］。長蛇灸是否通過激活PPARγ并最終減少炎癥因子的釋放來緩解AS目前尚不清楚。

本研究結(jié)果表明，在AS大鼠模型早期長蛇灸治療能減輕疾病進展程度，同時長蛇灸對IL-6、IL-1 β、IL-17、IL-23和TNF-α等促炎細胞因子具有顯著抑制作用，也顯著下調(diào)IL-6、IL-17、IL-23、IL-1β和TNF-α的mRNA表達水平。PPARγ激活可抑制炎癥因子表達［24-26］。本研究進一步發(fā)現(xiàn)長蛇灸可在AS模型中激活PPARγ的表達。因此，筆者認為長蛇灸可能通過激活PPARγ抑制IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-17和IL-23等炎癥因子的表達從而緩解AS。

AS的主要病因尚不清楚，然而已經(jīng)明確的是促炎細胞因子如TNF-α的釋放、IL-1β、IL-6參與了AS的發(fā)病機制［11，27］。TNF-α是病程中的一種多功能細胞因子，已有研究表明AS患者骶髂關(guān)節(jié)內(nèi)TNF-α水平較高［28］。TNF-α抑制劑可以減輕AS患者的臨床癥狀和體征，并與血清C反應(yīng)蛋白（CRP）水平和軸性炎癥同步變化［29］。此外，AS患者血清IL-6水平升高。先前的研究報道，IL-6與AS患者的疾病活動呈正相關(guān)［11］。AS患者IL-6水平升高與CRP、血小板計數(shù)及臨床參數(shù)呈正相關(guān)［30］。此外，IL-1β由有核細胞分泌，但主要由巨噬細胞分泌，并參與炎癥，在AS初期，人體IL-1β表達水平明顯升高。本研究發(fā)現(xiàn)，長蛇灸可激活PPARγ，同時抑制外周血中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17和IL-23的表達。

綜上所述，在AS大鼠模型初期介入長蛇灸治療可能通過激活PPARγ發(fā)揮抗炎作用，延緩AS病情的快速進展，縮短病程。AS模型中，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-23顯著增加，同時PPARγ顯著下調(diào)，通過長蛇灸治療可顯著激活PPARγ，同時抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-23的表達。因此，長蛇灸通過緩解炎癥來改善初發(fā)AS是有價值的治療策略，本研究為長蛇灸治療AS提供了理論依據(jù)。