吳穎欣，王汝上，林明越

(1.佛山市中醫(yī)院西藥房，廣東 佛山 528000；2.廣州康臣藥物研究有限公司研發(fā)中心，廣州 510530；3.佛山市中醫(yī)院制劑中心，廣東 佛山 528000)

廣東紫珠CallicarpakwangtungensisChun為馬鞭草科紫珠屬落葉小灌木，通常高約2 m，主要分布于江西、湖南、福建、廣東和廣西等南方地區(qū)的低海拔山林之中[1]。廣東紫珠原為江西萍鄉(xiāng)地區(qū)民間習(xí)用藥，最早被收載于1996年《江西省藥材標(biāo)準(zhǔn)》[2]；由于其療效確切，應(yīng)用較為廣泛，是中成藥抗宮炎片、抗宮炎顆粒的主要原料之一，隨后于2010年被新增收載于《中華人民共和國藥典：一部》[3]。近年來，隨著對廣東紫珠資源的不斷開發(fā)，對其所含化學(xué)成分研究的報道日益增加，從廣東紫珠地上部分分離鑒定到黃酮類、酚酸類、三萜類和苯丙素類等數(shù)十種化合物，包括含量較高的金石蠶苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、木犀草素及木犀草苷[4-8]。

廣東紫珠以其干燥莖枝和葉入藥，中醫(yī)認(rèn)為其具有收斂止血、散瘀、清熱解毒的功效，可用于衄血、咯血、吐血、便血、崩漏、外傷出血及肺熱咳嗽等癥狀[9]。藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，廣東紫珠具有抗炎[10-11]、抗菌[12-13]和止血[14-15]等活性，其所含的苯丙素類、黃酮類成分為其潛在主要藥理活性成分。動物抗炎實驗結(jié)果顯示，廣東紫珠含有的苯丙素類成分連翹酯苷B能有效抑制小鼠耳腫脹及降低腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL)6水平[16]；體外細(xì)胞抗炎實驗結(jié)果顯示，連翹酯苷B、金石蠶苷和毛蕊花糖苷對脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞增殖具有較強(qiáng)抑制作用，并能降低細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-6水平[16]。上述研究結(jié)果提示，3種苯丙素類苷類化合物均具有較強(qiáng)的抗炎作用。廣東紫珠中的木犀草素和木犀草苷等主要黃酮類化合物經(jīng)藥效評價顯示具有抗炎、止血作用，這可能是廣東紫珠具有收斂止血、清熱解毒功效的主要活性部位[17-19]。中藥具有多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用特點，其所含活性成分眾多，作用機(jī)制復(fù)雜多樣，采用限定1～2個化合物含量的傳統(tǒng)質(zhì)控方法常具有較大片面性，難以充分反映藥材真實質(zhì)量信息。因此，建立以有效成分為核心的多指標(biāo)中藥質(zhì)控體系方法具有較大現(xiàn)實意義?，F(xiàn)行藥典僅對廣東紫珠中金石蠶苷及連翹酯苷B的含量做出規(guī)定，而毛蕊花糖苷、木犀草素和木犀草苷作為其中含量較高、藥理活性明確的有效成分未見有相關(guān)含量研究報道。因此，本研究采用高效液相色譜(HPLC)法對廣東紫珠中的連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草素和木犀草苷5種主要有效成分進(jìn)行含量測定，以期為廣東紫珠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步提升提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀(PDA檢測器，美國Waters公司)；ME204E萬分之一分析天平(d=0.000 1 g，瑞士Mettler公司)；KQ-300DE型超聲波清洗器(功率為300 W，頻率為40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)；AX-205十萬分之一電子天平(d=0.000 01 g，瑞士Mettler公司)；CX-500A型高速多功能粉碎機(jī)(上海市晟喜制藥機(jī)械有限公司)；Milli-Q Synergy型超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 藥品與試劑

廣東紫珠購自廣州清平藥材市場，產(chǎn)地為廣西桂林市(8批均采自同一種植基地)，采收時間為2019年8月至2019年11月，經(jīng)廣州康臣藥物研究有限公司王汝上高級工程師鑒定為馬鞭草科植物廣東紫珠CallicarpakwangtungensisChun的干燥莖枝及葉。連翹酯苷B(批號：111811-201603；含量以96.6%計)、金石蠶苷(批號：111812-201303；含量以96.9%計)、毛蕊花糖苷(批號：111530-201914；含量以95.2%計)、木犀草素(批號：111520-201605；含量以99.6%計)及木犀草苷(批號：111720-201810；含量以93.5%計)對照品均購自中國藥品食品檢定研究院。乙腈(色譜純，德國Merck公司)；乙酸(色譜純，阿拉丁試劑有限公司)；其余所用試劑均為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

將采購的廣東紫珠低溫干燥過夜，迅速粉碎后過三號藥篩，稱取過篩后的干粉約0.5 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，50 ℃下超聲提取30 min，室溫(25 ℃)放冷后，用70%甲醇補(bǔ)足減失重量；搖勻后靜置取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，即得廣東紫珠供試品溶液。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取木犀草苷、連翹酯苷B、木犀草素、金石蠶苷和毛蕊花糖苷對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加入適量70%甲醇超聲溶解，放冷至室溫后用70%甲醇定容至刻度，制得連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷及木犀草素濃度分別為1.857、1.533、0.562、0.129及0.354 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性考察

色譜柱為Agilent ZORBAX Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動相為乙腈(A)-0.1%乙酸水(B)，梯度洗脫：0～5 min，20%A；5～20 min，20%～50%A；20～30 min，50%A；30～70 min，50%～80%A。流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

取空白提取溶劑、混合對照品溶液和供試品溶液，依照上述該色譜條件進(jìn)樣分析，觀測5種待測成分峰形、分離度和理論塔板數(shù)等指標(biāo)。結(jié)果顯示，5種待測成分色譜峰峰形尖銳對稱，無峰前沿或拖尾，分離度均≥1.5，理論塔板數(shù)按照連翹酯苷B計算不低于3 000，連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素保留時間分別為17.911、26.026、39.767、45.480和57.003 min，表明該方法專屬性良好。空白提取溶劑、混合對照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖1。

A.空白對照品；B.混合對照品；C.供試品；1.連翹酯苷B；2.金石蠶苷；3.毛蕊花糖苷；4.木犀草苷；5.木犀草素A.blank control;B.mixed reference substance;C.test samples;1.forsythiaside B;2.poliumoside;3.verbascoside;4.galuteolin;5.luteolin圖1 HPLC圖Fig 1 HPLC chromatogram

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品溶液0.1、0.25、0.5、1.0和2.0 mL至10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，充分混合均勻后即得梯度濃度混合對照品工作液。按上述色譜條件進(jìn)行測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，以對應(yīng)色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 5個成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Tab 1 Regression equation of standard curve of 5 components

2.5 檢測限、定量限考察

取最低濃度的混合對照品工作液(連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素濃度分別為46.43、38.33、14.05、3.23和8.85 μg/mL)，用70%甲醇稀釋成系列濃度的溶液。分別按照上述色譜條件進(jìn)樣分析，以信噪比S/N=3為檢測限(LOD)，以信噪比S/N=10為定量限(LOQ)。結(jié)果顯示，連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素的LOD分別為0.348、0.383、0.281、0.215和0.295 ng，LOQ分別1.160、1.277、0.936、0.717和0.983 ng。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗：取混合對照品溶液按上述色譜條件連續(xù)重復(fù)測定6次，記錄5種待測成分峰面積并計算RSD。結(jié)果顯示，連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素6次測定峰面積的RSD分別為0.46%、0.48%、0.67%、0.53%和0.98%(n=6)，表明該儀器精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液按上述色譜條件分別于0、2、4、8、12和24 h時進(jìn)樣分析，記錄5種待測成分峰面積并計算RSD。結(jié)果顯示，24 h內(nèi)6次進(jìn)樣連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素峰面積的RSD分別為0.84%、0.58%、0.78%、0.69%和0.54%，表明樣品供試品溶液在室溫條件下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗：稱取廣東紫珠樣品(批號：190816)粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定，按上述已建立的方法分別制備供試品溶液并進(jìn)樣測定，記錄5種待測成分峰面積并計算6次測定的平均含量和RSD。結(jié)果顯示，連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素平均含量分別為7.84、6.88、1.29、0.09和0.20 mg/g，6次測定的RSD分別為0.98%、0.81%、1.01%、0.88%和0.85%(n=6)，表明建立的方法的重復(fù)性良好。

2.6.4 加樣回收率試驗：稱取廣東紫珠(批號：190816)粉末6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入新配置對照品溶液，按上述已建立的方法分別制備供試品溶液并進(jìn)樣測定，計算5種待測成分平均加樣回收率。結(jié)果顯示，連翹酯苷B平均加樣回收率為99.59%，RSD為1.04%；木犀草苷平均加樣回收率為100.20%，RSD為2.30%；金石蠶苷平均加樣回收率為98.98%，RSD為1.51%；毛蕊花糖苷平均加樣回收率為99.05%，RSD為2.04%；木犀草素平均加樣回收率為99.83%，RSD為1.87%，表明建立的含量測定方法準(zhǔn)確度高，見表2。

表2 加樣回收率測定結(jié)果Tab 2 Results of recovery rate

2.7 樣品的測定

取8個不同采收批次(采收時間自2019年8月至2019年11月)的廣東紫珠樣品，分別按上述已建立的方法制備供試品溶液并進(jìn)樣測定，記錄各樣品峰面積，以外標(biāo)法計算連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素5種成分的平均含量，見表3。

表3 樣品的含量測定結(jié)果(n=3，mg/g)Tab 3 Content determination results of samples (n=3,mg/g)

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的確定

提取溶劑、提取方法和提取時間對藥材中有效成分溶出提取均有較大影響。本實驗在前期對提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，分別考察了料液比、提取溶劑、提取方法以及提取時間對5種成分提取率的影響，結(jié)果提示，料液比為1 ∶ 50、以70%甲醇為提取溶劑、超聲處理30 min對5種待測成分綜合提取效率最高。

3.2 檢測波長的選擇

參照已有的文獻(xiàn)報道，連翹酯苷B、金石蠶苷和毛蕊花糖苷最大吸收波長在330 nm附近，木犀草苷和木犀草素最大吸收波長在350 nm附近[20-22]。對供試品和對照品進(jìn)行全波長(190～400 nm)光譜掃描，發(fā)現(xiàn)檢測波長取330 nm時，5種待測成分色譜峰基線較平穩(wěn)、分離效果好、響應(yīng)值均較大，能較好反映樣品中5種待測成分的含量信息，故本方法最終采用330 nm為檢測波長。

3.3 柱溫的選擇

柱溫對色譜保留時間、分離度及峰形均有不同程度的影響，較高的柱溫可有效縮短色譜峰保留時間和降低峰寬，從而縮短分析時間、提高待測成分信噪比。本實驗考察了室溫至45 ℃范圍內(nèi)不同溫度對5種待測成分分離測定效果的影響。結(jié)果顯示，柱溫取35 ℃最優(yōu)，5種待測成分保留時間適中，色譜峰形良好、信噪比較高且與相鄰色譜峰均能有效分離。

3.4 測定結(jié)果分析

黃酮類與苯丙素類成分為廣東紫珠的主要化學(xué)成分，含量豐富，且具有較為顯著的藥理活性，是評價廣東紫珠藥用價值與質(zhì)量控制的重要指標(biāo)[11-15]?！吨腥A人民共和國藥典：一部》(2020年版)中，廣東紫珠僅以連翹酯苷B和金石蠶苷含量為藥材質(zhì)量控制指標(biāo)，中藥具有整體性、多組分、多靶點的特點，僅以上述2種成分作為廣東紫珠的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)相對不夠全面，所以本實驗考察了廣西桂林市同一種植基地中不同采收期廣東紫珠中連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素5種有效成分的含量，結(jié)果顯示，8—11月采收的8批次廣東紫珠中連翹酯苷B及金石蠶苷總量均能滿足現(xiàn)行《中華人民共和國藥典：一部》(2020年版)的要求(兩者總量≥0.5%)，說明廣東紫珠在8—11月時間段采收均能滿足入藥要求。比較5種待測成分在廣東紫珠中的含量，發(fā)現(xiàn)5種成分在廣東紫珠中的含量差異較大，廣東紫珠不同采收期5種成分含量從高到低均為連翹酯苷B>金石蠶苷>毛蕊花糖苷>木犀草素>木犀草苷，故當(dāng)前《中華人民共和國藥典》選擇連翹酯苷和金石蠶苷為質(zhì)控指標(biāo)。比較5種有效成分不同采收期的含量，結(jié)果顯示，5種有效成分含量在8—11月均先升高后降低，其中連翹酯苷B、金石蠶苷和毛蕊花糖苷在10月中下旬含量最高，木犀草苷和木犀草素在9月下旬含量最高，按照當(dāng)前《中華人民共和國藥典》質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)要求，最佳采收期可為10月份。

本實驗建立的測定廣東紫珠中連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蠶苷、木犀草苷和木犀草素5種主要有效成分的HPLC法的科學(xué)性、準(zhǔn)確性、簡便性和準(zhǔn)確度均能較好地滿足科研和生產(chǎn)需求，可為廣東紫珠質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步提升提供一定的參考依據(jù)。