鄭雪玥 文江南 張秀敏 馬志遠(yuǎn) 鄧近平 王 敏*

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長沙410125；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州510642)

甲烷是畜牧業(yè)產(chǎn)生的主要溫室氣體之一，其中反芻家畜甲烷排放量占家畜甲烷排放總量的95%，是人類活動的最大排放源[1]。反芻家畜甲烷排放也是飼糧能量損失的重要途徑之一，占飼糧攝入總能的2%～12%[2]。因此，如何減少反芻家畜胃腸道甲烷排放是當(dāng)前研究的熱點問題。反芻家畜瘤胃內(nèi)的甲烷主要是通過氫營養(yǎng)、甲基營養(yǎng)和乙酸異化路徑產(chǎn)生[3]，其中氫營養(yǎng)路徑是甲烷菌利用氫和二氧化碳合成，是甲烷生成的主要路徑，約占甲烷總量的82%[4]。因此，在飼糧中補充可以與甲烷菌競爭氫的添加劑，可以通過減少瘤胃內(nèi)氫參與合成甲烷，降低甲烷排放[5-7]。

噴漿玉米皮是濕法碾磨玉米籽粒生產(chǎn)淀粉的重要副產(chǎn)物[8]，在生產(chǎn)過程中，通常會添加二氧化硫控制發(fā)酵條件[9]。因此，與玉米粉相比，噴漿玉米皮含有更多的纖維、蛋白質(zhì)和硫。研究表明，硫及其化合物可以作為氫受體與瘤胃甲烷菌競爭氫，從而降低甲烷排放[10]。我們推測，利用噴漿玉米皮替代玉米粉會降低飼糧淀粉含量，增加纖維和硫含量，從而改變飼糧性質(zhì)，這可能會影響瘤胃發(fā)酵和甲烷排放。因此，本試驗旨在利用噴漿玉米皮替代玉米粉，研究其對山羊營養(yǎng)物質(zhì)采食和消化、瘤胃發(fā)酵、甲烷排放和瘤胃微生物數(shù)量的影響，為噴漿玉米皮在山羊飼糧中的應(yīng)用和減少反芻家畜胃腸道甲烷排放提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計和飼養(yǎng)管理

試驗選用24只健康的山羊作為試驗動物，隨機分成2組，分別飼喂玉米粉飼糧和噴漿玉米皮飼糧，每組12只。噴漿玉米皮飼糧是由噴漿玉米皮完全替換玉米粉配制而成，試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。所有試驗羊均在代謝籠內(nèi)單獨飼喂(08：00和18：00)，自由飲水。試驗期47 d，預(yù)試期10 d，正試期37 d；最后19 d包括5 d飼糧、糞便和剩料樣品的收集，12 d甲烷排放的測定和2 d瘤胃液的采集。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 樣品采集

在試驗期的第29～33天，對每只山羊每天飼糧、剩料和糞便分別進(jìn)行收集，其中飼糧每天收集100 g，剩料和糞便全部收集并稱重，然后保存于-20 ℃冰柜。每只山羊每天取2份1%(質(zhì)量比)的糞便樣品，一份用10%(體積比)H2SO4進(jìn)行酸化，防止氮的損失；另一份不經(jīng)過任何處理。所有上述樣品在65 ℃條件下烘干48 h，然后粉碎、過篩、保存，用于后續(xù)測定。

在試驗期的第46～47天采集瘤胃內(nèi)容物，時間為每天的晨飼前以及晨飼后2.5和6.0 h。采用口腔胃管技術(shù)獲取瘤胃內(nèi)容物100 mL并丟棄，以避免唾液污染，然后采集200 mL備用。取10 mL瘤胃內(nèi)容物樣品用于測定pH和溶解態(tài)硫化氫濃度；取2份35 mL瘤胃內(nèi)容物樣品于50 mL注射器，用于測定溶解態(tài)氫和溶解態(tài)甲烷濃度；取3份10 mL瘤胃內(nèi)容物樣品進(jìn)行液氮速凍，然后置于-80 ℃冰箱保存，用作后續(xù)測定微生物數(shù)量；最后取2份10 mL瘤胃內(nèi)容物樣品，4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清1.5 mL，然后添加偏磷酸0.15 mL(25%，質(zhì)量體積比)進(jìn)行酸化處理，-20 ℃保存，用于測定揮發(fā)性脂肪酸和氨態(tài)氮濃度。

1.3 試驗樣品分析

參考前期報道的方法[11-12]，測定剩料、飼糧和糞便樣品的常規(guī)營養(yǎng)成分，其中，酸化處理的糞便樣品用于測定粗蛋白質(zhì)含量，非酸化處理的糞便樣品用于測定干物質(zhì)、粗灰分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、淀粉含量和能量。在試驗期的第34～45天，利用呼吸代謝艙和超便攜溫室氣體分析儀(GGA-30p，Los Gatos Research公司，美國)測定山羊甲烷和二氧化碳排放量[13]。利用便攜式pH計(上海奧豪斯儀器有限公司)測定瘤胃內(nèi)容物pH。使用帶有微型傳感器的硫化氫電極測定瘤胃溶解態(tài)硫化氫濃度。根據(jù)前期報道的方法提取瘤胃內(nèi)容物中的溶解態(tài)氣體，然后使用氣相色譜儀(Agilent Inc.公司，美國)進(jìn)行測定，并計算出溶解態(tài)氫和溶解態(tài)甲烷濃度[14]。瘤胃揮發(fā)性脂肪酸組分的測定流程參考Wang等[15]，并根據(jù)揮發(fā)性脂肪酸組成及濃度計算出氫的生成效率[16]。參考Weatherburn[17]報道的方法測定氨態(tài)氮濃度。按照Ma等[18]報道的方法提取微生物DNA，并采用瓊脂糖凝膠電泳(0.8%)和紫外分光光度計(ND1000，NanoDrop Technologies,Inc.公司，美國)對DNA進(jìn)行質(zhì)量和定量檢測，然后將DNA樣品稀釋到10 ng/μL，利用前期報道的引物，采用實時熒光定量PCR技術(shù)對選定的微生物種類進(jìn)行定量分析[19]。

1.4 數(shù)據(jù)計算和分析

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 21.0軟件的一般線性模型進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P≤0.05表示差異顯著，0.050.10表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 噴漿玉米皮替代玉米粉對山羊營養(yǎng)物質(zhì)采食和消化的影響

由表2可知，與玉米粉相比，噴漿玉米皮可以顯著提高山羊中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和粗蛋白質(zhì)采食量(P<0.05)，顯著降低淀粉采食量(P<0.05)。與玉米粉相比，噴漿玉米皮可以顯著提高山羊粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維消化率(P<0.05)，顯著降低干物質(zhì)、有機物和淀粉消化率(P<0.05)。

表2 噴漿玉米皮替代玉米粉對山羊營養(yǎng)物質(zhì)采食和消化的影響

2.2 噴漿玉米皮替代玉米粉對山羊甲烷和二氧化碳排放的影響

由表3可知，與玉米粉相比，噴漿玉米皮可以顯著降低山羊甲烷的每天排放量、采食每千克干物質(zhì)排放量和采食每千克可消化干物質(zhì)排放量(P<0.05)，對二氧化碳的每天排放量、采食每千克干物質(zhì)排放量和采食每千克可消化干物質(zhì)排放量無顯著影響(P>0.05)。

表3 噴漿玉米皮替代玉米粉對山羊甲烷和二氧化碳排放的影響

2.3 玉米皮替代玉米粉對山羊瘤胃溶解氣體和揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響

由表4可知，與玉米粉相比，噴漿玉米皮可以顯著增加山羊瘤胃pH、溶解態(tài)硫化氫和氨態(tài)氮濃度以及丙酸比例(P<0.05)，顯著降低溶解態(tài)氫、溶解態(tài)甲烷濃度和乙酸/丙酸以及氫的生成效率(P<0.05)。

表4 玉米皮替代玉米粉對山羊瘤胃溶解氣體和揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響

4Items Diets Corn flour Corn glutenSEMPP-value Propionate17.018.70.27<0.01 Butyrate11.509.460.292<0.01 Valerate1.431.670.052<0.01Isobutyrate1.561.710.0540.06 Isovalerate1.902.120.0760.04 Hydrogen generation efficiency1.391.330.009<0.01

2.4 玉米皮替代玉米粉對山羊瘤胃微生物數(shù)量的影響

由表5可知，與玉米粉相比，采食噴漿玉米皮可以顯著增加山羊瘤胃真菌數(shù)量(P<0.05)，顯著降低瘤胃嗜淀粉瘤胃球菌數(shù)量(P<0.05)，瘤胃原蟲數(shù)量呈現(xiàn)降低的變化趨勢(P=0.09)，對瘤胃細(xì)菌、甲烷菌、普氏菌屬、棲瘤胃普雷沃氏菌、反芻月星單胞菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量無顯著影響(P>0.05)。

表5 玉米皮替代玉米粉對山羊瘤胃微生物數(shù)量的影響

3 討 論

3.1 噴漿玉米皮替代玉米粉對山羊營養(yǎng)物質(zhì)采食和消化的影響

噴漿玉米皮是玉米籽實加工成玉米淀粉的副產(chǎn)物，往往含有較高含量的粗蛋白質(zhì)和纖維[20]，利用噴漿玉米皮替代玉米粉可以提高飼糧粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，但會降低飼糧淀粉含量。孫健[21]研究了玉米皮在瘤胃內(nèi)的降解特性及發(fā)酵參數(shù)，發(fā)現(xiàn)玉米皮在瘤胃中的降解速率較慢，并且飼喂過多的玉米皮會降低營養(yǎng)物質(zhì)降解率。同樣，舒維成[22]研究表明，飼糧干物質(zhì)降解率會隨著噴漿玉米皮比例的增加而線性降低。與纖維相比，淀粉是更容易消化的碳水化合物，不僅可以被瘤胃微生物降解，還可以被動物自身的消化酶進(jìn)行消化，而纖維往往只能被微生物分解，纖維中存在的木質(zhì)素會阻礙纖維素和半纖維素的降解[23]。因此，纖維的降解率往往低于淀粉，這也是本試驗中噴漿玉米皮顯著降低山羊干物質(zhì)和有機物消化率的主要原因。在本試驗中，噴漿玉米皮會提高了纖維消化率，降低了淀粉消化率，這可能是因為增加纖維攝入量會促進(jìn)纖維降解類微生物增殖，但不利于淀粉類降解微生物生長[24]。利用噴漿玉米皮替代玉米粉對大部分的瘤胃微生物數(shù)量沒有顯著影響，這可能與我們的替代比例較低有關(guān)，然而卻增加了山羊瘤胃真菌數(shù)量，減少了嗜淀粉瘤胃球菌數(shù)量，這可能是導(dǎo)致纖維和淀粉消化率變化的主要原因。

3.2 噴漿玉米皮替代玉米粉對山羊瘤胃發(fā)酵的影響

高淀粉飼糧往往有助于產(chǎn)生更高濃度的揮發(fā)性脂肪酸[24]，然而，本試驗發(fā)現(xiàn)山羊采食噴漿玉米皮并沒有顯著降低總揮發(fā)性脂肪酸濃度，這可能是因為瘤胃內(nèi)環(huán)境處于比較穩(wěn)定的狀態(tài)，當(dāng)揮發(fā)性脂肪酸生成較少時，瘤胃上皮對揮發(fā)性脂肪酸的吸收也會減少，從而導(dǎo)致2組之間沒有顯著差異。碳水化合物在瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸的過程中，往往伴隨著氫的產(chǎn)生，產(chǎn)生的氫會被瘤胃內(nèi)甲烷菌利用生成甲烷，從而維持瘤胃內(nèi)氫分壓處于較低水平，這有利于碳水化合物的降解[25]。碳水化合物類型會明顯影響瘤胃內(nèi)溶解態(tài)氫的濃度[26]，與淀粉相比，纖維的降解和發(fā)酵速率較低，這會導(dǎo)致瘤胃氫濃度處于較低水平[24]。除此之外，瘤胃內(nèi)溶解態(tài)氫濃度還會受到多種因素影響，如瘤胃內(nèi)飼料降解程度、瘤胃發(fā)酵模式、瘤胃內(nèi)氫的生成效率、甲烷菌對氫的利用程度等[27]。與淀粉相比，纖維發(fā)酵有利于乙酸生成，雖然乙酸生成過程中會產(chǎn)生氫，但是纖維發(fā)酵效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于淀粉[28]。在本試驗結(jié)果中，飼喂噴漿玉米皮飼糧的山羊瘤胃溶解態(tài)氫濃度顯著降低，這可能是由于淀粉攝入量降低所致，但是丙酸比例卻顯著升高，說明噴漿玉米皮改變了瘤胃發(fā)酵模式，這可能與噴漿玉米皮的加工處理有關(guān)。有研究表明，瘤胃厭氧真菌也存在氫化酶體，可以產(chǎn)生大量的氫[29]。而本試驗結(jié)果中，飼喂噴漿玉米皮飼糧的山羊瘤胃真菌數(shù)量和溶解氫濃度并不一致，這可能是與更多的氫參與代謝產(chǎn)物合成有關(guān)。此外，飼喂噴漿玉米皮飼糧的山羊瘤胃氨態(tài)氮濃度顯著增加，這可能是因為山羊攝入的蛋白質(zhì)被消化降解后，會代謝產(chǎn)生氨態(tài)氮[27]，從而導(dǎo)致瘤胃內(nèi)氨態(tài)氮濃度顯著升高。產(chǎn)生的氨態(tài)氮在微生物蛋白合成過程中也會涉及氫的生成與消耗過程，當(dāng)微生物利用氨基酸生長會產(chǎn)生氫，而微生物利用氨態(tài)氮生長會利用氫[30]。除此之外，蛋白質(zhì)在瘤胃降解過程中也會產(chǎn)生異丁酸、戊酸和異戊酸，這也與本試驗結(jié)果相一致。

3.3 噴漿玉米皮替代玉米粉對山羊瘤胃甲烷生成的影響

瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的氫主要是用于甲烷生成，飼喂噴漿玉米皮飼糧的山羊瘤胃內(nèi)溶解態(tài)甲烷濃度顯著降低，這與瘤胃內(nèi)溶解態(tài)氫濃度的降低相一致。以往研究也報道了瘤胃內(nèi)溶解態(tài)氫濃度與溶解態(tài)甲烷濃度呈正相關(guān)[24]。胃腸道甲烷排放受多種因素影響，如瘤胃內(nèi)溶解態(tài)甲烷的飽和系數(shù)、瘤胃發(fā)酵途徑和瘤胃內(nèi)食糜的流通速率[27]。與乙酸生成相比，丙酸生成過程中會牽涉到氫的消耗，因此會與甲烷菌競爭氫[31]。有研究報道，淀粉攝入量的增加會導(dǎo)致甲烷排放的減少，這可能是由于瘤胃發(fā)酵模式由乙酸型向丙酸型轉(zhuǎn)變，以及瘤胃食糜滯留時間的縮短造成[32-33]。但是，在本試驗結(jié)果中，飼喂噴漿玉米皮飼糧的山羊瘤胃丙酸比例升高，這也與甲烷排放降低相一致。

硫在瘤胃還原過程中可以作為氫池，根據(jù)熱力學(xué)動力平衡，硫在硫酸鹽還原菌的作用下被還原成硫化氫的過程比甲烷生成更有利[10, 34]。與玉米粉相比，噴漿玉米皮含有更多的硫，因此，噴漿玉米皮替代玉米粉會額外增加飼糧中的硫含量。Van Zijderveld等[35]報道，硫酸鹽可使綿羊的甲烷排放量減少16%。也有研究結(jié)果表明，玉米酒糟中同樣含有豐富的硫[36]，當(dāng)飼糧中適當(dāng)補充玉米酒糟時，育肥牛甲烷排放降低19.5%[37]。在本研究中，飼喂噴漿玉米皮飼糧的山羊甲烷每日排放量減少了19.5%，這與其他研究結(jié)果相一致。雖然飼糧中的硫可以有效地減少甲烷排放，但是根據(jù)NRC(2001)[38]推薦，飼糧中硫含量高于4.0 g/kg會增加腦脊髓灰質(zhì)軟化的風(fēng)險，這是由于瘤胃內(nèi)高濃度的硫化氫會通過瘤胃上皮被吸收。在本研究中，噴漿玉米皮飼糧中硫含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于安全劑量，雖然飼糧中硫含量的升高使瘤胃液中溶解態(tài)硫化氫濃度顯著升高，但在我們的飼養(yǎng)過程中未觀察到山羊代謝紊亂的臨床現(xiàn)象。

4 結(jié) 論

① 噴漿玉米皮替代玉米粉可以促進(jìn)瘤胃真菌的增殖，這有助于提高飼糧纖維降解率；但會抑制嗜淀粉瘤胃球菌增殖，這不利于提高飼糧淀粉降解率。

② 噴漿玉米皮替代玉米粉后，飼糧中硫含量的增加有助于瘤胃內(nèi)的氫參與硫化氫合成以及瘤胃發(fā)酵模式向丙酸型轉(zhuǎn)變，這會降低山羊甲烷排放。